A dissecção das respostas de anticorpos de indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac sugere envolvimento de epítopos fora do RBD na neutralização do SARS-CoV-2
Oct 16, 2023
Abstrato: Milhões de pessoas foram vacinadas com Gam-COVID-Vac, mas as especificidades dos anticorpos induzidos não foram totalmente estudadas. Plasma de 12 indivíduos virgens de tratamento e 10 indivíduos convalescentes com doença por coronavírus 2019 (COVID-19) foi obtido antes e depois de duas imunizações com Gam-COVID-Vac. A reatividade do anticorpo nas amostras de plasma (n=44) foi estudada em um painel de proteínas recombinantes microarranjadas dobradas e desdobradas do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV -2) e 46 peptídeos abrangendo o pico proteína (S) e por ensaio imunoenzimático (ELISA) da subclasse de imunoglobulina G (IgG). A capacidade dos anticorpos induzidos por Gam-COVID-Vac de inibir a ligação do domínio de ligação ao receptor (RBD) ao seu receptor enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) foi investigada em um ensaio de interação molecular (MIA). A capacidade de neutralização de vírus dos anticorpos foi estudada pelo teste de neutralização de vírus pseudotipado (pVNT) para Wuhan-Hu-1 e Omicron. Descobrimos que a vacinação Gam-COVID-Vac induziu aumentos significativos de IgG1, mas não de outras subclasses de IgG contra S dobrado, subunidade 1 da proteína spike (S1), subunidade 2 da proteína spike (S2) e RBD de maneira comparável em indivíduos virgens e convalescentes assuntos. A neutralização do vírus foi altamente correlacionada com anticorpos induzidos por vacinação específicos para RBD dobrado e um novo peptídeo (isto é, peptídeo 12). O peptídeo 12 estava localizado próximo ao RBD na parte N-terminal de S1 e pode estar potencialmente envolvido na transição da conformação pré para pós-fusão da proteína spike. Em resumo, a vacinação Gam-COVID-Vac induziu anticorpos IgG1 específicos para S em indivíduos virgens de tratamento e convalescentes de maneira comparável. Além dos anticorpos específicos para RBD, os anticorpos induzidos contra um peptídeo próximo ao terminal N do RBD também foram associados à neutralização do vírus.
Palavras-chave: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; epítopo; anticorpo; neutralização de vírus; ensaio de interação molecular; Ómicron
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1. Introdução
Após os primeiros casos de infecção pelo Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) no final de 2019 em Wuhan, China, a nova doença por coronavírus (COVID-19) se espalhou rapidamente por todo o mundo o mundo e se transformou em uma pandemia global [1–4]. O rápido desenvolvimento de vacinas-19 contra a COVID e a introdução de programas globais de vacinação, juntamente com o aparecimento de variantes menos patogênicas do SARS-CoV-2, são considerados fatores significativos para a redução das mortes-19-associadas à COVID e a gravidade da pandemia [1,5]. As primeiras vacinas disponibilizadas foram vacinas genéticas baseadas na transferência mediada por adenovírus do gene que codifica a proteína de superfície S do SARS-CoV-2 [6–8]. A proteína SARS-CoV-2 S consiste na subunidade S1 contendo o domínio de ligação ao receptor (RBD) que se liga ao seu receptor ACE2 nas células humanas e a subunidade S2 que garante a ligação do vírus à membrana da célula hospedeira por clivagem proteolítica do peptídeo de fusão (FP) durante a infecção pelo vírus [9]. O gene S utilizado para transferência genética em certas vacinas baseadas em adenovírus (por exemplo, COVID-19 Vaccine Janssen) pode ser modificado para estabilizar a proteína e influenciar a sua clivagem, mas este não é o caso das outras [10]. Células humanas infectadas por adenovírus contendo o gene que codifica S produzem uma quantidade variável do antígeno S que é liberado e apresentado pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II às células T, resultando em células T CD4+ ajuda para a produção de anticorpos específicos para S. A proteína S expressa pelas células transfectadas também é apresentada pelo MHC classe I na superfície da célula infectada e desencadeia a ativação de células T CD 8+ citotóxicas específicas do S, que podem reconhecer células produtoras de antígeno S e destruí-las. O princípio da vacinação, ou seja, a introdução da informação genética que codifica S nas células hospedeiras e a subsequente produção do antigénio S pelas células infectadas, é semelhante às vacinas de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA), embora a tecnologia de transferência genética seja diferente da do adenovírus. vacinas baseadas em. Assim, as “vacinas genéticas” imitam, até certo ponto, uma infecção natural por SARS-CoV-2. A identificação de epítopos reconhecidos por anticorpos de indivíduos vacinados envolvidos na neutralização do vírus é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de ação das vacinas existentes, mas também para o desenvolvimento de estratégias refinadas de vacinação ativa e imunização passiva contra COVID-19 [11 ,12]. A maioria das vacinas atuais concentra-se na obtenção de uma resposta de anticorpos específicos para S, com atenção especial à resposta de anticorpos específicos para RBD, porque foi observado que os anticorpos específicos para RBD estão correlacionados com alta atividade neutralizante contra SARS-CoV-2 [ 13–15]. No entanto, o número de mutações adquiridas por cada nova variante de preocupação (VOC) indica a importância de identificar epítopos conservados entre VOCs alvo de anticorpos neutralizantes que estão localizados não apenas no RBD, mas também fora do RBD [16]. Na verdade, existem estudos que indicam a presença de epítopos neutralizantes fora do RBD, que são reconhecidos pelos anticorpos após a imunização [17–20]. Em 2020, a vacina baseada em vetor Gam-COVID-Vac, também denominada Sputnik-V, tornou-se disponível para uso na prática clínica e atualmente foi aprovada para uso em mais de 70 países (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (acessado em 17 de janeiro de 2023)). De acordo com o recurso Our World In Data (OWID), 79 milhões de pessoas na Rússia receberam pelo menos uma dose da vacina e 72 milhões estão totalmente vacinadas (https://ourworldindata.org/covid-vaccinations?country= RUS (acessado em 22 de março de 2022)). Gam-COVID-Vac consiste em dois tipos de vacina, que são baseados em dois vetores diferentes de adenovírus humano (hAd26 e hAd5) que transportam a forma nativa da proteína S da cepa Wuhan-Hu-1 SARS-CoV{{ 73}}. A Sputnik-V compreende duas injeções, uma com hAd26 e uma segunda com hAd5 e Sputnik light, apenas com hAd26. Os dois vectores de adenovírus diferentes são utilizados para a primeira e segunda imunizações para reduzir a possibilidade de os indivíduos vacinados produzirem imunidade à proteína S contra o adenovírus. De facto, os anticorpos específicos para adenovírus limitariam a eficácia das vacinações de reforço através da neutralização do veículo vector de adenovírus. Portanto, no 21º dia após a administração da primeira dose de uma vacina com rAd26, é realizada a entrega repetida do antígeno com o vetor rAd5 [8,21]. Poucos estudos investigaram de forma apreciável as respostas de anticorpos específicos para S e RBD e a atividade de neutralização do vírus em soros de vacinados Gam-COVID-Vac [10,22,23]. Foram relatados aumentos de anticorpos IgG específicos para RBD três meses após a administração de Gam-COVID-Vac e foi demonstrado que os anticorpos apresentam reação cruzada com variantes preocupantes Alfa, Beta, Delta e Omicron [24–26]. A Gam-COVID-Vac também foi comparada com diversas outras vacinas licenciadas contra SARS-CoV-2, que mostraram alta neutralização do vírus e alta eficácia contra a mortalidade relacionada à COVID-19-para Sputnik-V, embora leve inferioridade a algumas vacinas de mRNA em relação à neutralização do vírus [24]. Finalmente, foi demonstrado que a imunização de pacientes positivos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV+) tratados com terapia antirretroviral (tratados com TARV) com Gam-COVID-Vac mostra eficácia epidemiológica contra o tipo selvagem original e a variante Delta do SARS-CoV{{ 113}} [27]. No entanto, até o momento, nenhuma análise detalhada do reconhecimento de epítopos por anticorpos em indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac foi realizada e são necessários dados para compreender o isotipo de imunoglobulina e as respostas da subclasse IgG em indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac. Aqui investigamos dois grupos de indivíduos que foram vacinados com Gam-COVID-Vac, um que teve uma infecção anterior por SARS-CoV-2 e outro grupo de indivíduos sem experiência com SARS-CoV-2. Realizamos uma análise meticulosa da especificidade do epítopo de anticorpos induzidos usando proteínas e peptídeos dobrados e desdobrados derivados de SARS-CoV microarranjados, abrangendo a proteína S completa, incluindo RBD. Além disso, foram analisadas as respostas da subclasse IgG. Nosso estudo revela que indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac montam anticorpos específicos para RBD capazes de bloquear a interação RBD-ACE2. Curiosamente, descobrimos que a neutralização do vírus também estava associada a anticorpos direcionados contra um peptídeo fora do RBD, que pode estar envolvido na transição da conformação preto-pós-fusão da proteína spike.
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2. Resultados
2.1. Indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac incluem indivíduos ingênuos e convalescentes de COVID-19
Indivíduos convalescentes foram infectados pela cepa Wuhan-Hu-1 de acordo com sua prevalência e dados de sequenciamento obtidos no momento da infecção na região de Moscou. Indivíduos virgens de tratamento não apresentavam sintomas de COVID-19 e não tinham anticorpos específicos contra SARS-CoV-2-no momento do recrutamento. Os sujeitos do estudo incluíram 15 mulheres e 7 homens com idade média de 60 anos (ou seja, 25 a 70 anos) (Tabela 1).
Tabela 1. Características demográficas, clínicas e sorológicas dos indivíduos.
Uma amostra de plasma foi obtida de cada um dos indivíduos no momento 0 (ou seja, linha de base) (Figura 1A), então cada indivíduo foi vacinado com Sputnik-V com um intervalo de aproximadamente 21 dias entre o primeiro e o segundo injeção (pontos de tempo 1 e 2). No momento 3, uma segunda amostra de plasma foi coletada para determinar as respostas de anticorpos induzidas pela vacina (Figura 1A). Os indivíduos foram observados por mais 120 dias. No dia 110 após a vacinação final, um sujeito (isto é, sujeito 22) teve COVID-19 enquanto os outros não desenvolveram nenhum sintoma de COVID-19 (Tabela 1).
Figura 1. Desenho do estudo e respostas de anticorpos específicos-2-de SARS-CoV antes e depois da vacinação com Sputnik-V. (A) Desenho do estudo. Amostras de plasma foram obtidas de indivíduos virgens de COVID-19- (n=12) e convalescentes (n=10) no momento 0 (linha de base), depois os indivíduos receberam dois Sputnik-V vacinações nos momentos 1 e 2, respectivamente, e uma amostra de plasma foi obtida no momento 3 (ou seja, dia 80–85 após a primeira vacinação). (B) Níveis de anticorpos IgG específicos do nucleocapsídeo (eixo y: ISU) em indivíduos virgens de tratamento e convalescentes (eixo x) no início do estudo. A linha horizontal indica o ponto de corte para positividade. (C) Níveis de anticorpos IgG (eixos y: ISU) específicos para RBD, S, S1 e S2 em indivíduos no momento 0 e 3 (eixos x). (D) Da esquerda para a direita, níveis de anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (eixos y: valores de densidade óptica OD) para S (parte superior) e RBD (parte inferior) nos pontos de tempo 0 e 3 ( eixos x). São indicadas diferenças significativas entre os grupos, conforme determinado pelo teste de Wilcoxon: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns – não significativo.
2.2. A vacinação Gam-COVID-Vac induz amplas respostas de IgG a S, incluindo S1, RBD e S2
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Realizamos uma análise detalhada das respostas de anticorpos em relação a um grande painel de proteínas e peptídeos SARS-CoV-2 dobrados e desdobrados microarranjados, abrangendo a proteína S em amostras de plasma de indivíduos virgens de SARS-CoV-2-e convalescentes após um ciclo completo de imunizações com Gam-COVID-Vac (Figura 1A,B; Tabela 1). Ao comparar amostras de plasma do ponto de tempo 0 e do ponto de tempo 3 após a vacinação, foi encontrada uma indução significativa de respostas de IgG contra RBD dobrado, mas não desdobrado, S, S1 e S2 (Figura 1C). Três meses após a vacinação, os indivíduos apresentaram um aumento de 21- vezes de anticorpos IgG específicos para RBD (p < 0.{{20}}001) e um {{ Aumento de 18}} vezes de anticorpos IgG específicos para S (ou seja, ponto no tempo 0: mediana 0,291, ponto no tempo 3: mediana 5,778) (p < 0,0001), respectivamente. Os anticorpos IgG para S1 aumentaram 3,7-vezes (p=0,0023) e os anticorpos IgG para S2 aumentaram 2,8-vezes (p=0,0094) (Figura 1C ). A vacinação com Gam-COVID-Vac induziu principalmente respostas de IgG a S, S1 e RBD dobrados de forma comparável em indivíduos virgens de tratamento e convalescentes (Figuras 1C, S2 e S3), indicando que pode ser usada para reforçar SARS-CoV-2- respostas específicas de anticorpos também em indivíduos convalescentes. Reforços significativos de anticorpos IgG para RBD, S e S1 foram observados em indivíduos virgens e convalescentes (Figura S2) e não houve diferenças significativas em relação aos níveis de IgG para RBD, S, S1 e S2 em indivíduos virgens e convalescentes no momento 3 (Figura S3).
2.3. A vacinação Gam-COVID-Vac induz principalmente uma resposta da subclasse IgG1 a S e RBD
Foi relatado que a imunoterapia específica para alérgenos (AIT) induz principalmente respostas IgG1 e IgG4 específicas para alérgenos que diferem não apenas em relação às suas funções efetoras (a IgG1 pode mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e a ativação do complemento, enquanto a IgG4 não tem essas funções efetoras), mas também em relação à sua cinética (IgG1: início rápido e declínio precoce: IgG4: início lento, mas níveis sustentados) [28–30]. Portanto, investigamos as respostas da subclasse IgG (ou seja, IgG1-IgG4) a S e RBD em indivíduos vacinados com Sputnik-V. A Figura 1D mostra que a vacinação induziu quase exclusivamente uma resposta da subclasse IgG1 a S e RBD. Aumentos significativos nos níveis de IgG1 específicos para S e RBD (p=0 0,0002 e p=0 0,0071, respectivamente) foram encontrados após a vacinação. No entanto, nenhuma resposta relevante da subclasse IgG2, IgG3 ou IgG4 específica para S e RBD pôde ser detectada (Figura 1D).
2.4. Indução de anticorpos neutralizantes de vírus e anticorpos que inibem a interação RBD-ACE2 por vacinação Gam-COVID-Vac
Para a detecção de anticorpos neutralizantes de vírus, utilizamos um teste pVNT, onde partículas semelhantes a vírus foram pseudotipadas com proteína S da cepa original Wuhan-Hu-1 e do recentemente descrito VOC Omicron. Anticorpos com atividade neutralizante para a cepa Wuhan Hu-1 foram encontrados em todos, exceto um (isto é, sujeito 22) dos 22 indivíduos (Figura 2A, Tabela 2), enquanto os títulos de anticorpos neutralizantes para Omicron foram significativamente mais baixos (Figura 2B) e encontrado apenas em 17 dos 20 indivíduos (Figura 2A, Tabela 2). Nenhuma neutralização relevante foi encontrada para os sujeitos 6, 7, 10, 11, 15 (Figura 2A, Tabela 2). Os títulos de neutralização de vírus para Omicron foram 25 vezes menores que para WT (mediana 141,9 e 5,7 para Wuhan-Hu-1 e Omicron, respectivamente) (Figura 2B).
Figura 2. Atividade neutralizante do vírus no plasma 3 meses após a vacinação com Sputnik-V e associação com respostas de anticorpos IgG a RBD e peptídeos derivados de S. (A) A neutralização do vírus (ID50) (eixo y) contra a cepa Wuhan-hu-1 (verde) e Omicron (laranja) foi obtida com plasma de naïve (azul) e convalescente (vermelho) assuntos (eixos x). (B) Comparação da neutralização do vírus (eixo y: ID50 obtido para plasma dos indivíduos testados, as barras representam medianas com intervalo interquartil (IQR) Wuhan Hu-1 (verde) e Omicron (laranja) . A linha horizontal representa os resultados obtidos com plasma de um indivíduo controle saudável e não infectado (controle saudável, HC). Diferenças significativas entre cepas foram determinadas pelo teste de Mann-Whitney: **** p < 0. {{30}}001. (C) Localização de RBD e peptídeos correlacionados com a neutralização do vírus em um esquema de S (S1, S2). (D) Correlações entre títulos de neutralização de vírus para Wuhan-Hu{{19 }} (WT) ou Omicron (eixos y) e níveis de IgG específicos para RBD e peptídeos derivados de espículas 12, 32 e 46A (eixos x: ISU). Os símbolos azuis e vermelhos indicam indivíduos virgens de tratamento e convalescentes, respectivamente. Asteriscos indicam correlações significativas de acordo com o teste não paramétrico de Spearman, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=não significativo.
Tabela 2. Comparação dos níveis de IgG específicos para S, S1, S2 e RBD medidos por microarranjo com inibições da ligação de RBD a ACE2 e títulos de neutralização de vírus (Wuhan-Hu-1, Omicron) determinados para plasma do assuntos investigados. O mapeamento térmico foi realizado para cada parâmetro separadamente usando Excel. O nível mais alto foi considerado vermelho escuro e o mais baixo foi considerado branco.
O facto de em todos os indivíduos, excepto um (ou seja, no indivíduo 22), os anticorpos neutralizantes do vírus terem aumentado após a vacinação indica que foram induzidos pela vacinação (Tabela 2). O sujeito 21 já apresentava um alto bloqueio da interação RBD-ACE2 na MIA e alta neutralização do vírus no início do estudo (Tabela 2). Notavelmente, amostras de plasma de indivíduos convalescentes vacinados com Gam-COVID-Vac que apresentavam doença moderada (nº 1, 2, 17, 18, 21) apresentaram títulos de neutralização de vírus mais elevados do que aquelas de indivíduos convalescentes que apresentavam doença leve (nº 22) ou sem sintomas (#4, 5, 7, 9) (Tabelas 1 e 2). No entanto, uma descoberta importante foi que a inibição da ligação do RBD à ECA2 e a neutralização do vírus nem sempre estavam associadas. Uma inibição de mais de 25% da ligação do RBD Wuhan Hu-1 ao ACE2 ocorreu apenas em 6 indivíduos que também demonstraram inibição no teste de neutralização do vírus devido à vacinação (ou seja, indivíduos 1, 2, 3, 17, 18 e 19) (Tabela 2). Curiosamente, a atividade neutralizante do vírus (dose infecciosa de 50% (ID50) > 100) foi observada em 6 indivíduos, embora eles não mostrassem nenhuma ou fraca inibição da ligação do RBD à ECA2 (Tabela 2: Indivíduos 6, 10, 12, 13, 16, 20) .
2.5. A neutralização do vírus em indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac está fortemente correlacionada com as respostas de IgG ao RBD e ao peptídeo 12 derivado de S
Conforme indicado anteriormente, o plasma de vários indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac (por exemplo, nos indivíduos 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabela 2) mostrou atividade neutralizante do vírus, mas não inibiu a interação RBD-ACE2. Portanto, analisamos a reatividade do anticorpo IgG aos peptídeos que abrangem a proteína S por análise de chip baseada em microarranjos [13] (Figura S4 e Figura 2C) e correlacionamos respostas de IgG específicas do peptídeo com a neutralização do vírus do Wuhan-Hu{{19} } cepa e Omicron (Figura 2D). As respostas de IgG a três peptídeos (isto é, peptídeos 12, 32, 46A), como as respostas de IgG ao RBD dobrado, correlacionaram-se significativamente com a neutralização da cepa Wuhan-Hu -1 (Figura 2C, D). O peptídeo 12 se destacou porque as respostas de anticorpos ao peptídeo 12 desdobrado (Figura S1), mas não aos peptídeos desdobrados 32 e 46A, foram significativamente reforçadas pelo Gam-COVID Vac em indivíduos ingênuos (Figura 3A) e também significativamente correlacionadas com a neutralização de Omicron (Figura 2D ). Nenhum reforço significativo foi observado em indivíduos convalescentes para os peptídeos 12, 32 ou 46A (Figura 3A). A sequência do peptídeo 12 é altamente conservada entre as cepas de SARS-CoV -2 (Figura 4) e reside em S1 próximo ao terminal N do RBD e, portanto, denota uma região que pode ser relevante para a transição do pré- à conformação pós-fusão da proteína S (Figura 3B).
Figura 3. Níveis medianos de anticorpos IgG (eixos y: ISU) para peptídeos derivados de S (P12, P32, P46A) em indivíduos virgens de vacinação e convalescentes nos pontos de tempo 0 e 3 (eixos x) (A) . São indicadas diferenças significativas entre os grupos, conforme determinado pelo teste de Wilcoxon: * p < 0.05, ns=não significativo. (F) (B) Figura 3. Níveis medianos de anticorpos IgG (eixos y: ISU) para peptídeos derivados de S (P12, P32, P46A) em indivíduos virgens de vacinação e convalescentes nos pontos de tempo 0 e 3 (x -eixos) (A). São indicadas diferenças significativas entre os grupos, conforme determinado pelo teste de Wilcoxon: * p < 0,05, ns=não significativo. (B) Visualização dos peptídeos 12, 32 e 46A na representação de superfície do trímero da proteína spike SARS-CoV-2 (vista lateral, conformação pré-fusão) gerado com PyMOL. O peptídeo 12 é destacado no modelo S-trimer em vermelho, o peptídeo 32 em azul e 46A em laranja. Os carboidratos são mostrados em cinza claro.
Figura 4. Alinhamento da sequência proteica de Wuhan-Hu-1 (acima) e Omicron (abaixo) da proteína S SARS-CoV-2. RBD é colorido em amarelo claro e os peptídeos 12, 22, 25, 32, 33, 46A e 47 estão sublinhados. A sequência da proteína S de Wuhan corresponde ao isolado WA1 (número de acesso do GeneBank: BCN86353.1), sequência da proteína S de Omicron Omicron é o clado GRA, linhagem B.1.1.529 BA.1 baseada no banco de dados GISAID ( https://www.gisaid.org/ (acessado em 15 de março de 2022)). As substituições de aminoácidos são codificadas por cores de acordo com sua hidropatia e propriedades de carga (rosa=hidrofóbico, verde=neutro, azul claro=básico hidrofílico e vermelho claro=ácido hidrofílico).
3. Discussão
A vacina baseada em vetor Gam-COVID-Vac, também denominada Sputnik-V, foi uma das primeiras vacinas contra SARS-CoV-2 que se tornou disponível para uso na prática clínica. No entanto, há relativamente pouca informação disponível sobre as especificidades das respostas de anticorpos em indivíduos que foram vacinados com COVID-19. Neste estudo, realizamos uma análise detalhada das respostas de anticorpos contra proteínas e peptídeos microarranjados dobrados e desdobrados do SARS-CoV-2 abrangendo a proteína S em amostras de plasma de indivíduos virgens de SARS CoV-2-e convalescentes após um curso completo de imunizações com Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac induziu principalmente respostas de IgG1, mas nenhuma outra subclasse de IgG, a S, S1, S2 e RBD dobrados de maneira comparável em indivíduos virgens de tratamento e convalescentes, indicando que pode ser usado para aumentar o SARS-CoV-2- respostas específicas de anticorpos também em indivíduos convalescentes. Tal como outras vacinas genéticas, a resposta de anticorpos induzida por Gam-COVID-Vac residiu principalmente na subclasse IgG1, que tem uma semi-vida mais curta em comparação com uma resposta da subclasse IgG4, que é mais sustentável. Por exemplo, as respostas específicas da subclasse IgG4 estão associadas à proteção a longo prazo durante a imunoterapia específica para alérgenos, enquanto as respostas específicas da IgG1 aumentam rapidamente, mas desaparecem após alguns meses [28–30]. Consequentemente, serão necessárias injeções de reforço frequentes de Gam-COVID-Vac e de outras vacinas genéticas para manter as respostas de anticorpos neutralizantes a um nível elevado. A vacinação com Gam-COVID-Vac induz uma resposta de anticorpos que imita em grande parte a encontrada após a infecção natural com SARS-CoV-2 [13]. Além disso, as respostas de anticorpos após a infecção natural pertencem principalmente à subclasse IgG1 e são direcionadas contra S, S1, S2 e RBD dobrados [13]. A descoberta nova e interessante do nosso estudo foi que o plasma de vários indivíduos vacinados com Gam-COVID-Vac (por exemplo, nos indivíduos 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabela 2) mostrou atividade neutralizante do vírus, mas não inibiu o Interação RBD-ACE2. Portanto, analisamos a reatividade do anticorpo IgG aos peptídeos que abrangem a proteína S completa por análise de chip baseada em microarray [13] (Figuras 2D e S4) e correlacionamos respostas de IgG específicas do peptídeo com a neutralização do vírus do Wuhan-Hu{{62} } cepa e Omicron BA.1 (Figura 2D). As respostas de IgG a três peptídeos (isto é, peptídeos 12, 32, 46A), como as respostas de IgG ao RBD, correlacionaram-se significativamente com a neutralização da cepa Wuhan-Hu -1 (Figura 2C, D). No entanto, o péptido 12 foi único porque as respostas de anticorpos apenas ao péptido 12, mas não aos péptidos 32 e 46A, foram significativamente reforçadas pela vacinação (Figura 3A) e também correlacionadas significativamente com a neutralização de Omicron (Figura 2D). A magnitude do reforço das respostas IgG ao péptido 12 induzida pela vacina foi modesta mas significativa em indivíduos não tratados previamente e bastante comparável ao reforço de anticorpos IgG dirigidos a S e S1. No entanto, os anticorpos IgG contra o péptido desdobrado isolado (Figura S1) podem representar apenas uma porção de anticorpos dirigidos contra o péptido 12 na proteína dobrada. Além disso, não só os níveis, mas também a avidez dos anticorpos são importantes. A sequência de peptídeos 12 é altamente conservada entre a cepa Wuhan-Hu -1 e BA.1 Omicron VOC (Figura 4) e é derivada de uma região que pode ser relevante para a transição do pré para o pós-fusão conformação da proteína S (Figura 3B). Além disso, a comparação de novas variantes mutantes de Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), mostra que o peptídeo 12 (284-313 aa. ) permanece inalterado em termos de sequência de aminoácidos, em contraste com, por exemplo, o peptídeo 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (acessado em 28 de novembro de 2022)). Notavelmente, foram descritos anticorpos monoclonais com capacidade de neutralização de vírus direcionados à região do domínio N-terminal (NTD) da qual o peptídeo 12 faz parte [31], e foi relatado que também outras vacinas podem induzir uma resposta de anticorpos dirigida contra esta região. [18–20,32], indicando que a região definida pelo peptídeo 12 pode ser importante para induzir anticorpos neutralizantes. Pode-se, portanto, supor que os anticorpos induzidos pela vacinação Gam-COVID-Vac podem neutralizar o SARS-CoV-2 por dois mecanismos, um simplesmente inibindo a interação RBD-ACE2 e outro visando a região que contém o peptídeo 12 do S- proteína que pode estar envolvida em mudanças estruturais (isto é, transição da pré-fusão para a conformação de fusão de S). Nosso estudo tem limitações. Por exemplo, usamos um ensaio de neutralização baseado em lentivírus pseudotipados, mas esses ensaios são amplamente utilizados e confiáveis [33]. É também uma limitação do nosso estudo que os peptídeos em nosso micro-arranjo foram desdobrados e, portanto, podem ter identificado apenas uma fração de anticorpos neutralizantes que reconheceram os peptídeos desdobrados, enquanto uma fração ainda maior de anticorpos pode ter sido ligada a epítopos conformacionais nos identificados. região. Além disso, é uma limitação do nosso estudo o fato de termos analisado apenas um pequeno número de indivíduos. No entanto, o nosso estudo indica claramente que anticorpos com diferentes especificidades de epítopos podem contribuir para o efeito protetor da vacinação Gam COVID-Vac. Além disso, o estudo mostra uma resposta a um peptídeo potencialmente conservado que pode ser usado para criar anticorpos amplamente neutralizantes.
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4. Materiais e Métodos
4.1. População do Estudo e Declaração de Ética
Indivíduos saudáveis com (n {0}}) ou sem (n=12) infecções prévias por SARS-CoV-2 foram incluídos no estudo em dezembro de 2020 no National Research Center Institute of Imunologia da Agência Federal Médica Biológica da Rússia (Número de ética: #12-1, 29 de dezembro de 2020). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito. A infecção anterior por SARS-CoV-2 foi confirmada por um teste de PCR positivo anterior e sintomas de COVID-19 ou pela presença de anticorpos específicos-2-de SARS-CoV direcionados ao antígeno do nucleocapsídeo e/ou Antígeno RBD e/ou S conforme descrito [13]. Todos os indivíduos foram imunizados por via intramuscular com duas doses de Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moscou, Rússia) com intervalo de três semanas. Amostras de sangue foram obtidas um dia antes da primeira vacinação (T0, Figura 1A) e 80 a 85 dias após a primeira vacinação (T3, Figura 1A).
4.2. Detecção de respostas de anticorpos específicos do SARS-CoV-2-
A resposta de imunoglobulina de indivíduos virgens de tratamento e convalescentes de COVID{{0}} foi avaliada em amostras de plasma antes e após a imunização com Sputnik-V (Figura 1A). IgG específica para um painel abrangente de proteínas SARS-CoV-2 e 46 peptídeos (25–30 meros) abrangendo a proteína S foi medida em amostras de plasma diluídas de 1:50 por tecnologia de microarray-chip como anteriormente descrito [13]. As sequências de aminoácidos, o número de aminoácidos e o peso molecular de todos os peptídeos sintéticos no chip microarranjado são apresentados na Tabela 3. Para os peptídeos 12 e 32 e RBD expressos em Escherichia coli (E. coli) (desdobrado) e em células do Rim Embrionário Humano 293 (HEK293) (dobradas) são fornecidos espectros de dicroísmo circular (CD) (Figura S1). Os péptidos 12 e 32 não revelaram nenhuma estrutura secundária específica, conforme determinado pelo dicroísmo circular (CD), como mostrado na Figura S1. Em detalhe, lâminas de vidro contendo microarranjos rodeados por uma moldura de epóxi (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Alemanha) foram ativadas com um polímero orgânico complexo reativo com amina, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , EUA) para facilitar a ligação de proteínas e peptídeos. Os antígenos/peptídeos SARS-CoV-2 foram detectados usando uma concentração de 0,5–1 mg/mL em (75 mM Na2HPO4, pH=8.4) em triplicatas usando um SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Berlin, Alemanha) [13]. A expressão e purificação de proteínas e síntese de peptídeos são descritas em [13]. A reatividade do anticorpo IgG a antígenos microarranjos foi medida lavando primeiro os microarranjos por 5 min com solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 a 0,5% (PBST) e secando-os por centrifugação usando uma centrífuga Sigma 2–7 e MTP-11113 rotor (ambos Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Alemanha). Em seguida, alíquotas de 35 µL de amostras de plasma diluídas 1:50 (diluente de amostras, Thermofisher, Waltham, MA, EUA) foram adicionadas e incubadas por 2 horas a 22 ◦C. Após outra etapa de lavagem, 30 µL de anticorpos secundários (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, EUA) marcados com IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA)) foram aplicados e incubados por 30 min a 22 ◦. CRT. Os chips foram então lavados, secos e posteriormente escaneados usando um scanner confocal a laser (Tecan, Männedorf, Suíça). A análise de imagens foi realizada pelo software de aquisição e análise de imagens de microarranjos MAPIX (Innopsys, Carbonne, França) e a conversão das unidades de fluorescência medidas em unidades padronizadas ISAC (ISU) foi realizada conforme descrito [13]. Os níveis específicos de anticorpos são expressos em unidades padronizadas ISAC (ISU). As respostas de anticorpos IgG1-4 específicos para S e RBD foram medidas em amostras de plasma (diluídas 1:50) em duplicatas por ELISA, conforme descrito anteriormente [13] com uma variação de<5% for their average values.
Tabela 3. Peptídeos sintéticos derivados da proteína spike do SARS-CoV-2 §.
4.3. Espectros de dicroísmo circular UV distante (CD)
Para peptídeos, P12 e P32, bem como RBD expressos em células de E. coli e HEK293, a análise de CD foi realizada usando um espectropolarímetro Jasco J-180 (Japan Spectroscopic Co., Tóquio, Japão) descrito anteriormente [34]. Os espectros de CD de peptídeos e proteínas (Figura S1) foram medidos a uma concentração de 0,1 mg/mL em 10 mM NaH2PO4 (pH 8,0), que foi usado para detectar os antígenos.
4.4. Ensaio de neutralização de vírus baseado em pseudovírus (PVT)
A atividade de neutralização de vírus em amostras de plasma foi determinada por ensaio de neutralização de vírus baseado em pseudovírus, conforme descrito anteriormente [35]. Para produzir partículas semelhantes ao vírus (VLPs) SARS-CoV-2, as células HEK293T foram co-transfectadas com 3 plasmídeos: plasmídeo de embalagem lentiviral pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, Reino Unido), pUCHR-GFP e um Plasmídeo pCAGGS-S∆19 que codifica a proteína spike SARS-CoV-2 de tipo selvagem (idêntica aos isolados de referência Wuhan-Hu-1 e WA1) ou plasmídeo pCAGGS-S∆19-Om codificando a proteína spike SARS-CoV-2 Omicron (gentil presente de Andrey Gorchakov, Laboratório de Imunogenética, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Seção Siberiana da Academia Russa de Ciências, Novosibirsk, Rússia). Antes do uso em pVNT, as VLPs foram tituladas limitando a diluição e incubadas por 4 dias com células HEK293T transfectadas com hACE2-. Uma dose de partículas virais que deu 50% de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) foi selecionada para uso no teste. Para pVNT, todas as amostras de plasma foram inativadas por calor por 30 minutos a 56 ◦C antes do uso. No 4º dia, as células pós-infecção foram ressuspensas e a percentagem de células positivas para GFP foi medida por citometria de fluxo. Os valores de ID50 foram calculados utilizando uma curva sigmoidal (software GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), reconstruída pela porcentagem de neutralização nas diferentes concentrações plasmáticas indicadas.
4.5. Ensaio de interação molecular (MIA)
Para detectar a capacidade de amostras de plasma de indivíduos convalescentes ou virgens de COVID{{0}} (Tabela 1), antes e depois da imunização com Sputnik-V, de inibir a ligação de 50 ng/mL de RBD-hu-1 para o receptor ACE2, um ensaio de interação molecular (MIA) foi realizado conforme descrito [13,36–39]. Este ensaio pode medir a inibição do RBD marcado para ACE2 ligado à placa de ELISA por anticorpos ou outra inibição composta da interação RBD-ACE2 [38]. Resumidamente, ACE{15}} recombinante (GenScript, Piscataway, NJ, EUA) foi revestido (2 µg/mL) durante a noite em placas de 96 poços NUNC Maxisorb (Thermofisher). Posteriormente, foram realizados três ciclos de lavagem com tampão de lavagem e depois as placas foram bloqueadas durante 3 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio. As amostras de soro foram diluídas 1: 2 em PBS, 0, 05% de Tween 20, 1% de BSA e pré-incubadas durante 2 h com 50 ng de RBD recombinante marcado com His (GenScript). Em seguida, as amostras de soro pré-incubadas foram adicionadas às placas contendo ACE-2 por 3 h e as placas foram lavadas e incubadas durante a noite com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-His tag diluído 1:1000 (Dianova, Hamburgo, Alemanha) . Após 3 etapas de lavagem, adicionou-se anticorpo IgG1 anti-camundongo diluído 1:1000 ligado a HRP (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) por 2 h e a detecção foi realizada com ABTS. Os valores médios de densidade óptica (OD) correspondentes ao RBD ligado foram medidos a 405 nm e 492 nm (referência) num leitor TECAN Infinite F5 ELISA com o software integrado i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suíça). O controle de buffer (sobreposição sem RBD) foi subtraído de cada resultado. As determinações foram realizadas em duplicata e os resultados são apresentados como valores médios com variação de<5%.
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4.6. Visualização de Peptídeos na Estrutura da Proteína Spike
A representação de superfície da proteína spike SARS-CoV-2 foi gerada em PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, versão 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, Nova York, NY, EUA) com base na entrada do PDB 6XR8.
4.7. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism (versão 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla Califórnia). O teste de Wilcoxon (Figuras 1C, D e 3A), o teste de Mann-Whitney (Figuras 2B e S3) e o teste de Friedman (Figura S2) foram utilizados para comparação entre dois ou múltiplos grupos. p < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo. A correlação entre os dois grupos foi determinada pelo teste de Spearman (Figura 2D). Uma regressão não linear normalizada foi realizada utilizando o software GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Os dados são apresentados como mediana ± IIQ. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—não significativo.
5. Conclusões
Em resumo, nosso estudo é o primeiro a estudar em profundidade a especificidade do epítopo e da subclasse IgG de anticorpos induzidos por Gam-COVID-Vac e a revelar diferentes mecanismos de neutralização do vírus induzida por Gam-COVID-Vac por anticorpos. Em particular, obtivemos evidências de que os anticorpos direcionados a um peptídeo (isto é, o peptídeo 12) localizado próximo, mas fora do RBD, na parte N-terminal de S1, estão associados à neutralização do vírus. A potencial atividade neutralizadora de vírus de anticorpos específicos para peptídeos 12- pode ser devida à sua capacidade de interferir na transição da conformação pré para pós-fusão da proteína spike. Sugerimos considerar a inclusão da região definida pelo peptídeo 12 numa forma imunogênica em vacinas para induzir anticorpos contra esta área de epítopo e para testar anticorpos induzidos por tais vacinas para neutralização do vírus. No caso em que a neutralização do vírus das vacinas possa ser melhorada, a inclusão de um epítopo imunogênico do peptídeo 12 pode melhorar a eficácia das vacinas contra COVID-19. Além disso, pode-se considerar o desenvolvimento de anticorpos contra o epítopo 12-definido pelo peptídeo para imunização passiva. Como o epítopo definido 12-do peptídeo é conservado nas variantes atualmente conhecidas do SARS-CoV-2, as vacinas e os anticorpos direcionados ao peptídeo 12 May oferecem proteção cruzada contra variantes do SARS-CoV-2. Assim, fornecemos novos conhecimentos que podem ser úteis para o desenvolvimento de novas estratégias de vacinação ativa e passiva para COVID-19.
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