A exposição ao escapamento de diesel altera a expressão de redes implicadas na neurodegeneração em cérebros de peixes-zebra, parte 2

Preparação de amostra de proteína

Para preparar amostras de proteínas, as cabeças de 80 a 100 larvas anestesiadas (5 pdf) foram cuidadosamente isoladas e lavadas com PBS antes de serem transferidas para um tampão de lise que consistia em 15% de TCA pré-resfriado/acetona contendo 0,07% de beta-mercaptoetanol (ME )e coquetel inibidor de protease (precisa do fabricante)em um volume total de 500 ul.

Nos últimos anos, tem havido um interesse considerável nos efeitos das amostras de proteínas na memória. Cada vez mais pessoas estão começando a perceber a importância da dieta para a saúde, especialmente o importante papel das proteínas no corpo humano.

As proteínas são os materiais básicos de construção do corpo humano e desempenham um papel importante no corpo humano. Por conta disso, as amostras de proteínas se tornaram um canal importante para muitas pessoas em busca de saúde e beleza. Além de construir músculos e esculpir o corpo, as amostras de proteínas também podem melhorar a memória de uma pessoa.

Alguns cientistas estudaram a relação entre proteínas e memória. Eles descobriram que a ingestão prolongada de proteína suficiente é benéfica para todos os aspectos da saúde física, especialmente a memória. Há evidências crescentes de que a ingestão de proteínas na dieta tem um impacto importante na função cerebral e na memória.

A proteína é um componente importante dos neurônios do cérebro humano, portanto, a ingestão diária de proteína tem um impacto importante na memória e na capacidade de raciocínio das pessoas. A ingestão de proteínas a longo prazo não apenas atende às necessidades proteicas do corpo, mas também ajuda o cérebro a se manter ativo e saudável.

Além disso, a proteína também pode ajudar o corpo a manter o equilíbrio do açúcar no sangue e a manter um humor estável. Isto é muito importante para manter a memória e as habilidades de pensamento. Portanto, a ingestão moderada de proteínas pode ajudar a melhorar diversas funções cognitivas e estados emocionais do corpo humano.

No geral, existe uma forte relação entre amostras de proteínas e memória. Aumentar a ingestão de proteínas ajuda a manter o cérebro e o corpo saudáveis, melhorando as habilidades de pensamento e a memória. Para pessoas que precisam melhorar a memória, é muito necessário consumir uma quantidade adequada de proteínas. Devemos comer alimentos proteicos de forma adequada e prestar atenção a refeições razoáveis ​​para manter um corpo saudável e uma mente afiada. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim o saúde do sistema nervoso. Além disso, a Cistanche deserticola também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, o aprendizado e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir o desenvolvimento de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

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Após breve homogeneização, as proteínas foram precipitadas por 12 horas a 20 graus, seguida de centrifugação a 12,000 rpm por 5 min a 4 graus. O sobrenadante foi removido e o pellet de proteína foi lavado duas vezes com acetona fria (contendo 0.07% de ME e coquetéis inibidores de protease). O pellet de proteína final foi dissolvido em um tampão de lise contendo ureia 7,0 M, e 2,0 M de tioureia por sonicação em gelo.

As amostras de proteínas solubilizadas foram centrifugadas a 15,{1}} rpm por 10 min a 4 graus para precipitar partículas insolúveis, e a concentração das amostras de proteínas finais foi medida usando o método de Bradford.

Análise proteômica de alto rendimento baseada em TMT

As amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas pela adição sequencial de tripsina e proteases lis-C. Os peptídeos foram então rotulados usando tags isobáricas 10-plexTMT de acordo com as instruções do fabricante. As amostras marcadas foram misturadas e depois fracionadas finamente usando cromatografia de fase reversa de alto pH.

As frações individuais foram então analisadas por LC-MS/MS usando cromatografia de fase reversa on-line e espectrometria de massa em tandem em um espectrômetro de massa Thermofsher Fusion Lumos. Os dados foram adquiridos usando o método MS3 baseado em seleção de precursor síncrono, como descrito anteriormente (McAlister et al. 2014). A pesquisa no banco de dados e a extração de informações do íon repórter TMT foram realizadas usando a plataforma de software MaxQuant (Cox e Mann 2008).

A comparação dos dados de TMT entre amostras foi realizada usando MSStats (Choiet al. 2014). Análise transcriptômica Aproximadamente 80-100 cabeças foram isoladas de embriões anestesiados (120 h), lavadas com PBS e submetidas à extração de RNA total usando Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , EUA) seguindo as instruções do fabricante.

A qualidade e a quantidade de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) e ainda pelo Agilent 2100 Bioanalyzer para garantir a concentração mínima de 50 ng/ul e o número de integridade de RNA (RIN) de 8. A preparação da biblioteca foi então realizada usando um Illumina HiSeq4000 de acordo com o protocolo: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow withRibo-Zero Gold" e as amostras foram sequenciadas nas seguintes condições: "Paired End run,R1=75 ciclos (antisense Strand), Index=8 ciclos, R2=75 ciclos (cadeia sensorial)."

Análise de dados

Ambos os conjuntos de dados para estudos proteômicos e transcriptômicos foram carregados e analisados ​​​​simultaneamente usando a ferramenta online Metascape, que permite anotação genética para várias espécies, incluindo Danio rerio (Zhou et al. 2019). Para avaliar a contribuição da alteração do perfil do proteoma ou do transcriptoma em vias específicas, os dados foram analisados ​​através do uso do software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Conjuntos de dados contendo identificadores de genes ou proteínas e valores de expressão correspondentes foram carregados no aplicativo. Cada identificador foi mapeado para seu objeto correspondente na base de conhecimento do Ingenuity.

Um ponto de corte de alteração de expressão de 13- vezes foi definido para identificar moléculas cuja expressão foi regulada diferencialmente. A análise funcional identificou as funções biológicas e/ou doenças que eram mais significativas para o conjunto de dados. As moléculas do conjunto de dados que atenderam ao ponto de corte e estavam associadas a funções biológicas foram consideradas para a análise. O teste exato de Fisher de cauda direita foi usado para calcular um valor p determinando a probabilidade de que cada função biológica e/ou doença atribuída a esse conjunto de dados seja devida apenas ao acaso.

Análise de caminho

Para avaliar a contribuição das alterações do perfil do proteoma ou do transcriptoma em vias específicas, ambos os conjuntos de dados foram carregados no software IPA (Krämer et al. 2014). As principais vias canônicas alteradas significativas foram então avaliadas e interpretadas usando PCR e western blotting conforme descrito abaixo.

Western blotting

Um total de 25 µg de proteínas foi carregado em um NuPAGE a 12% (Novex, CA) e transferido para membranas PVDF (Novex, CA) conforme descrito (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris e tween 20 a 0,01% (tampão TBST) por 30 minutos em temperatura ambiente e depois incubadas durante a noite a 4 graus com anti-Cyp1A1 policlonal de coelho (Abcam, CA) ou anti-GAPDH monoclonal de camundongo( Abcam, CA), diluído em tampão TBST contendo 1% de leite desnatado.

Após a lavagem em TBST, os blots foram incubados com anticorpos secundários HRP anti-coelho de burro (Abcam, CA) ou HRP anti-camundongo de cabra (Santa Cruz, CA) por 2 h, seguido de desenvolvimento com substrato de western blotting Pierce™ ECL Plus( Thermo Fisher Scientific, EUA). As bandas foram visualizadas por imagem usando um scanner LI-COR e analisadas por densitometria (LI_COR Biosciences, NE).

PCR em tempo real

O RNA total foi isolado das cabeças usando o reagente TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, EUA) seguindo as instruções do fabricante e depois medido usando um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Uma quantidade de 1 µg de cada amostra de RNA foi transcrita reversamente usando supermix de transcrição reversa iScript™ (Bio-Rad, CA), e PCR em tempo real foi realizada usando supermix SsoAdvancedUniversal SYBR Green (Bio-Rad, CA), e os primers estão listados na Tabela Suplementar 1. Os níveis de expressão relativa foram calculados usando o método 2-ΔΔCT, e o teste estatístico T foi usado para avaliar as diferenças significativas.

Resultados e discussão

As análises proteômica e transcriptômica são duas ferramentas importantes para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos de doenças e à resposta aos estímulos ambientais (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012) . Aqui, realizamos análises profundas de expressão tanto nos níveis transcriptômicos quanto proteômicos nas cabeças de embriões de peixe-zebra expostos ao DEPe.

As cabeças, compostas principalmente por tecido cerebral, foram isoladas para eliminar os perfis de expressão de outros tecidos porque estamos interessados ​​em determinar vias patológicas intrínsecas do SNC.

O perfil de expressão das cabeças dos embriões de peixe-zebra

A análise de perfil rendeu 11.172 proteínas detectadas e 14.748 alvos de mRNA de mais de 26,000 genes codificadores (Howe et al. 2013). Entre as 11.172 proteínas identificadas nas amostras marcadas com TMT (Tabela Suplementar 2), 141 proteínas foram significativamente reguladas e 607 foram reguladas negativamente (Tabela Suplementar 3 e Figura 1a). Da mesma forma, 367 transcritos foram regulados positivamente e 149 foram regulados negativamente entre os 14.748 transcritos (Tabela Suplementar 4) detectados na análise de RNA-seq (Fig. 1b e Tabela Suplementar 5).
Na maioria dos casos, os resultados das análises proteômicas e transcriptômicas reguladas positivamente foram consistentes. Por exemplo, as principais proteínas altamente reguladas incluem citocromo P450 Cyp1a, Cyp1c1, subunidade gama da proteína de ligação a guaninanucleotídeos, anexina, isoforma curta de plexina B2b, membro da desidrogenase/redutase (família SDR) 13-como 1, antígeno S da retina/glândula pineal (arrestina) b e Sulfotransferase6B1.

Da mesma forma, os genes com a maior regulação transcriptômica incluem o citocromo P450 (Cyp1a), o ligante 27a da quimiocina (motivo C – C), o repressor A do receptor de aril-hidrocarboneto, o citocromo P450 (Cyp1b) e a glicoproteína C da família Rh. nem sempre foram altamente correlacionados.

Por exemplo, Complexina 2, Espectrina alfa, cadeia leve da miosina cardíaca-1, proteína de interação SEC23, subunidade de membrana ATPsintase EA, citocromo b e proteína desacetilase dependente de NAD estão entre as principais proteínas altamente reguladas negativamente, enquanto a proteína 1a da membrana do segmento externo da retina , família transportadora de soluto 5 (transportador de iodeto), homólogo B do oncogene viral do osteossarcoma murino FBJ, complexina 4c, antígeno 1a semelhante a FOS, opsina 1 e v-fos mostram a maior regulação negativa da transcrição (Tabelas 1 e 2).

Os anticorpos que reconhecem as proteínas do peixe-zebra são limitados, mas confirmamos uma amostra dessas alterações usando a análise de Western Blot. A regulação positiva da proteína Cyp1A e a regulação negativa da Complexina 2 (CPLX2) foram confirmadas usando GAPDH como controle de carga (Fig. 2a). Níveis mais elevados de transcrição TAT e UGT1B1 e níveis mais baixos de CHNRB e TH2 também foram confirmados por qPCR usando Elf-alpha como controle interno (Fig. 2b).

Anotação genética

Existem várias ferramentas e softwares de bioinformática online que podem fornecer informações úteis sobre anotação genética. Dentre eles, o Metascape, com capacidade de anotação genética para Danio rerio (Zhouet al. 2019), foi utilizado neste trabalho.

Ambos os conjuntos de dados para estudos proteômicos e transcriptômicos foram carregados e analisados ​​​​simultaneamente usando esta ferramenta on-line. Depois de combinar a saída de alterações proteômicas e transcriptômicas no software, vários processos, como resposta ao estímulo xenobiótico, metabolismo de xenobióticos pelo citocromo P450 e regulação circadiana da expressão gênica foram encontrados induzidos após tratamento com DEPe (Fig. 3a).

Esta análise também sugeriu níveis suprimidos de processos biológicos como "percepção visual", "fototransdução" e "internalização de receptores acoplados à proteína G". As alterações nos perfis de expressão relacionados à visão não foram inesperadas, uma vez que o tratamento com DEPe durante o desenvolvimento inicial resultou em olhos menores (dados não mostrados).

Sinalização do metabolismo xenobiótico

Os xenobióticos, que são compostos químicos estranhos, naturais ou sintéticos, podem desencadear a resposta ao estresse celular, levando à diferenciação, proliferação, apoptose ou necrose. Na verdade, o corpo precisa de se proteger ativamente contra os xenobióticos, e também contra os compostos endógenos tóxicos e os seus metabolitos, através da expressão de enzimas e transportadores envolvidos na sua eliminação e desintoxicação.

Estas enzimas são classificadas em três grupos: enzimas de Fase I (CYP, ALDH, FMO) que introduzem polaridade nos xenobióticos; Enzimas de Fase II (UGT, GST, SULT) que introduzem hidrofilicidade através da conjugação de moléculas hidrofílicas como sulfato, ácido glucurônico e glutationa aos xenobióticos; e enzimas de Fase III (MDR1, OATP2, MRP) que transportam os xenobióticos ou conjugados formados durante a Fase II para a área extracelular.

Essas enzimas são induzidas através de cascatas de sinalização envolvendo receptores específicos (CAR, PXR, AHR) e ativação de fatores de transcrição mediada por MAPK (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

Na ausência de ativadores, o receptor constitutivamente ativo (CAR) está localizado no citoplasma como um complexo com CCRP e HSP90. Mas quando um ativador está presente, o CAR transloca-se para o núcleo e liga-se ao RXR para formar um heterodímero e liga-se ainda a diversas variantes do motivo de repetição, como DR3, DR4, ER6 e ER8, e contribui para a regulação da expressão gênica (Tabela Suplementar 2).

Nossa análise proteômica revelou a ativação do metabolismo xenobiótico. De fato, a clara regulação positiva de CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heme oxigenase 1), CAT (catalase) e CES1 (carboxilesterase 1) mostra a indução do metabolismo de Fase I, enquanto aumenta a expressão de UGT1A1 (UDP glucuronosiltransferase família 1 membro A1) e GSTP1 ( glutationaS-transferase pi 1) indica a ativação do metabolismo da Fase II.

Curiosamente, a regulação negativa de sulfato transferases, como SULT1A1 (membro 1 da família da sulfotransferase 1A), SULT1C2 (membro 2 da família da sulfotransferase 1C) e SULT2B1 (membro 1 da família da sulfotransferase 2B) sugere que o aumento da hidrofilicidade no metabolismo da Fase II tende a ocorrer preferencialmente através da conjugação com ácido glucurônico e glutationa , mas não a conjugação de sulfato (Fig. 4).

Os resultados do estudo transcriptômico são bastante consistentes, pois CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 e UGT1A1 são todos regulados positivamente nos níveis de RNA. No entanto, SULT2B1 mostra regulação positiva no nível do RNA (embora sub-representada nos níveis da proteína).

Isto pode ser devido ao envolvimento de outros mecanismos que induzem a degradação ou inativação das enzimas sulfato transferase após tratamento com DEPe. O que é particularmente surpreendente é que estas alterações no metabolismo xenobiótico ocorreram nas cabeças (presumivelmente cérebros) dos peixes. A expressão de genes xenobióticos foi descrita no sistema nervoso de mamíferos, mas este é o primeiro relato deles em cérebros de peixes-zebra (McMillan e Tyndale 2018).

Essas descobertas são consistentes com um estudo semelhante conduzido por Shankar e colaboradores que testaram os efeitos de diferentes grupos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos ambientais (PAHs) no desenvolvimento de embriões e avaliaram ainda mais o impacto de cada regime de tratamento no perfil do transcriptoma.

Em todo o corpo de embriões de 48 h pós-fertilização (hpf), eles mostraram que a regulação positiva de Cyp1a tanto na transcrição quanto nos níveis de proteína é um biomarcador confiável inicial de ativação de AHR xenobiótica e alterações transcriptômicas a jusante (Shankar et al. 2019).

A resposta ao estresse oxidativo2-mediada pela NRF

O estresse oxidativo pode desencadear apoptose e necrose e acredita-se que esteja envolvido na neurodegeneração (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Uma importante resposta de defesa celular ao estresse oxidativo é a indução de enzimas antioxidantes e desintoxicantes.

O fator nuclear-eritróide 2-fator 2 relacionado (Nrf2) liga-se aos elementos promotores de resposta antioxidante (ARE) e ativa sua transcrição. O Nrf2 inativo está associado a uma proteína Keap1 de ligação à actina e é retido no citoplasma.

Provocado pelo estresse oxidativo, o Nrf2 é fosforilado em resposta às vias da proteína quinase C, fosfatidilinositol 3-quinase e MAP quinase. O Nrf2 fosforilado pode então translocar-se para o núcleo e ligar-se a ARES para transativar enzimas desintoxicantes e antioxidantes (Tabela Suplementar 3) (Ma 2013).

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