Camundongos nocauteados para diamina oxidase não são hipersensíveis à histamina administrada por via oral ou subcutânea

Abstrato

1. Objetivo

Avaliar a contribuição da diamina oxidase endógena (DAO) na inativação da histamina exógena, encontrar uma cepa de camundongo com maior sensibilidade à histamina e testar a eficácia da rhDAO em um modelo de desafio com histamina.

2. Métodos

Camundongos knockout para diamina oxidase (KO) foram desafiados com histamina administrada por via oral e subcutânea em combinação com o bloqueador -adrenérgico propranolol, com os dois inibidores de histamina-N-metiltransferase (HNMT) metopreno e tacrina, com ácido fólico para simular lesão renal aguda e tratados com DAO humana recombinante. A temperatura corporal central foi medida usando um microchip implantado subcutaneamente e os níveis plasmáticos de histamina foram quantificados usando um ensaio homogêneo de fluorescência resolvida no tempo.

3. Resultados

A temperatura corporal central e os níveis plasmáticos de histamina não foram significativamente diferentes entre camundongos de tipo selvagem (WT) e DAO KO após exposição oral e subcutânea com histamina com e sem lesão renal aguda ou administração de inibidores de HNMT. O tratamento com DAO humano recombinante reduziu a área média sob a curva (AUC) para perda de temperatura corporal central em 63 por cento (p=00,002) e a pontuação clínica em 88 por cento (p<0.001). The AUC of the histamine concentration was reduced by 81%.

4. Conclusões

A inativação da histamina exógena não é impulsionada pela degradação enzimática e filtração renal. O tratamento com DAO humano recombinante reduziu fortemente a perda de temperatura corporal central induzida por histamina e as concentrações de histamina e preveniu o desenvolvimento de sintomas clínicos graves.

Palavras-chave

Amina oxidase (contendo cobre) · Histamina N-metiltransferase · Lesão renal aguda · Metabolismo · Tacrina · Metoprina · Temperatura corporal

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Introdução

Mais de 95 por cento de toda a histamina em humanos é armazenada em mastócitos e basófilos. O mesmo é provável que seja verdade para muitos mamíferos. Em humanos, as densidades de mastócitos são maiores no trato gastrointestinal, na pele e nos pulmões [1] e, consequentemente, esses órgãos apresentam sintomas induzidos por histamina em doenças com claro envolvimento da ativação de mastócitos. As concentrações intersticiais locais de histamina após a degranulação aguda podem atingir 10–1000 µMs [2, 3, consulte Recursos on-line]. Em humanos, assim como em cães e porcos, as concentrações plasmáticas normais de histamina estão abaixo de 1 ng/ml (9 nM) e os sintomas começam a se desenvolver em alguns nanogramas por mililitro [4-7]. Hipotensão significativa com aumento da frequência cardíaca pode ser medida a partir de 5 ng/ml e quando os níveis aumentam acima de 10 ng/ml, o desenvolvimento de broncoespasmo, arritmias cardíacas, hipotensão grave e espasmo coronário pode levar a disfunção multissistêmica com risco de vida [8, 9]. A histamina não está envolvida apenas na vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, hipóxia e desenvolvimento de edema vascular, mas também demonstra envolvimento pró-inflamatório influenciando o sistema imunológico adaptativo por meio do recrutamento, maturação e ativação de células imunes efetoras. Além disso, desempenha um papel no sistema imunológico inato, interagindo com células dendríticas, células natural killer e granulócitos [10, 11].

As concentrações basais de histamina em camundongos e ratos estão entre 20 e 100 ng/ml quando medidas usando métodos confiáveis ​​e, portanto, muitas vezes maiores do que as encontradas em humanos [6, 7]. Não está claro se esses altos níveis de histamina desempenham algum papel fisiológico. Os roedores são notoriamente resistentes à histamina com doses letais de 50% (LD50) em diferentes cepas de camundongos de 3.000 a 4.000 e 400 a 500 mg/kg após administração oral e intravenosa, respectivamente [12, 13]. A concentração plasmática máxima de histamina após uma administração em bolus de 400 mg/kg em um camundongo de 20 g seria de aproximadamente 8 mg/ml assumindo um volume de plasma de 1 ml. Quando a anafilaxia foi induzida em humanos por meio de uma picada de vespa controlada, concentrações de histamina de 140 ng/ml foram associadas a hipotensão grave com risco de vida [14]. Como a histamina é metabolizada e inativada?

A histamina mostra 13% de ligação média às proteínas plasmáticas e é livremente filtrada nos rins [15]. A taxa de filtração glomerular (GFR) pode teoricamente contribuir com cerca de 15 a 20 por cento para a meia-vida de 3 a 4 minutos encontrada em voluntários saudáveis ​​[5, consulte Recursos on-line]. Em uma TFG normal de 100 ml/min e um volume de plasma de 3.000 ml, a meia-vida da histamina seria de 20 min. Em camundongos, uma TFG normal de 10 µl/min/g resultaria em uma meia-vida de histamina de 3 min [16, consulte Recursos on-line]. No entanto, a histamina mostra uma alta taxa de extração no rim, excedendo as taxas com base na TFG, e essa extração é atribuída à captação e reabsorção nas células tubulares proximais via transportador de cátions orgânicos 2 (OCT2), seguido de inativação enzimática [17, ver abaixo]. Em humanos, menos de 1% da histamina radioativa injetada foi encontrada na urina nas primeiras 6 horas [18]. A baixa taxa de excreção de histamina em humanos, que também é observada em cães e gatos, foi confirmada por outros [19]. Em tecidos de camundongos e ratos, mais de 50% da radioatividade injetada é encontrada nos rins e menos de 2% como histamina 30 minutos após a administração intravenosa [20]. Os rins também foram o órgão com maior radioatividade após a administração de altas doses de histamina em ratos [21]. O transportador OCT2 é altamente expresso em rins humanos e de roedores e pode ser responsável tanto pela extração de histamina do compartimento plasmático quanto pela reabsorção de histamina no filtrado primário da urina nas células tubulares proximais [22, veja abaixo].

O transporte rápido de histamina extracelular do líquido intersticial após a liberação dos mastócitos ou plasma para outros compartimentos distantes das células endoteliais seria outra possibilidade de inativar a histamina. Isso pode inibir a indução de hipotensão grave e vazamento vascular mediado via sinalização endotelial de óxido nítrico sintase (NOS) e ligação a receptores de histamina [23-25]. No entanto, não estão disponíveis dados animais in vivo que estudem as taxas de transporte de histamina da circulação sistêmica para as células endoteliais ou parenquimatosas. Em vários estudos in vitro, a histamina é transportada bidirecionalmente usando OCT2 e OCT3 de baixa afinidade e alta capacidade [22, 26, 27]. A histamina é um excelente substrato para o transportador OCT2 e OCT3 de rato, mostrando maior eficiência de transporte em comparação com as proteínas OCT humanas equivalentes [26].

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Quando baixas concentrações de histamina radioativa são usadas em camundongos, a metilação via histamina-N-metiltransferase (HNMT) parece ser a principal via de inativação. Desafiar camundongos com doses mais altas de histamina, no entanto, muda o metabolismo para ácido imidazol acético (IMAA) e conjugados ribosídeos, com apenas uma pequena quantidade de derivados metilados detectados [28-30]. As concentrações séricas de histamina quintuplicadas na linha de base nos camundongos knock-out HNMT suportam esses dados [31]. O ácido imidazolacético é gerado via oxidação da histamina pela diamina oxidase (DAO) liberando imidazol acetaldeído, que é convertido em IMAA e derivados ribosídeos, principalmente no fígado. A oxidação da histamina via DAO parece desempenhar um papel maior no catabolismo da histamina após desafio oral em camundongos, o que não é surpreendente, considerando que em camundongos a expressão de DAO é alta apenas no trato gastrointestinal [30]. Quando um desafio de histamina oral é realizado em humanos, a desaminação oxidativa via DAO é a via catabólica dominante com IMAA como o principal metabólito urinário [18].

A diamina oxidase é uma amina oxidase contendo cobre e uma das duas enzimas capazes de inativar a histamina [32]. Em tecidos selecionados, principalmente no intestino delgado e nas células tubulares proximais do rim, a DAO está localizada em estruturas granulares intracelulares mal definidas e extracelularmente ligada a proteoglicanos de sulfato de heparano, enquanto a HNMT está presente apenas no citoplasma [33, 34]. A expressão de HNMT é generalizada em todo o corpo, com níveis mais elevados encontrados no sistema nervoso central, bexiga, coração, rins, fígado, pulmão e tecido adiposo.

Após a inibição da DAO usando aminoguanidina, as ovelhas mostraram extensos sintomas clínicos de toxicidade por histamina após desafio com histamina oral em comparação com controles sem pré-tratamento com aminoguanidina [35]. Um experimento semelhante em porcos resultou em severa morbidade e mortalidade em animais pré-tratados com aminoguanidina e subsequentemente desafiados com histamina oral [36]. As concentrações plasmáticas medianas de histamina aumentaram 20-vezes em porcos com inibição de DAO. O tratamento de ratos com aminoguanidina seguido de desafio oral com histamina aumentou o IMAA urinário e reduziu a concentração de histamina em aproximadamente cinco vezes [37]. Esses dados indicaram que DAO desempenha um papel crucial na degradação da histamina exógena administrada por via oral.

Em camundongos, o tratamento com aminoguanidina aumentou fortemente as concentrações de histamina no intestino após exposição intravenosa com histamina [30]. No entanto, a aminoguanidina não é um inibidor específico da DAO, mas também bloqueia todas as três enzimas NOS e parece bloquear o transporte de histamina sanguínea para os tecidos [38, 39]. A administração de burimamida, um antagonista do receptor 2 da histamina, mostrou efeitos prejudiciais com aumento da mortalidade em um modelo de choque circulatório em ratos. No entanto, ao mesmo tempo, foi publicado que a burimamida é um potente inibidor da DAO [40, 41]. Em cães, a burimamida causou um aumento de 17-vezes na concentração plasmática média de histamina e uma forte redução na pressão arterial média [42]. Acreditava-se que o efeito era devido à possível ativação de mastócitos.

Da mesma forma, o papel da HNMT foi estudado usando metil-histamina como um inibidor de HNMT, mas a metil-histamina também é um excelente substrato para DAO [43]. Amodiaquina e quinacrina são inibidores potentes de HNMT [44-46], mas também inibem DAO com uma concentração inibitória de 50 por cento (IC50) de aproximadamente 500 nM [47, dados não publicados]. Portanto, os dados derivados do uso de inibidores, que são frequentemente usados ​​em altas concentrações, devem ser interpretados com cautela, porque efeitos fora do alvo conhecidos e desconhecidos são prováveis ​​e podem distorcer significativamente a relevância fisiológica dos estudos in vivo.

Estudos metabólicos podem fornecer alguma indicação da importância das duas enzimas na degradação da histamina, mas o catabolismo da histamina pode ser dissociado dos efeitos fisiológicos ou fisiopatológicos. As concentrações compartimentais de histamina podem ser críticas e o metabolismo pode estar a jusante.

Portanto, decidimos usar o camundongo knock-out (KO) DAO para estudar o papel do DAO na degradação da histamina exógena. Um segundo objetivo principal foi desenvolver um modelo de camundongo com maior sensibilidade à histamina para nos permitir estudar melhor o papel da histamina em várias cepas genéticas mutantes e testar a eficácia da DAO humana recombinante em um modelo de desafio com histamina.

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material e métodos

modelos de animais

Os experimentos foram realizados usando camundongos KO de 10–18-semanas de idade C57BL6/J Aoc1tm1b(EUCOMM)Hmgu (DAO) e irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT). Embriões heterozigotos foram fornecidos pelo European Mouse Mutant Archive, Munique, Alemanha, e implantados em camundongos pseudográvidos C57BL6/N. Camundongos descendentes heterozigotos C57BL6/J foram confirmados usando PCR (consulte Recursos on-line) e posteriormente usados ​​para criar camundongos DAO KO na Divisão de Pesquisa Biomédica, Universidade Médica de Viena, pelo protocolo animal GZ 66.009/{ {14}}WF/V/3b/2016. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo GZ 66.009/0258- V/3b/2019. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Educação, Ciência e Pesquisa da Áustria. Os animais foram mantidos em um ciclo dia-noite de 12:12 h a 22 graus com água e comida ad libitum. Para medições de temperatura não invasivas, um transponder (IPTT-300, BioMedic Data Systems Inc., EUA) foi implantado por via subcutânea 2 semanas antes do experimento usando anestesia curta com isoflurano. O transponder mede a temperatura três vezes em um segundo e a média dessas medições é registrada do lado de fora da gaiola usando um leitor. Este valor médio é então usado para cálculos adicionais. Esses transponders subcutâneos são usados ​​para evitar a manipulação excessiva de animais e para evitar lesões causadas pela inserção repetida de sondas de temperatura retal [48]. Em várias espécies animais, incluindo roedores, a administração de histamina demonstrou diminuir a temperatura corporal e é considerada a leitura de última geração para os efeitos da histamina [49, 50]. Durante o período de observação, os sintomas clínicos foram avaliados por um veterinário experiente de acordo com um escore de hipersensibilidade publicado [51]. A pontuação variou de 0 (sem sintomas) a 1 (esfregar e coçar a cabeça e o nariz), 2 (atividade reduzida com frequência respiratória aumentada e/ou atividade reduzida, inchaço ao redor da boca e olhos), 3 (respiração difícil, cianose ao redor da cauda e boca, chiado) e 4 (sem atividade após cutucar ou tremor e convulsão). Uma pontuação de 5 denotava morte. Todos os experimentos de desafio foram iniciados entre 9:00 e 11:00 da manhã para evitar variações dependentes da hora do dia [52].

Configuração experimental geral

Todas as substâncias foram aplicadas no volume de 5 ml/kg. O propranolol (P0884, Sigma-Aldrich, Áustria) foi dissolvido em solução salina e aplicado intraperitonealmente (ip) a uma concentração de 2 mg/kg 20 minutos antes do desafio com histamina para aumentar a sensibilidade à histamina [53]. Dicloridrato de histamina (H7250, Sigma-Aldrich, Áustria) foi dissolvido em H2O duplamente destilada (dd) e posteriormente diluído em solução salina. Todas as concentrações de histamina declaradas referem-se à base de histamina (111,15 Dalton).

1. Administração oral e subcutânea de histamina

Os camundongos foram mantidos em jejum por 60 minutos no total. Após 40 minutos de jejum, propranolol foi administrado e 20 minutos depois foi aplicada histamina na concentração de 30 mg/kg via oral (vo) por gavagem oral. Para o modelo de desafio subcutâneo (sc) os camundongos receberam histamina a uma concentração de 50 mg/kg sem propranolol ou 5 mg/kg com propranolol. Para a determinação das concentrações plasmáticas de histamina, um subconjunto de camundongos foi anestesiado em diferentes momentos após o desafio com histamina usando 10 mg/kg de xilazina e 100 mg/kg de cetamina. O plasma de citrato foi coletado de camundongos anestesiados por meio de punção cardíaca. Um a cinco camundongos foram usados ​​por ponto de tempo e genótipo.

2. Inibição concomitante da histamina-N-metiltransferase (HNMT)

A metoprina (M338835, Toronto Research Chemicals, Canadá) foi dissolvida em ácido láctico a 10 por cento (L1875, Sigma-Aldrich, Áustria), posteriormente diluída em solução salina e administrada ip a 3 mg/kg 1 h antes do desafio com 5 mg/kg de histamina. Tacrina (A79922, Sigma-Aldrich, Áustria) foi dissolvida em ddH2O, posteriormente diluída em solução salina e subsequentemente 10 mg/kg foram aplicados ip 1 h antes de 25 mg/kg de histamina sc e 2 mg/kg de propranolol. Uma concentração de 2 mg/kg de Tacrina ip foi usada em combinação com 30 mg/kg de histamina via oral combinada com 2 mg/kg de propranolol.

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3. Indução de lesão renal aguda (LRA) antes do desafio com histamina

Folic acid (F7876, Sigma-Aldrich, Austria) was reconstituted in ddH2O, further diluted in saline, and applied i.p. at a concentration of 100 mg/kg 48 h before challenge with 5 mg/kg s.c. histamine and 2 mg/kg propranolol. The degree of acute kidney injury was estimated using plasma creatinine values. As a cut-off for inclusion, a creatinine value of at least threefold above the mean baseline value was used as described [54]. Baseline plasma creatinine concentrations of 0.11 and 0.17 mg/dl were measured in two mice and therefore an inclusion cut-off of>42 mg/dl foi selecionado. O plasma de citrato coletado por punção cardíaca foi usado para medir a creatinina usando um analisador Cobas (analisador Cobas C311, Roche, Suíça). Para determinar as concentrações plasmáticas de histamina em diferentes pontos de tempo durante o desafio de histamina sc com propranolol em lesão renal aguda, dois a quatro camundongos por ponto de tempo foram anestesiados e o plasma de citrato foi coletado por punção cardíaca.

4. Resgate DAO após administração de histamina

A (rh)DAO humana recombinante com um motivo de ligação à heparina mutante (descrito em Gludovacz et al. [55]) foi aplicada por via intravenosa (iv) a uma concentração de 4 mg/kg 40 min antes da aplicação de 2 mg/kg de propranolol e 60 min antes do desafio com 5 mg/kg sc de histamina.

Para a determinação das concentrações de histamina e DAO no plasma, os camundongos foram tratados com 4 mg/kg de DAO ou tampão iv 60 min antes do desafio com 5 mg/kg de histamina sc combinada com 2 mg/kg de propranolol. Os camundongos foram anestesiados em diferentes momentos. O plasma de citrato foi coletado usando punção cardíaca de dois a três camundongos por ponto de tempo. O sangue foi coletado em citrato de sódio a 3,8 por cento e uma parte foi imediatamente misturada com diminazeno-aceturato (D7770, Sigma-Aldrich, Áustria), resultando em uma concentração final de 10 µM para inibir a degradação da histamina por rhDAO.

Análise de expressão gênica

As amostras de tecido foram congeladas por choque em nitrogênio líquido e o RNA total foi obtido usando o kit FavorPrep Tissue Total RNA (FATRK001, Favorgen, Taiwan) após a homogeneização do tecido usando tubos de lise (Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Alemanha) em Precellys 24 (Bertin Instruments, França). A transcrição reversa foi realizada usando o kit de síntese de cDNA OneScript Plus (G236, ABM Good, Canadá). Para PCR quantitativo foi utilizado BrightGreen Express 2× Mastermix (MasterMix-EL, ABM Good, Canadá). Os primers de extensão de exon para DAO, HNMT e histidina descarboxilase (HDC) foram projetados usando o software Primer3 (Tabela de recursos online 1). O gene de limpeza RPLP0 foi usado para normalização [56].

Western blot

Para análise de western blot, as amostras de tecido congeladas foram lisadas em tampão K-fosfato 20 mM (pH 7,2) usando tubos de lise (tubos Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Alemanha) em um Precellys 24 (Bertin Instruments, França) . A concentração total de proteína foi determinada usando o QuantiPro BCA Assay Kit (QPBCA-1KT, Sigma, Áustria). Para eletroforese em gel de poliacrilamida, 40 µg de proteína total e 40 ng de DAO murino recombinante (fornecido por EG, Universidade de Recursos Naturais e Ciências da Vida, Viena, Áustria, usando métodos descritos em [57]) foram separados usando um gel de 12 por cento Tris-glicina ( 4561043, Bio-Rad, EUA). Um anticorpo monoclonal ABP1 (sc-515908, Santa Cruz, EUA) foi usado para detecção de DAO em uma concentração de 0,4 µg/ml, e um anticorpo monoclonal GAPDH (2118, Cell Signal Technology, EUA) foi usado como carga controle na diluição de 1:2000. O anticorpo monoclonal anti-camundongo IgG-HRP (A2554, Sigma Aldrich, Áustria) e o anticorpo anti-coelho IgG-HRP (A0545, Sigma Aldrich, Áustria) foram usados ​​como anticorpos de detecção em uma diluição de 1:40.000. As imagens foram adquiridas usando Clarity Max Western ECL Substrate (1705062, BioRad, EUA) em um ChemiDoc Imaging System (17001401, Bio-Rad, EUA).

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Medição de atividade DAO

A atividade da diamina oxidase de diferentes homogenatos de tecido e a inibição por metopreno e tacrina foram medidas conforme descrito [58]. As amostras de tecido congeladas foram lisadas em tampão K-fosfato 20 mM (pH 7,2) usando tubos de lise em um Precellys 24. A concentração total de proteína foi determinada usando o QuantiPro BCA Assay Kit e 500 µg de extratos de proteína total de diferentes tecidos foram incubados por 120 min com orto-aminobenzaldeído (oABA) e ddH2O ou cadaverina 200 µM (CAD). Delta-1-piperidina, o produto de autociclização de CAD após desaminação por DAO, condensa com oABA formando um fluoróforo, que pode ser medido em EX440/30 e EM620/40 nm. Para determinação da inibição de DAO, rhDAO foi pré-incubado com metopreno e tacrina em diferentes concentrações por 30 min e medido conforme descrito acima.

Para determinação da atividade DAO, homogeneizados de tecido com uma concentração de proteína de 200 µg/ml foram misturados com HRP (concentração final 1,2 µg/ml, P6782, Sigma-Aldrich, Áustria) e aminoguanidina (concentração final 10 µM, 396494, Sigma-Aldrich , Áustria) ou tampão K-fosfato (pH 7,2) foi adicionado e incubado por 15 min a 37 graus . Amplex red™ (concentração final 100 µM, A12222, Thermo Scientific, EUA) foi adicionado e as reações foram iniciadas através da adição de 200 µM de concentração final de putrescina (51799, Sigma-Aldrich, Áustria). O tampão fosfato de potássio (pH 7,2) foi usado como controle negativo. As amostras foram incubadas a 37 graus e medidas a cada 10 min durante 120 min usando EX550 e EM590 nm. O sinal específico de DAO foi calculado subtraindo amostras com aminoguanidina, um potente e irreversível inibidor de DAO, de amostras com tampão K-fosfato.

Para medições da atividade de DAO no plasma em camundongos recebendo Rhoda iv, um ensaio híbrido usando um anticorpo monoclonal do clone da linha celular de hibridoma anti-DAO 8/119 fornecido pelo Prof. Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY) e Amplex red™ foi usado. Placas de fluorescência preta de ligação de alta proteína (475.515, Thermo Scientific Nunc, Dinamarca) foram revestidas com 100 µl de 5 µg/ml anti-DAO 8/119 em tampão carbonato-bicarbonato 50 mM ( C3041, Sigma-Aldrich, Áustria), incubado durante a noite a 4 graus e subsequentemente bloqueado com 120 µl de BSA a 1 por cento (A4503, Sigma-Aldrich, Áustria) durante 50 min à temperatura ambiente. Após o bloqueio, foram adicionados 100 µl de amostras de plasma e padrões previamente diluídos 1:10 em PBS e incubados por 1 h em temperatura ambiente. Posteriormente, 90 µl de peroxidase de rábano (concentração final 1,2 µg/ml) e Amplex red™ (concentração final 100 µM) em PBS com 0,1 por cento de BSA foram adicionados e as reações foram iniciadas pela adição de 10 µl de putrescina (concentração final 200 µM) ou PBS. A fluorescência foi medida a 37 graus a cada 5 minutos por 120 minutos usando EX550 e EM590 nm. A solução de lavagem foi Tween-20 a 0,1 por cento (P1379, Sigma-Aldrich, Áustria) em PBS. Uma curva padrão de 3–30 ng/ml de rhDAO foi preparada em plasma de camundongo. Todas as medidas foram realizadas em duplicata.

Medições de histamina

O plasma de citrato contendo 10 µM de diminazeno-aceturato (D7770, Sigma-Aldrich, Áustria) foi usado para medir as concentrações de histamina usando o kit dinâmico de histamina homogênea de fluorescência resolvida no tempo (HTRF) (62HTMDPET, Cisbio, França). O kit foi utilizado de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Uma curva padrão de histamina em plasma agrupado de camundongos C57Bl/6J foi usada para quantificação. Todas as concentrações de histamina referem-se à base de histamina e todas as medições foram realizadas em duplicado.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism Versão 8.4.0. (GraphPad Software Inc. San Diego). A significância estatística para as diferenças na atividade DAO em homogenatos de tecido foi calculada usando uma ANOVA de medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse. A área sob as curvas (AUC) de medições de temperatura corporal central individual e pontuações clínicas durante um experimento foram comparadas usando testes t não pareados de dois lados sem correção de Welch. As concentrações plasmáticas de histamina entre os grupos foram comparadas com uma ANOVA de duas vias. Para comparação das concentrações plasmáticas de histamina após sc o desafio entre camundongos com diferentes genótipos, com e sem lesão renal aguda e recebendo DAO ou tampão, os dados foram agrupados em intervalos para contabilizar os valores ausentes em subgrupos individuais (genótipos: 5, 1{{ 14}}, 20, 30, 40, 45, 60 min; lesão renal aguda: 0, 10–15, 20–30, 40–45 e 60 min; DAO: 0, 10, 30 e 45 min). Um teste t bilateral não pareado foi usado para testar as diferenças nas concentrações plasmáticas de creatinina de camundongos tratados com e sem 100 mg/kg de ácido fólico. A significância estatística foi definida como p<0.05 in all tests.

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Conclusão

Camundongos DAO KO eram essencialmente indistinguíveis de camundongos WT usando desafios exógenos de histamina oral e subcutânea. O envolvimento de HNMT na inativação da histamina, levando à redução dos sintomas, a topologia é, na melhor das hipóteses, moderada, mas os resultados da inibição farmacológica podem ser considerados preliminares. Dados usando inibição de HNMT com metopreno mostraram uma tendência para o envolvimento de DAO endógeno na inativação da histamina. Os rins estão envolvidos na extração rápida de histamina da circulação, mas os camundongos knockout 509 Diamine oxidase sete vezes elevados não são hipersensíveis à administração oral ou subcutânea... 1 3 concentrações de histamina não se traduziram em um fenótipo exagerado medido usando a temperatura central perda como leitura fenotípica. O uso de DAO humana ou de camundongo recombinante pode apoiar ou ajudar a descartar o envolvimento da histamina em vários modelos animais com suspeita de degranulação de mastócitos acompanhada de liberação rápida e maciça de histamina, ou com indução aumentada da enzima histidina descarboxilase seguida pela liberação de recém sintetizado histamina durante horas. Pode valer a pena estudar a criação de um verdadeiro camundongo KO duplo com cópias inativas dos genes DAO e HNMT, se viável. Camundongos KO únicos de DAO ou HNMT não apresentam fenótipos óbvios. [dados não publicados, 31] Da mesma forma, testar o envolvimento dos dois principais transportadores de histamina, OCT2 e OCT3, em alterações fenotípicas induzidas por histamina pode nos permitir obter uma melhor compreensão dos mecanismos por trás do desenvolvimento de sintomas mediados por histamina em roedores e conseqüentemente potencialmente também em humanos. Apesar dos esforços de pesquisa significativos por mais de 100 anos desde sua descoberta, ainda temos um longo caminho a percorrer antes de obtermos uma verdadeira compreensão do catabolismo da histamina.

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Matthias Karer1 · Marlene Rager-Resch1 · Teresa Haider2 · Karin Petroczi1 · Elisabeth Gludovacz3 · Nicole Borth3 · Bernd Jilma1 · Thomas Boehm1

1 Departamento de Farmacologia Clínica, Universidade Médica de Viena, Waehringer Guertel 18-20, 1090 Viena, Áustria

2 Departamento de Neurofisiologia, Centro de Pesquisa do Cérebro, Universidade Médica de Viena, Viena, Áustria

3 Departamento de Biotecnologia, Universidade de Recursos Naturais e Ciências da Vida, Viena, Áustria