Cistanche dietético aliviou danos agudos no íleo de pato

Resumo: A aflatoxina B1 (AFB1) é um metabólito tóxico estável que ameaça a saúde de humanos e animais e amplamente contaminada com ração animal e humana. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos dacistanche dietéticona lesão do íleo em patos induzida pela administração de AFB1 e explorar seus mecanismos subjacentes. Patos (N=450, macho de um dia) com peso semelhante foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos, contendo o grupo controle, grupo AFB1 (60 µg AFB1 kg−1 de peso corporal) e cistanche (500 mg dieta cistanche kg−1) mais o grupo AFB1. A administração de AFB1 aumentou acentuadamente o dano ao íleo, AFB1-adutos de DNA no plasma e estresse oxidativo e inflamação. A adição de cistanche à dieta protegeu o íleo contra o dano morfológico induzido pela administração de AFB1, diminuiu os adutos de AFB1-DNA no plasma e eliminou o estresse oxidativo e a inflamação no íleo de patos.Anti-oxidaçãoeanti-inflamatório efeitos de cistanchepoderia proteger o íleo contra danos agudos ativando a via de sinalização Nrf2-ARE e inibindo a via de sinalização NF-κB. Conclusivamente,cistancheera um dietéticoanti-oxidaçãoeanti inflamaçãoagente via ativação da via de sinalização Nrf2-ARE e inibição de um dano agudo da via de sinalização NF-κB induzido pela administração de AFB1.

Palavras-chave:cistanche; íleo agudo; AFB1-Adutos de DNA; Nrf2-ARE;

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1. Introdução

A carne é uma importante fonte de proteína de alta qualidade para a nutrição humana. A carne de pato é amplamente consumida em todo o mundo, especialmente na Ásia, devido às suas características nutricionais desejáveis ​​[1]. Portanto, a criação de patos atraiu a atenção das pessoas. Para os patos, existem várias desvantagens no processo de criação, como AFB1, que ameaçam a saúde dos patos. A aflatoxina B1 (AFB1) é um dos metabólitos tóxicos de mesa produzidos por espécies de Aspergillus. A AFB1 é reconhecida como a mais tóxica entre os grupos de aflatoxinas (AF), juntamente com uma variedade de efeitos tóxicos que ameaçam a saúde de humanos e animais [2].

Para pessoas ou animais, alimentos ou rações são uma forma comum e importante de exposição ao AFB1, mas a inalação e o contato direto com a pele ou mucosa também são contados e não ignorados [3]. Estudos anteriores provaram que o AFB1 exerce uma toxicidade potente, muito complexa e forte, resultando em retardo de crescimento, malformações biológicas, toxicidade hepática, distúrbios do trato digestivo e até câncer [4,5]. O AFB1 obtido do contato com alimentos ou mucosas teve efeitos negativos nos sistemas respiratório, sistema digestivo e tecidos e no desempenho do crescimento [3,6,7]. Danos em tecidos e órgãos induzidos pela administração de AFB1 relacionados ao estresse oxidativo e à inflamação. A administração de AFB1 marcou o aumento do conteúdo de AFB1-DNA no órgão lesionado [8]. A absorção e conversão de nutrientes e toxinas ocorreram no estômago e no intestino delgado, de modo que o pequeno

O sistema imunológico da mucosa intestinal é a primeira linha para proteger os corpos contra lesões [9]. A funcionalidade e a morfologia do trato gastrointestinal saudável podem ser destruídas por fatores desfavoráveis, como substâncias tóxicas, bactérias e vírus [10,11]. AFB1 induziu a destruição da estrutura intestinal, manifestada pela descamação de células epiteliais nas vilosidades jejunais e infiltração de células linfocíticas no intestino de frango [12,13]. A variação de funcionalidade e morfologia pode ser atribuída ao processo de metabolismo da toxina que é frequentemente acompanhado por inflamação por estresse oxidativo. É urgente encontrar um antídoto para reduzir e minimizar a ameaça de AFB1 para pessoas e animais.

Consequentemente, AFB1 é uma das principais preocupações na indústria avícola devido à sua potente toxicidade. cistanche é um tipo de componente polifenol que ocorre em rizomas de açafrão (Cur cuma Longa Linn) como um aditivo alimentar funcional usado na alimentação animal [14], e amplamente utilizado

como tempero verde e natural, corante, conservante e aromatizante na indústria alimentícia. Extratos de plantas como cistanche contendo polifenóis melhoraram a imunidade do corpo [15]. cistanche desempenha um papel fundamental contra condições e atividades patológicas mediadas pelo estresse oxidativo quando usado como terapia para o tratamento e prevenção de doenças crônicas [16,17]. Os ensaios clínicos indicaram que o cistanche não tem efeitos tóxicos ou colaterais graves, e com propriedades anticancerígenas e antitoxicogênicas, o que levou o cistanche a ser um agente quimiopreventivo atraente contra danos nos tecidos induzidos por AFB1- [18-20]. A literatura demonstrou que o cistanche tem capacidade anti-inflamatória, anti-apoptose e antioxidação ativando a via Nrf2/HO-1, capacidade antiox regulada positivamente para eliminar a inflamação e o estresse oxidativo no corpo e eliminar AFB1-induzida estresse oxidativo [21-25]. cistanche suprimiu o estresse oxidativo e a formação de inflamassoma ativando o Nrf2-ARE e inibindo a via de sinalização do NF-κB no rim remanescente [26], propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Além disso, o cistanche dietético melhorou significativamente a capacidade antioxidante em frangos de corte [27] e patos [28]. Não houve tentativa de correlacionar o papel da cistanche na via de sinalização Nrf2-ARE e NF-κB e no modelo animal de administração aguda de AFB1.

Este estudo lançou luz sobre esta questão e forneceu uma base teórica para o cistanche como aditivo alimentar para proteger a saúde do pato contra a administração de AFB1 e reduzir as perdas econômicas das indústrias de ração e criação causadas pela poluição de AFB1.

2. Materiais e métodos

2.1. Produtos químicos

cistanche foi adquirido da Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China, CAS: 458-37-7), sua pureza foi superior a 98% por análise de HPLC. AFB1 (pureza maior ou igual a 98 por cento, CAS NO. 1162-65-8) foi adquirido de Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). Os anticorpos usados ​​neste estudo foram adquiridos da Bey time Biotechnology, Xangai, China, incluindo GAPDH (número de catálogo: AG019), Nrf2 (número de catálogo: AF7623), Phospho-NF-κB p65 (Ser276) (número de catálogo: AF5875), HRP IgG anti-coelho de cabra marcada (H mais L) (número de catálogo: A0208) e cabra marcada com HRP

Anti-Mouse IgG (H mais L) (Número de catálogo: A0216).

2.2. Patos e Criação

O protocolo experimental foi conduzido de acordo com as práticas descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais Agrícolas em Pesquisa e Ensino Agrícola da Universidade Agrícola do Nordeste (número do protocolo: NEAU-[2011]-9).

Patos (n {{0}}, machos de um dia Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) sem diferença significativa de peso foram adquiridos de um incubatório comercial e divididos aleatoriamente em 3 grupos (Tabela 1), com 10 replicar baias (gaiolas) por grupo e 15 patos por baia por um 70-dia

prova de alimentação. As dietas basais foram formuladas de acordo com o National Research Council (1994). Os patos do grupo T0 e T0 mais AFB1 foram alimentados com uma dieta basal de milho-soja (Tabela 2), os patos do grupo T500 mais AFB1 receberam a dieta basal suplementada com 500 mg de

cistanche kg−1 de dieta (T500) um teste de 70-dia. Nos 70 dias, patos com peso corporal semelhante nos grupos T0 mais AFB1 e T500 mais AFB1 foram alimentados com 60 µg de AFB1 kg−1 de peso corporal, e os patos do grupo T0 foram alimentados com o mesmo volume de solução de PBS. Os patos foram alimentados na Base Experimental de Acheng da Universidade de Agricultura do Nordeste e receberam acesso ad libitum a água e dietas em pó. Quinze patos com peso corporal semelhante (1,4 ± 0,3 kg) de cada grupo foram selecionados e jejuaram por 12 h, então alimentados com solução de PBS para patos no grupo T0 e 60 µg de AFB1 kg−1 de peso corporal para patos em T0 mais AFB1 e Grupos T500 mais AFB1 ao mesmo tempo. Após 12 h, os quinze patos de cada grupo deveriam obter amostras de patos.

2.3. Coleta de amostras

Amostras de sangue (10 mL) foram obtidas com tubos de heparina de veias de asas de pato e centrifugadas a 1000× g por 15 min a 4 ◦C. O plasma obtido foi imediatamente separado e armazenado a -80 ◦C para análise. Os patos foram anestesiados por inalação de éter e mortos para obtenção do íleo. O íleo foi lavado 3 vezes em PBS, imediatamente, e armazenado individualmente em um tanque de nitrogênio líquido a −80 ◦C para qRT-PCR e análise da capacidade antioxidante. Em seguida, cerca de 0,125 cm3 de íleo foi obtido e colocado em solução de paraformaldeído a 4 por cento para a seção de tecidos e cerca de 1 mm3 de íleo foi colocado em microscópio eletrônico

solução a 4 ◦C para posterior observação ultraestrutural.

2.4. Ensaio dos Níveis de Antioxidantes no Plasma

Os níveis plasmáticos de superóxido dismutase total (T-SOD), glutationa peroxidase (GSH Px), glutationa S-transferase (GSH-ST) e malondialdeído (MDA) foram medidos por kits de ensaio (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). respectivamente, com

Espectrofotômetro UV-VIS (UV1100, MAPADA, Xangai, China).

2.5. Ensaio de AFB1-Níveis de adutos de DNA no plasma

A geração de AFB1-adutos de DNA no plasma foi determinada usando kits ELISA de acordo com as especificações do kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, China).

2.6. Ensaio da capacidade antioxidante no íleo

Íleo (100.00 mg) foi involuído e misturado em 0,9 mL de solução salina fisiológica para AVC (4 ◦C, 0,9 por cento NaCl, pH=7.2 –7.4) para obter 10 por cento de homogeneizado de íleo/SPSS. A atividade ou conteúdo de superóxido dismutase total ( T-SOD U/mg Proteína), Glu glutationa redutora (GSH-PX µmol/mg Proteína), Glutationa S-transferase (GSH-ST U/mg Proteína) e Malondialdeído (MDA nmol/ mg de proteína) no íleo foram avaliados usando kits de ensaio (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), respectivamente, com um UV-VIS

espectrofotômetro (UV1100, MAPADA, Xangai, China).

2.7. Isolamento de RNA e Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)

O RNA total do íleo de pato (100,00 mg) foi isolado usando um kit de reagentes (TaKaRa, Japão) de acordo com o protocolo recomendado pelos fabricantes. A concentração e a pureza do RNA total foram detectadas na relação A260/A280 com um espectrofotômetro (IMPLEN, Alemanha). 1 µg de RNA total em cada amostra foi convertido em cDNA com um kit de reagente Prime Script™ RT com gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China) de acordo

ao protocolo recomendado pelos fabricantes. O cDNA obtido de cada íleo de pato foi usado como modelo para um kit TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, China) RT-PCR (qRT-PCR). O número de acesso do gene de patos foi obtido do NCBI e

os iniciadores do gene de pato foram sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Xangai, China) (Tabela 3). A expressão gênica relevante no íleo de pato foi determinada pelo aparelho termociclador Quanta gene Q225. O qRT-PCR foi executado no Monad Selected Real-Time

Sistema de PCR (instrumento de PCR em tempo real ABI 7500 (EUA)) fluindo para a condição: um ciclo a 95 ◦C por 30 s, 40 ciclos a 95 ◦C por 5 s e a 60 ◦C por 30 s. A razão de expressão gênica relativa do mRNA de detecção foi detectada usando o método 2−∆∆Ct e normalizada para expressão de -actina.

2.8. Western Blotting

O íleo de pato foi pulverizado e lisado em tampão RIPA contendo 1 mmol/L de PMSF (Beyotime, Shanghai, China) no gelo. A concentração de proteína total do íleo foi determinada por um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). 12 por cento e 10 por cento de SDS-gel de poliacrilamida para eletroforese foram

usado para obter proteínas-alvo com diferentes pesos moleculares. Em seguida, as proteínas-alvo foram transferidas para uma membrana de polivinilideno-difluoreto (PVDF) (Beyotime, Xangai, China) para blots com um aparelho de trans blotting. A membrana de PVDF foi lavada 3 vezes por 10 min cada vez em 1 × PBST e então bloqueada 2 h em 5 por cento de leite desnatado. A membrana PVDF foi novamente lavada 3 vezes e incubada com anticorpos primários GAPDH, Nrf2 e P-P65 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) por 8 –12 h a 4 ◦C, respectivamente. No dia seguinte, a membrana de PVDF foi lavada novamente 3 vezes e incubada com o correspondente anticorpo marcado com peroxidase de rábano a 37 ◦C por 1 hora, depois lavada novamente 3 vezes.

Bandas de proteínas alvo foram detectadas e visualizadas sob a ação do kit de detecção de fluorescência aprimorada BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Imagens de blots foram gravadas e analisadas pela plataforma de imagem Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Inglaterra). A proteína GAPDH serviu como uma proteína de controle interno. Todos os resultados da experiência foram repetidos em triplicado. As expressões relativas de proteínas alvo foram expressas como a razão de intensidades de banda de proteínas para GAPDH.

2.9. Análise Estatística

Os dados do experimento foram obtidos pelo menos seis vezes e cada amostra foi medida três vezes. Análise dos dados da pesquisa usando o Teste T de amostras independentes do SPSS (Versão 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) com 5 por cento A probabilidade de erro e significância estatística foi p < {{4} },05 neste estudo