Como o Cistanche echinacoside aumenta o andrógeno através das células endoteliais?

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrato.

Echinacoside (ECH) é um composto natural com efeito vasodilatador endotélio-dependente. O óxido nítrico (NO) é um importante vasorrelaxante liberado pelas células endoteliais. A fim de examinar o mecanismo molecular da produção de NO induzida por ECH em células endoteliais, o presente estudo investigou o envolvimento do receptor androgênico (AR) e da via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/proteína quinase B (Akt) em a fosforilação da sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Usando a sonda fluorescente DAF-FM, a produção de NO foi significativamente aumentada, e a eNOS foi fosforilada em Ser1177 de maneira dependente da concentração sob tratamento com 0.01-10 µM ECH em HUVECs. Além disso, a produção de NO e a fosforilação de eNOS induzida por ECH foi diminuída quando pré-tratado com o antagonista de AR nilutamida, ou quando transfectado com pequenos RNAs interferentes AR. Além disso, a fosforilação induzida por ECH da Akt em Ser473 foi revogada por 5 µM de wortmanina (um inibidor de PI3K). Esses dados indicaram que a ECH estimulou a produção de NO via ativação dependente de AR de eNOS em HUVECs e que a via PI3K/Akt pode estar envolvida na fosforilação de eNOS induzida por ECH.

Cistanche deserticola tem muitos efeitos, clique aqui para saber mais

Introdução

Cistanche Hoffman. Et Link é uma erva parasita perene de um gênero da família Orobanchaceae. ErvaCistanche, o tronco deCistanche deserticolaYC MA eCistanche tubulosa(Schen). Cistanche é uma erva tônica que foi usada para tratardeficiência renal, impotência, leucorréia mórbida e constipação senil (1), o que pode ser devido ao seu efeito regulador do tipo androgênico ou do hormônio sexual (2). Echinacoside (ECH; C35H46O20; peso molecular, 786,73; Fig. 1), é um dos glicosídeos feniletanoides (PhGs) isolados das hastes de HerbaCistanchee exibe múltiplas propriedades biológicas, incluindo efeitos antioxidantes, antienvelhecimento, anti-inflamatórios, hepatoprotetores e neuroprotetores (3). Investigações farmacológicas modernas demonstraram que vários constituintes de HerbaCistanche, incluindo ECH,acteósido, kankanose, lado F de Lankan, ecistanosideF, exibem atividade vasorrelaxante (4).

O endotélio é um regulador crítico da vasculatura, e o óxido nítrico (NO) é um importante fator relaxante liberado porcélulas endoteliais.Ao se difundir nas células musculares lisas, o NO ativa a guanilato ciclase, aumenta os níveis de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) e, em seguida, ativa as proteínas quinases dependentes de cGMP (PKGs) para promover o relaxamento do músculo liso (5). Foi demonstrado anteriormente que a ECH em 350-400 µM atua diretamente no músculo liso vascular e inibe a proliferação induzida por hipóxia em células musculares lisas da artéria pulmonar de rato (6), enquanto que 30-300 µM ECH causou vasorelaxamento agudo no endotélio- anéis intactos de forma dependente da concentração, e aumento da produção de cGMP no músculo liso do corpo cavernoso dos anéis aórticos contraídos pela fenilefrina (7). Ao abrir os canais NO-cGMP-PKG-BKCa nas células do músculo liso, 100 ou 300 µM de ECH suprimiu a contração induzida por noradrenalina nas artérias pulmonares de ratos, particularmente em anéis sem endotélio (8).Células endoteliaissão reguladores-chave da função cardiovascular e, em vários casos, verificou-se que o relaxamento dependente do endotélio era devido a uma substância transferível, como o NO, liberada do endotélio (9). No entanto, o mecanismo molecular a montante da produção de NO induzida por ECH em vasoscélulas endoteliaisrequer mais investigação. No endotélio vascular, a geração de NO é mediada principalmente pela NO sintase endotelial (eNOS). Vários grupos demonstraram que a via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) ativa a proteína serina-treonina quinase B (Akt), que causa fosforilação direta da eNOS na serina 1177 (Ser1177) (10). O receptor de andrógeno (AR) é um membro da subfamília de receptores nucleares s3, que modifica canonicamente a expressão gênica. A localização do AR nas cavéolas da membrana celular está envolvida na regulação não genômica da função das células endoteliais ou na expressão gênica, desencadeando a cascata c-Src/PI3K/Akt, que resulta em fosforilação de eNOS e produção de NO (11). Na aorta humanacélulas endoteliais, foi relatado que a testosterona ativa a sinalização PI3K/Akt e induz rapidamente a produção de NO devido à interação direta de AR e a subunidade p85 de PI3K no sistema cardiovascular (12). Foi relatado que a ECH agrava os sintomas relacionados à deficiência hormonal e exerce seus efeitos semelhantes aos andrógenos devido à ligação competitiva ao AR em vez da testosterona (2). Portanto, o presente estudo levantou a hipótese de que a via PI3K/Akt pode estar envolvida na produção de NO através da fosforilação de eNOS dependente de AR induzida por ECH. O objetivo do presente estudo foi avaliar os seguintes efeitos da ECH: i) Indução da produção de NO e fosforilação da eNOS; ii) envolvimento do AR na fosforilação da eNOS e iii) ativação da via PI3K/Akt em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), um modelo experimental bem conhecido para estudar a regulação das funções das células endoteliais e angiogênese (13).

Materiais e métodos

Produtos químicos e reagentes. ECH (pureza, 92,5 por cento) foi obtido dos Padrões Nacionais de Referência de Medicamentos do Instituto Nacional de Controle de Alimentos e Medicamentos. Anticorpos contra p-Akt (Ser473; cat. n. ab8805), Akt (cat. n. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. n. ab184154) e eNOS (cat. n. ab76198) foram adquiridos da Abcam . Os inibidores de nilutamida e ICI 182780 foram obtidos de Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME foi adquirido de Adamas-Beta, Ltd., e wortmannin foi adquirido de Pribolab.

Cultura celular e tratamento medicamentoso.

HUVECs foram obtidos de ScienCell Research Laboratories Inc. e cultivados emcélula endotelialmeio (ECM; ScienCell Research Laboratories) com 5 por cento (v/v) de soro fetal bovino (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) e 1 por cento de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS) a 37˚C (5 por cento de CO2 e 95 por cento de umidade) (14). Ao atingir a confluência, as células foram digeridas com tripsina e plaqueadas em ECM com 1% de FBS e 1% de ECGS. Para todos os experimentos, as HUVECs foram plaqueadas em uma concentração de 1x104/ml e cultivadas até atingir a confluência. Antes do tratamento com ECH ou outros estimuladores, as células foram incubadas em ECM sem vermelho de fenol sem FBS e ECGs por 6 h para induzir a parada do crescimento. Nos experimentos inibitórios, as HUVECs foram pré-incubadas com vários antagonistas ou inibidores, incluindo 10 nilutamida 10 µM, ICI 182780 10 µM, L-NAME 0,5 mM ou wortmanina 5 µM, por 30 min, com ou sem ECH, a 37°C. Em todos os grupos, incluindo o controle, o DMSO foi usado como solvente em concentrações iguais de 0,001%.

Medição da produção intracelular de NO.

Alterações relativas na concentração de NO citosólico em HUVECs foram monitoradas usando a sonda fluorescente de NO DAF-FM (Cayman Chemical Company), conforme relatado anteriormente (12). Resumidamente, as células foram carregadas com 5 µM de DAF-FM diacetato por 20 min a 37°C em uma placa de microtitulação preta e lavadas várias vezes com PBS (pH 7,4). A fluorescência foi determinada em comprimentos de onda de excitação e emissão de 495 e 515 nm, respectivamente, usando um leitor de microplacas fluorescente (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) e um microscópio invertido compacto (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Análise de Western blot.

Conforme relatado anteriormente (15), monocamadas confluentes de células foram lavadas duas vezes em PBS gelado e lisadas com tampão RIPA (P0013D; Beyotime Institute of Biotechnology). A concentração de proteína no sobrenadante foi medida usando o método de ensaio do ácido bicinconínico (16). Subsequentemente, 30 µg de proteína foram carregados por pista, separados usando 10 por cento de géis de poliacrilamida e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado por 1 h a 25°C. Após incubação com anticorpos monoclonais contra Akt (1:1,{11}} diluição), p-Akt (1:500 diluição), eNOS (1:2,{17}} diluição) ou p-eNOS (1 :1,000 diluição) a 4˚C durante a noite, as membranas foram lavadas com TBST (contendo 0,1 por cento de Tween-20) 4 vezes por ~15 min por lavagem a 25˚C. Subsequentemente, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (1:5,{32}} diluição; anticorpo anti-camundongo, cat. nº A0216, ou anticorpo anti-coelho, cat. nº A0208, Beyotime Institute of Biotechnology) por 1 h a 25˚C e detectado usando um kit de quimioluminescência aprimorado (cat. n.º 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). As intensidades das bandas foram quantificadas usando o software de análise de gel Image J, versão 1.8.0_112 (National Institutes of Health).

Preparação e transfecção de ARN de interferência pequena (si).

Os RNAs de fita dupla longos foram sintetizados pelo mRNA alvo do AR e do receptor de estrogênio (ER) com as sequências mostradas na Tabela I. As condições para o knockdown do siRNA envolveram a transfecção de HUVECs a 70 por cento de confluência mantida em não antimicrobianos meio de cultura em placas de cultura de 60 mm revestidas com colágeno. A transfecção de AR-siRNA 5 nM ou ER-siRNA 10 nM com reagente Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) foi realizada separadamente, de acordo com os protocolos do fabricante. A eficiência da transfecção foi avaliada por análise quantitativa-PCR de transcrição reversa (RT-qPCR), conforme relatado anteriormente (17). As condições de termociclagem foram as seguintes: 10 min a 95°C; 40 ciclos de 95°C por 5 seg e 60°C por 1 min, e uma curva de fusão a 95°C por 15 seg, 60°C por 1 min e 95°C por 15 seg; três réplicas biológicas independentes foram realizadas para cada amostra. Os experimentos subsequentes foram conduzidos 48 h após a transfecção. Os pares de primers foram projetados usando o software Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) com as seguintes sequências: AR direto, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' e reverso, 5'-GACTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER direto, 5'-CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' e reverso, 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA-3'; e GAPDH direto, 5'‑CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' e reverso, 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

Análise estatística.

Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. As comparações estatísticas entre os grupos foram realizadas pelo teste de Kruskal-Wallis ou ANOVA de duas vias com teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados

A ECH induz a produção de NO e a fosforilação da eNOS.

Conforme mostrado na Fig. 2A e B, 1 µM de ECH aumentou significativamente a produção de NO intracelular em HUVECs em comparação com as células de controle negativo, enquanto o efeito estimulador de ECH foi atenuado para o nível de controle pelo pré-tratamento com L-NAME. Para obter a concentração ideal, a fosforilação de eNOS foi testada em 60 min após o tratamento com ECH em concentrações de 0, 0.01, 0). 1, 1 e 10 µM. Os resultados revelaram que a ECH em concentrações de 0,01-10 µM pode induzir significativamente a fosforilação de eNOS em Ser 1177 de maneira dependente da concentração, com a fosforilação máxima de eNOS observada em 10 µM de indução de ECH (Fig. 2C e D). Além disso, a fosforilação de eNOS em Ser1177 foi examinada por análise de Western blot em 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min após incubação com 1 µM de ECH. Observou-se que a fosforilação da eNOS foi rapidamente desencadeada pela ECH em 5 min, e continuou a aumentar até 30 min de incubação (Fig. 2E e F). Subsequentemente, apesar do tratamento com ECH, a magnitude relativa da fosforilação da eNOS permaneceu estável a partir de 30 min; portanto, a ECH não afetou a expressão total da eNOS (Fig. 2C e E).

AR medeia a produção de NO induzida por ECH e a fosforilação de eNOS.

O ensaio RT-qPCR demonstrou que os efeitos interferentes de AR-siRNA-1 e ER-siRNA-2 foram os mais bem sucedidos na inibição da expressão de AR e ER em HUVECs no presente estudo (Fig. 3 ). Subsequentemente, um antagonista para análise de inibição de função de AR e siRNA para análise de perda de função de AR foi aplicado para avaliar o envolvimento de AR na ativação de eNOS induzida por ECH e produção de NO. Conforme mostrado na Fig. 4A, 1 µM de ECH aumentou significativamente a produção de NO em HUVECs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

A ECH ativa a via PI3K/Akt.

No presente estudo, a fosforilação de Akt em Ser473 foi testada 60 min após a incubação de ECH em concentrações de 0, 0.01, 0.1 , 1 e 10 µM. Os resultados indicaram que ECH (0.{10}} µM) pode induzir significativamente a fosforilação de Akt. Os níveis de expressão relativa de p-Akt atingiram o pico em 1 e 10 µM de tratamento com ECH (Fig. 5A e B). Além disso, a fosforilação de Akt foi examinada por análise de Western blot a 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min após a adição de 1 µM de ECH às culturas HUVEC. Conforme mostrado na Fig. 5C e D, ECH aumentou rapidamente a fosforilação de Akt após 5 min de incubação, e o nível máximo de proteína de p-Akt foi observado em 60 min. Em contraste, ECH não afetou a expressão total de Akt (Fig. 5A e C). Além disso, para investigar o efeito potencial da via PI3K na fosforilação de eNOS, HUVECs foram pré-tratados com o inibidor de PI3K wortmanin antes da aplicação de ECH. Verificou-se que a Wortmannina reduz a produção de NO induzida por ECH aos níveis basais (Fig. 5E). Um fenômeno semelhante foi observado usando microscopia de fluorescência ao examinar a fluorescência DAF-FM induzida por ECH (Fig. 5F). Além disso, a wortmanina pode ter a capacidade de abolir a fosforilação rápida da eNOS em HUVECs (Fig. 5G e H). Os resultados acima mencionados sugerem que a ECH pode ativar a fosforilação de eNOS e a produção de NO através da via PI3K/Akt.

Discussão

ECH é um composto natural isolado de HerbaCistanche, com várias propriedades farmacológicas. Foi previamente demonstrado que a ECH exerceu um efeito de relaxamento vascular dependente do endotélio pela abertura dos canais NO-cGMP-PKG-BKCa nas células musculares lisas dos vasos sanguíneos (7,8). Os achados atuais fornecem evidências de que a ECH exerceu ativação de eNOS dependente de AR para induzir a produção de NO com o envolvimento da via de sinalização PI3K/Akt em vasoscélulas endoteliais.

Como a camada mais interna da parede do vaso, o endotélio pode detectar e responder rapidamente às mudanças no fluxo sanguíneo, resultando em transmissão de sinal para as células musculares lisas subjacentes para regular o tônus ​​vascular (18). Tem sido amplamente relatado que existem múltiplos compostos vasodilatadores derivados do endotélio, com a substância mais prototípica

sendo NO, formado a partir da isoforma endotelial da eNOS, que resulta em fosforilação (19). Em condições normais, a eNOS permanece inativa quando ligada à caveolina e é ativada com a seguinte sucessão de eventos emcélulas endoteliais: i) eNOS se dissocia da caveolina-1 e se associa com Ca2 mais /CaM; ii) a proteína de choque térmico (HSP)90 promove a eNOS.

Além disso, um número crescente de estudos tem demonstrado que o AR é expresso emcélulas endoteliaisem vários tecidos humanos, o que sugere um papel potencial para andrógenos e seus análogos, que atuam através de processos mediados por AR, na modulação da homeostase das células endoteliais humanas (21). Na via PI3K/Akt não clássica, AR pode ativar PI3K interagindo diretamente com a subunidade reguladora PI3K p85 (22). O presente estudo demonstrou que um antagonista de AR ou siRNA de AR diminuiu a produção de NO e a fosforilação de eNOS induzida por ECH em HUVECs. Foi relatado anteriormente que os estrogênios induzem a fosforilação da eNOS e estimulam a produção de NO através da ativação clássica do RE em células endoteliais (23), e a administração de ECH aumenta significativamente a expressão do RE no útero (24). No entanto, no presente estudo, o efeito do AR foi mais proeminente em comparação com o do ER na ativação da eNOS induzida pela ECH e na produção de NO. Além disso, observou-se que a ECH causou produção aguda de NO em poucos minutos via ativação de eNOS envolvida por AR em HUVECs, o que é consistente com a natureza não genômica da resposta em células endoteliais. O AR está associado a proteínas de andaime, incluindo HSP90, HSP70 e quinase Src, no citoplasma, e pode ser transportado para a membrana do complexo AR dentro de 5 minutos de tratamento com testosterona (23). Com base na estratégia de 'pesca de alvo', HSP90 foi identificado como alvo acoplado a PhGs, o que indicou que ECH pode facilitar a dissociação de AR das proteínas de andaime (25). Outro estudo sugeriu que, no hipotálamo, a ECH pode se combinar com a bolsa AR nos aminoácidos Met-894 e Val-713 e inibir o transporte de AR citoplasmático para o núcleo (26). No entanto, o mecanismo subjacente através do qual a ECH medeia a translocação do AR citoplasmático para a membrana requer mais investigação. Portanto, mais pesquisas são necessárias para elucidar o mecanismo pelo qual a ECH atinge a ativação da eNOS dependente de AR e como ela pode estar associada à ligação à HSP90 em células endoteliais vasculares.

A via PI3K/Akt é uma das mais importantes cascatas de sinalização, cuja ativação é induzida pela produção de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato para se ligar ao domínio de homologia da pleckstrina N-terminal da Ser/ Thr quinase Akt. Isso facilita o recrutamento de Akt para a membrana plasmática (27). A via PI3K/Akt pode desempenhar um papel importante no controle do relaxamento dependente de NO induzido por ECH. O presente estudo revelou que a produção de NO induzida por ECH foi significativamente reduzida quando as células foram incubadas com o inibidor de PI3K wortmannin. Um relatório anterior demonstrou que 15 mg/kg de ECH ativou a via de sinalização PI3K/Akt em células de medula óssea suprimidas com 5-fluorouracil (28). No presente estudo, os inibidores de PI3K diminuíram significativamente a fosforilação de eNOS induzida por ECH em Ser1177. Além disso, a atividade de Akt foi predominantemente regulada por vias regulatórias a montante, particularmente a fosforilação dependente de PI3K em Ser473 (20). No presente estudo, a ECH induziu a fosforilação de Akt em Ser473 de maneira dose-dependente; da mesma forma, um estudo anterior demonstrou que 5, 10 ou 20 µM de ECH exerceu um efeito cardioprotetor contra o tratamento de anóxia/reperfusão de maneira dose-dependente, potencialmente regulando positivamente p-Akt e SLC8A3 (29). A regulação transcricional do gene Akt permanece amplamente desconhecida (30); portanto, o presente estudo se concentrou nos efeitos regulatórios pós-transcricionais da ECH na Akt. Levando em consideração os achados mencionados, inferiu-se que a aplicação de ECH em HUVECs pode levar à ativação da via PI3K/Akt, que fosforila a eNOS e, posteriormente, aumenta a produção de NO.

Em conclusão, a ECH é um produto natural que é isolado principalmente deHerba Cistanche. O mecanismo potencial subjacente à produção de NO induzida por ECH emcélulas endoteliaispode incluir o seguinte (Fig. 6): i) ECH atua como um ligante funcional de AR que está localizado nas cavéolas na membrana celular; ii) PI3K se liga ao domínio hidrofóbico de Akt em Ser473 e facilita o recrutamento de Akt para a membrana celular; iii) o recrutamento das cascatas PI3K/Akt desencadeia a fosforilação de eNOS dependente de AR, e iv) a geração de NO é mediada por eNOS emcélulas endoteliais. A observação de que a ECH induz a produção de NO através da fosforilação da eNOS dependente de AR com o envolvimento da via PI3K/Akt pode contribuir para uma maior compreensão dos efeitos vasorrelaxantes da ECH. Além disso, a ECH direcionada às vias do NO derivado do endotélio pode ser devido a efeitos não genômicos. Portanto, o presente estudo pode ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais a ECH exerce seus efeitos farmacológicos para prevenir doenças cardiovasculares.

Autor:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU e XIN LIU

Centro de Pesquisa em Engenharia de Alimentos e Saúde do Ministério da Educação do Estado, Escola de Ciências da Vida,

Universidade Sun Yat-sen, Guangzhou, Guangdong 510275, República Popular da China

Recebido em 1º de maio de 2019; Aceito em 10 de dezembro de 2019

Referências

1. Comissão de Farmacopeia Chinesa:Cistanche Herba. In: Farmacopeia da República Popular da China 1. queixo. Med. Sci. Press, Pequim, pp 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X e Zhang X:EchinacosideeCistanche tubulosa(Schenk) R. wight melhora o dano testicular e espermático induzido por bisfenol A em ratos através de enzimas esteroidogênicas reguladas pelo eixo das gônadas. J Etnofarmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B e Ma X:Echinacoside, um produto natural inestimável no tratamento de distúrbios neurológicos e outros. Moléculas 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S e Muraoka O: Aminoglicosídeos feniletânicos e oligoaçúcares acilados com atividade vasorrelaxante deCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S e Murad F: O óxido nítrico ativa a guanilato ciclase e aumenta os níveis de monofosfato cíclico de guanosina 3':5' em várias preparações de tecidos. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wren TN, Lu dX, Zhou Y e Ge RL: Efeito antiproliferativo deechinacosideem células do músculo liso da artéria pulmonar de rato sob hipóxia. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ e Tu PF:Echinacosideprovoca relaxamento dependente do endotélio em anéis aórticos de ratos através de uma via NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y e Ge RL:Echinacosideinduz vasorelaxamento da artéria pulmonar de rato abrindo os canais NO-cGMP-PKG-BKca e reduzindo a ca intracelular^{2 mais}níveis. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y e Higashi Y: Avaliação da vasodilatação independente do endotélio: Da metodologia às perspectivas clínicas. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J e ding Q: Os efeitos protetores de um novo derivado de elemento sintético na veia umbilical humanacélulas endoteliaiscontra a lesão induzida pelo estresse oxidativo: Envolvimento das vias de sinalização de antioxidação e PI3k/Akt/eNOS/NO. Farmacêutico Biomédico 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y e Okabe T: ativação não genômica dependente do receptor de andrógeno mediado pela quinase Src da cascata de sinalização levando à sintase endotelial do óxido nítrico . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y e Okabe T: ativação dependente do receptor de andrógeno da sintase endotelial de óxido nítrico em vasoscélulas endoteliais: Papel da via fosfatidilinositol 3-quinase/Akt. Endocrinologia 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F e Reno F: proliferação NO-dependente e migração induzida por vitamina d em HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X e Xu X: A superexpressão da proteína de desacoplamento 2 inibe a apoptose induzida por glicose alta da veia umbilical humanacélulas endoteliais. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z e Bing S: Icariin retarda a indução de homocisteínacelular endotelialsenescência envolvendo ativação da via de sinalização PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ e Klenk dc: Medição de proteína usando ácido bicinconínico. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H e Liu X: Biossíntese de triterpenóides e a resposta transcricional induzida por óxido nítrico em fermentação submersa de Ganoderma lucidum.Processo Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY e Gutterman dd: Hiperpolarização derivada do endotélio e vasodilatação coronária: papéis diversos e integrados dos ácidos epoxieicosatrienóicos, peróxido de hidrogênio e junções comunicantes. Microcirculação 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK e Gutterman dd: a comunicação é a chave: Mecanismos de sinalização intercelular na vasodilatação. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, De B e debate R: Detecção do microambiente do endotélio levando à vasodilatação mediada por óxido nítrico: Uma revisão dos sinais nervosos e biomecânicos. Óxido Nítrico 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS e Smith GJ: Receptor de andrógeno em humanoscélulas endoteliais. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H e Gui YT: A ação não genômica dos androgênios é mediada pela rápida fosforilação e regulação do tráfico de receptores androgênicos. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP e Ghedini Pc: Ativação da via PI3K/Akt mediada por receptores de estrogênio responde por estrona- ativação vascular induzida da sinalização de cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z e Li P: atividade antiosteoporótica deechinacosideem ratas ovariectomizadas. Fitomedicina 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y e Tu PF: Identificação de alvos farmacológicos e análise de eficácia de glicosídeos feniletanoides deCistanchesHerba baseada na estratégia de 'pesca ao alvo'. chin Tradit Herbal Drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM e Zhang X:Echinacosideaumenta a quantidade de espermatozóides em ratos, visando o receptor de andrógeno hipotalâmico. Representante Científico 8: 3839-3850, 2018.

27. Coffer PJ, Jin J e Woodgett JR: Proteína quinase B (c-Akt): Um mediador multifuncional da ativação de fosfatidilinositol 3-quinase. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y e Qian J:Echinacosidemelhora a função hematopoiética em camundongos com mielossupressão induzida por 5-FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W e Zhou H: Efeitos protetores deEchinacosidecontra a lesão de anoxia/reperfusão em células H9c2 via regulação positiva de p-AKT e SLc8A3. Farmacêutico Biomédico 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P e Su Y: O papel crítico de Akt na função cardiovascular. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.