Desenvolvimento de creme cosmético multifuncional utilizando materiais bioativos de Streptomyces

Ram Hari Dahal1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 e Jaiso Kim1,*

Abstrato:Vários cosméticos com uma única função estão sendo cada vez mais usados, mas os cosméticos com atividades multifuncionais permanecem limitados. Nosso objetivo era desenvolver um creme cosmético multifuncional comantioxidante, atividades anti-tirosinase, anti-envelhecimento e antimicrobiana. As atividades antimicrobianas foram realizadas pelo método de difusão em disco. A toxicidade celular e a proliferação celular foram avaliadas em uma 96-placa de poços com diferentes linhagens celulares, como HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 e B16F10. A inibição da tirosinase do cogumelo, a inibição da elastase e as atividades de eliminação do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) foram avaliadas e a IC50 foi calculada. A partícula de sílica mesoporosa foi sintetizada usando Pluronic P123 e tetraetil orto-silicato (TEOS). As imagens faciais foram capturadas pelo VISIA-CR (Facial Imaging System for Clinical Research). A rugosidade da imagem foi analisada pelo software PRIMOS e o brilho da imagem foi analisado pelo Chromameter CR-400. O produto bruto da cepa T65 inibiu diferentes bactérias patogênicas humanas como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. A IC50 do produto bruto de T65 para as atividades de captura de radicais de tirosinase, elastase e DPPH de cogumelos foi de 58,73, 14,68 e 6,31 ug/mL, respectivamente. O produto bruto T65 proliferou colágeno tipo I em células CCD-986Sk até 145,91 por cento ± 9,11 por cento (média ± SD; média de 24, 48 e 72 h) a 250 pg/mL. Partículas mesoporosas sintetizadas (SBA-15) confirmaram o desempenho sustentável por liberação de controle por três dias. Creme cosmético funcional formulado contendo SBA incorporado em T65{40}}, diminuiu significativamente a aspereza da pele em 4,670 por cento e aumentou o brilho da pele em 0,472 por cento após a aplicação de 4 semanas. O produto bruto T65 inibiu patógenos Gram-positivos e Gram-negativos. A partícula mesoporosa sintetizada, SBA-15, confirmou que a substância fisiologicamente ativa foi liberada em condições de liberação sustentável. O produto bruto T65 mostrou antimicrobiano impecável,antioxidante, antienvelhecimento e atividades clareadoras com efeitos não citotóxicos para diferentes linhagens celulares relacionadas à pele humana.

Palavras-chave: antioxidante; citotoxicidade; anti-tirosinase; anti-envelhecimento; antimicrobiano; partículas de sílica mesoporosas; formulações cosmecêuticas; aplicação estética

ervas do império perdido cistanchetambém tem umefeito de clareamento da pele.

1. Introdução

A pele é o maior órgão e cobertura externa do corpo humano. A aparência visual da pele permite estimar idade, sexo, saúde, atratividade e beleza [1,2]. Os produtos cosméticos são amplamente utilizados para melhorar a aparência da pele e reduzir o envelhecimento da pele. Além disso, a aplicação tópica de cosméticos demonstra como aumentar a atratividade manipulando fatores de beleza associados ao contraste facial [3,4]. As indústrias cosméticas estão constantemente buscando novos materiais bioativos naturais com propriedades antienvelhecimento, antioxidantes, anti-tirosinase e antimicrobianas para formulações cosmecêuticas para melhorar as abordagens de cuidados com a pele [5,6].

O envelhecimento da pele é um processo biológico complexo causado por diversos fatores intrínsecos e extrínsecos que levam à disfunção fisiológica e perda da integridade estrutural da pele. O envelhecimento intrínseco, geralmente conhecido como envelhecimento natural (envelhecimento cronológico) da pele, está relacionado às alterações hormonais com base na idade, enquanto o envelhecimento extrínseco está associado ao movimento do músculo, poluição, nicotina, exposição à radiação solar, cafeína, temperatura, estilos de vida como como dieta (nutrição), falta de sono, estresse e outras condições de saúde [7-9]. A elastina ajuda a pele a retornar à sua posição original após o movimento, enquanto a elastase produzida nas células acinares degrada a elastina e leva ao envelhecimento da pele. O anti-elastase inibe a elastase e retém a elastina em seu estado inicial, o que previne o envelhecimento da pele. Produtos cosméticos ou de cuidados com a pele com propriedades antienvelhecimento afetam positivamente o envelhecimento da pele [10-13].

Os radicais livres geralmente são gerados durante o metabolismo celular. Espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS), como radical ânion, superóxido, peróxido, radical hidroxila, óxido nítrico (NO), peroxinitrito e ácido hipocloroso são responsáveis ​​por danos oxidativos às células, lipídios, proteínas, e DNA, levando à aterosclerose, carcinogênese, doenças cardiovasculares, envelhecimento celular, inflamação crônica, diabetes, hipertensão, mutagênese, neurodegeneração, artrite reumatóide, acidente vascular cerebral, choque séptico e outras doenças degenerativas [7,14-17]. Os antioxidantes previnem a oxidação de proteínas e a geração de ROS e RNS que podem reduzir os danos dos radicais livres aos tecidos normais, combatendo o estresse oxidativo [17-19].

A pele produz um pigmento escuro conhecido como melanina. A produção de melanina previne a pele de danos induzidos por UV [9]. No entanto, a superprodução e o acúmulo de melanina causam hiperpigmentação cutânea, levando a complicações estéticas como melasma, sardas, lentigos senis, nevos e efélis [9,20]. A tirosinase é uma glicoproteína encontrada nas membranas dos melanossomos que são responsáveis ​​pela biossíntese da melanina pela hidroxilação da l-tirosinase a 3,4-diidroxifenilalanina (l-DOPA) e subsequente oxidação da l-DOPA a dopaquinona [21]. Devido à polimerização espontânea, a dopaquinona é finalmente convertida em melanina [22]. A melanina produzida em excesso deve ser controlada para manter a integridade da pele. É por isso que a descoberta de novos inibidores da tirosinase para o desenvolvimento de formulações cosmecêuticas tem recebido um interesse significativo [23-25].

Conservantes antimicrobianos são adicionados aos produtos cosméticos para manter a pureza microbiológica durante todo o período de suas aplicações. Em vez de usar conservantes cosméticos, como o metilparabeno, compostos antimicrobianos naturais com outras funções são melhores e mais benéficos para a saúde humana [27-29]. Os metabólitos secundários isolados de recursos bacterianos podem ter propriedades conservantes e antimicrobianas que inibem a colonização de patógenos bacterianos (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus) na pele [9,26,28].

Compostos bioativos produzidos por bactérias do solo ou marinhas, especialmente actinobactérias, são inexplorados e ainda inexplorados [23,30]. Vários compostos bioativos que são aplicáveis ​​na indústria cosmecêutica e cosmética, incluindo aqueles com propriedades antienvelhecimento, antioxidantes, anti-tirosinase, antimicrobianas e não citotóxicas, têm grande potencial para novos usos.

Existem inúmeros estudos sobre materiais bioativos isolados de plantas que são atualmente usados ​​em formulações cosmecêuticas, mas muito poucos estudos sobre materiais bioativos de bactérias estão disponíveis [9,21,24–27,31]. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial cosmecêutico de extratos de acetato de etila da cepa bacteriana Streptomyces sp. T65 para atividades antioxidantes, antienvelhecimento, anti-tirosinase e antibacterianas e quaisquer efeitos citotóxicos em diferentes linhagens celulares de camundongos e humanos. Além disso, buscou-se sintetizar partículas de sílica mesoporosas. Por fim, o objetivo principal deste estudo foi desenvolver o produto cosmético final para aplicação tópica utilizando material bioativo extraído de microrganismos do solo.

2. Materiais e métodos

2.1. Reagentes, Linhas Celulares e Equipamentos

Todos os solventes utilizados eram de grau analítico. B16-linha celular de melanoma F10, linha celular de melanoma de camundongo B16-F1 e linha celular de queratinócitos humanos (HaCaT) foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), penicilina-estreptomicina e soro fetal bovino inativado pelo calor (HI FBS) foram adquiridos da Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Seul, Coreia do Sul). O Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8) foi adquirido da Dojindo (Kumamoto, Japão). Uma linha celular de macrófagos de camundongo RAW264.7 e fibroblastos humanos CCD{10}}Sk foram adquiridos do Korean Cell Line Bank (Seul, Coreia do Sul). Lipopolissacarídeo (LPS, Escherichia coli, sorotipo O11:B4), sulfanilamida, dicloridrato de naftil etilenodiamina, tirosinase de cogumelo, elastase pancreática suína, l-tirosina, ácido ascórbico, arbutina, N-Succ-(Ala)3-p-nitroanilida , 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio (MTT), colágeno tipo I, Tween 20, tetrametilbenzidina (TMB ), tetraetil orto-silicato (TEOS), plurônico P-123 (poli(etilenoglicol)-bloco-poli(propilenoglicol)-bloco-poli(etilenoglicol); PEG-PPG-PEG) e -melanócito -hormônio estimulante (-MSH) foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e ácido oleanólico foram adquiridos da Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O anticorpo primário COL1A1 (Colágeno, tipo I, alfa 1) e o anticorpo secundário conjugado com HRP (Peroxidase de rábano) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Um leitor de microplacas SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) foi usado para 96-leitura de placas de poços.

2.2. Cepas Bacterianas Patogênicas

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 e Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 foram adquiridos da Korean Agriculture Culture Collection (KACC, Jeonju, Coreia do Sul); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 e Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 foram obtidos do Korea Environmental Microorganisms Bank (KEMB, Suwon South Korea); e Propionibacterium acnes KCTC 3314 foi adquirido da Colecção Coreana para Culturas Tipo (KCTC, Jeongeup, Coreia do Sul).

2.3. Isolamento e Preservação

Diferentes amostras de solo foram coletadas de pastagens recuperadas em Hwaseong (37◦16′10" N 126◦45′43" E) e floresta da Universidade Kyonggi (37◦18′1" N 127◦2′20" E) na Coréia. As bactérias foram isoladas usando um método previamente descrito [9]. As colônias foram semeadas em placas R2A a cada 1 semana para preservação a curto prazo e armazenadas a -80 ◦C como uma suspensão em caldo R2A suplementado com 20 por cento (v/v) de glicerol para preservação a longo prazo.

2.4. Triagem, Identificação e Posição Filogenética de Cepas Isoladas

A triagem para atividades cosméticas e antimicrobianas de cepas isoladas foi concluída conforme descrito anteriormente [9]. Bactérias com funções foram identificadas usando o sequenciamento do gene 16S rRNA. O DNA genômico das cepas foi extraído usando um kit InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), e o gene 16S rRNA foi amplificado por PCR usando o primer bacteriano universal 27F e 1492R [32]. O produto de PCR foi purificado com uma placa de filtro multiscreen (Millipore Corp., Bedford, MA, EUA) e foi sequenciado com um analisador de DNA Applied Biosystems 3770XL usando um kit de sequenciamento de ciclo BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Uma sequência quase completa compatível com o software SeqMan (DNASTAR Inc., Madison, WI, EUA). A cepa mais próxima de cepas funcionais isoladas foi identificada usando EzBioCloud [33] e o banco de dados NCBI GenBank [34]. As sequências de rRNA 16S relacionadas foram obtidas do GenBank e a análise filogenética foi realizada usando MEGA7 [35].

2.5. Cultura de Bactérias

P. acnes foi cultivado por incubação a 37 ◦C por 3-4 dias anaerobicamente em caldo anaeróbio Schaedler (Oxoid). Para a cultura anaeróbica, foi utilizado frasco anaeróbio BBL com GasPak EZ Gas Generating Container System (Becton Dickinson, NJ, EUA). S. epidermidis e S. aureus foram cultivados em meio TSB (Tryptic soy caldo) (Oxoid) a 37 ◦C por 24 h aerobicamente. E. coli, P. aeruginosa e B. subtilis foram cultivadas em meio LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Cepas bacterianas isoladas foram cultivadas em R2A a 28 ◦C por 4-5 dias.

2.6. Fermentação

Para o processo de fermentação, o inóculo foi preparado em caldo R2A a 28 ◦C por 4 a 5 dias às 150 horas. A cepa T65 foi fermentada usando 1-2 por cento de inóculo em meio ISP2 (International Streptomyces Project 2) a 28 ◦C por 1 semana às 140 horas.

2.7. Extração

O caldo de cultura colhido foi centrifugado a 11.305 × g por 20 min a 4 ◦C com uma centrífuga de grande capacidade de 1736R (LABOGENE, Seul, Coréia). O sobrenadante da cultura foi filtrado com papel de filtro de tamanho de 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, Reino Unido) para eliminar detritos celulares e concentrado com um evaporador rotativo a 40 ◦C. O produto bruto concentrado foi então extraído duas vezes com igual volume usando cinco solventes diferentes (n-hexano, éter dietílico, diclorometano, clorofórmio e acetato de etila). O acetato de etila foi considerado o melhor solvente, e análises adicionais foram realizadas usando extrato de acetato de etila. A camada orgânica foi separada por um funil de separação e evaporada até a secura. Finalmente, o produto bruto seco foi dissolvido em metanol para posterior avaliação.

extrato de cistache

2.8. Coleta de Frações Ativas por HPLC Preparativa (Prep-HPLC)

As frações ativas do extrato bruto da cultura de T65 foram coletadas usando HPLC preparativa (série Agilent 1200). A coluna reversa Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 (30 mm id × 25 cm) com um tamanho de partícula de 15 μm foi usada como fase estacionária. Para a fase móvel, foram utilizados 0,1 por cento de água HCHOOH (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A concentração do solvente B foi de 10 por cento a 100 por cento de 0 min a 60 min e 100 por cento de 60 min a 75 min. A taxa de fluxo foi de 15 mL/min. O detector de múltiplas ondas (MWD) foi usado com 208, 230, 254 e 280 nm. As frações coletadas de 14 min a 21 min foram evaporadas até a secura e dissolvidas em metanol (produto bruto T65) para avaliação adicional.

2.9. Viabilidade celular da célula HaCaT

A viabilidade celular das células HaCaT foi determinada com um ensaio CCK-8 (Cell Counting Kit-8) de acordo com as instruções do fabricante. As células HaCaT foram semeadas em 96-placas de poços a 104 células por poço e depois incubadas a 37 ◦C por 24 h em meio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (FBS). As células foram tratadas com diferentes concentrações de produto bruto T65 (10 mg/mL, 1 mg/mL, 100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/ml e 1 ng/mL) e incubadas à temperatura ambiente por 2 h em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2 com a adição de 10 μL de reagente CCK-8. A absorbância da mistura de reação foi medida com um espectrofotômetro de microplaca a 450 nm e a porcentagem de viabilidade celular foi calculada.

2.10. Avaliação das Atividades Antioxidantes

2.10.1. Avaliação da Toxicidade em Células RAW264.7

As células RAW264.7 foram mantidas em DMEM contendo 1{13}} por cento de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina a 37 ◦C em uma incubadora de CO2 a 5%. As células RAW264.7 foram semeadas em uma 96-placa de microtitulação de fundo plano com uma densidade de 104 células por poço com diferentes concentrações (0-1 mg/mL) de produto bruto T65 e incubadas a 37 ◦C por 24 h em uma incubadora de 5 por cento de CO2. Após 24 h de incubação, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 190 μL de meio fresco e 10 μL de solução de trabalho MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço, e a placa foi então incubada em 37 ◦C por 4 h em uma incubadora de 5 por cento de CO2. Em seguida, o sobrenadante foi removido e os cristais de formazan formados foram solubilizados pela adição de 150 μL de DMSO (dimetilsulfóxido) em cada poço por 10 min a 37 ◦C em uma incubadora de 5% de CO2. A intensidade dos cristais de formazan dissolvidos foi quantificada usando um leitor de microplacas a 570 nm.

2.10.2. Determinação de Óxido Nítrico

As células RAW264.7 (105 células/mL) foram pré-tratadas com várias concentrações de produto bruto T65 (15,5-125 ug/mL) por 30 min, seguido de estimulação com 1 ug/mL de LPS por 24 h. A concentração de NO liberado das células foi determinada pelo reagente de Griess usando a curva padrão de NO2– [36]. Cem microlitros de sobrenadante de cultura foram incubados com 100 μL de reagente de Griess (mistura de dicloridrato de N-1-naftil etilenodiamina (NEDHC) e sulfanilamida) à temperatura ambiente por 20 min no escuro. A absorvância foi medida a 540 nm.

2.10.3. Ensaio de eliminação de radicais livres DPPH

As atividades de eliminação de radicais livres de DPPH foram conduzidas de acordo com um método previamente descrito [9]. O produto bruto do extrato de cultura T65 foi diluído para concentrações 600, 200, 100, 20 e 4 ug/mL em metanol. A mistura de reação de 180 μL foi feita com 90 μL de 0,1 mM DPPH (dissolvido em MeOH) e 90 μL de soluções de amostra de diferentes concentrações (Tabela S1). As reações de teste foram misturadas completamente em 96-placas de poços, incubadas a 37 ◦C por 30 min, e a absorção foi medida a 516 nm com um espectrofotômetro. A porcentagem de inibição de DPPH foi calculada da seguinte forma:

Inibição ( por cento )=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

onde ODexp é a absorbância da amostra experimental; ODcon é a absorbância do controle; ODstd, a absorbância do padrão; e ODbln, a absorbância do branco.

2.11. Avaliação de atividades antienvelhecimento

2.11.1. Avaliação da citotoxicidade em CCD-986células Sk

A citotoxicidade celular de várias concentrações (0–1 mg/mL) do produto bruto T65 em células de fibroblastos da pele humana (CCD-986Sk) foi determinada pelo ensaio MTT conforme descrito anteriormente para o ensaio MTT de RAW264.7 células.

2.11.2. Proliferação de fibroblastos humanos usando CCD-986células Sk

A proliferação de células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foi determinada em células CCD{{0}}Sk usando um ensaio CCK-8. CCD-986Células Sk foram semeadas em 96-placas de poço a 5 × 103 células/poço e depois incubadas a 37 ◦C por 24 h em DMEM contendo 10 por cento de FBS. As células foram tratadas com diferentes concentrações de produto bruto T65 (0–1 mg/mL) e incubadas à temperatura ambiente por 2 h em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2 com a adição de 10 μL de reagente CCK-8. A absorvância da mistura reaccional foi medida com um leitor de microplacas a 450 nm e a percentagem de células viáveis ​​foi determinada em comparação com a absorvância das células não tratadas.

Cistanche é anti-envelhecimento.

2.11.3. Ensaio de Síntese de Colágeno Tipo I

A síntese de colágeno tipo I foi testada por um ensaio imunoenzimático (ELISA). CCD-986As células Sk foram semeadas em 96-placas de poço a uma densidade de 5 × 103 células/poço em DMEM contendo 10 por cento de FBS e incubadas a 37 ◦ C por 24 horas. Várias concentrações de produto bruto T65 (31,25-25{{30}} pg/mL) foram adicionadas em um meio livre de FBS por 24 h. Em seguida, 100 μL de meio de cultura e colágeno tipo I foram adicionados em placas de 96-poços revestidas de colágeno e incubadas a 37 ◦C por 24, 48 e 72 h. Cada poço foi lavado com 0,05 por cento de solução salina tamponada com fosfato com 0,1 por cento de Tween 20 (PBST) e o anticorpo primário COL1A1 foi adicionado e incubado por 1 h. Novamente, os poços foram lavados com 0,05 por cento de PBST e um anticorpo secundário conjugado com HRP (peroxidase de rábano) foi adicionado e incubado por 1 h. Cada poço foi lavado com 0,05 por cento de PBST e foi adicionado TMB (tetrametilbenzidina). Após obter a intensidade de cor desejada (azul), a reação foi encerrada pela adição de 0,5N de H2SO4, que tornou a cor da solução amarela. A absorbância foi medida a 450 nm com um leitor de microplacas e a produção de colágeno tipo I foi determinada.

2.11.4. Ensaio de Inibição da Elastase

As atividades de inibição da elastase pancreática suína (PPE) foram testadas de acordo com um procedimento descrito anteriormente [9]. O produto bruto T65 foi diluído para concentrações de 30{{10}}0, 1000, 500 e 100 ug/mL em metanol. A mistura de reação foi preparada com tampão Tris-HCl 0,2 M (pH 8,0), N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilida (SANA) 0,5 mM como substrato, elastase pancreática suína (3,5 U/mL em tampão Tris-HCl 0,2 M; pH 8,0) e o inibidor (amostra). Cada amostra foi pré-incubada a 37 ◦C por 15 min, e a mistura de reação total foi incubada a 37 ◦C por 20 min. A absorção foi medida a 400 nm. A mistura de reação total de 150 μL foi preparada conforme mostrado na Tabela S2. As concentrações finais da amostra na mistura de reação foram 300, 100, 50 e 10 ug/mL. A porcentagem de inibição de PPE foi calculada usando a Fórmula (1).

2.12. Avaliação das Atividades de Clareamento

2.12.1. Avaliação da citotoxicidade em células B16F1

A citotoxicidade do produto bruto T65 para células de melanoma B16F1 foi determinada por um ensaio MTT. As células B16F1 foram semeadas em 96-placas de poços a 104 células por poço e depois incubadas a 37 ◦C por 24 h em DMEM contendo 10% de FBS. As células foram tratadas com diferentes concentrações de produto bruto T65 (0-1 mg/mL) e incubadas à temperatura ambiente por 2 h em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2. A absorbância da mistura de reação foi medida com um espectrofotômetro de microplaca a 450 nm e a porcentagem de viabilidade celular foi calculada.

2.12.2. Inibição da síntese de melanina em células B16F10

As células B16F10 foram pré-tratadas com -MSH em 6-placas de poços a 105 células por poço e incubadas a 37 ◦C por 24 h em DMEM contendo 10% de FBS para promover a síntese de melanina. As células foram incubadas com várias concentrações de produto bruto T65 (31,25-125 ug/mL) e 100 ug/mL de arbutina como controle positivo na presença ou ausência de -MSH por 48 h. A inibição da síntese de melanina em células de melanoma B16F10 foi observada.

Cistanche inibe a formação de melanina.

2.12.3. Ensaio de Inibição de Tirosinase de Cogumelo

As atividades de inibição da tirosinase do cogumelo foram determinadas como descrito anteriormente [9]. O produto bruto T65 foi diluído para concentrações de 3000, 1000, 500 e 100 ug/mL em metanol. A mistura de reação foi preparada com 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 6,8), 3 mM de solução de l-tirosina [dissolvida em DW (água destilada)] e 2000 U/mL de tirosinase de cogumelo (dissolvida em 0,05 M de tampão de fosfato de potássio, pH 6,8 ; Sigma) em 96-placas de poço. A mistura de teste total de 150 μL (120 μL de tampão fosfato, 10 μL de l-tirosina, 15 μL de solução de amostra e 5 μL de tirosinase de cogumelo; Tabela S3) foi incubada a 37 ◦C por 10 min e a absorção foi medida a 475 nm. As concentrações finais da amostra na mistura de reação foram 300, 100, 50 e 10 ug/mL. O padrão estava sem a solução de amostra, o controle sem l-tirosina e o branco sem l-tirosina e a solução de amostra. A porcentagem de inibição da tirosinase foi calculada pela aplicação da Fórmula (1).

2.13. Análise de aminoácidos

O aminoácido livre do produto bruto T65 foi determinado pelo método GC-FID (cromatografia gasosa – detector de ionização de chama) no Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Para o método GC-FID, a máquina utilizada foi uma Agilent 6890N GC-FID; coluna, ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); temperatura da peça de injeção, 250 ◦C; coluna de injeção, 2 μL; proporção de divisão, 5:1; condição de temperatura, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detector, FID @ 320 ◦C; transportador, azoto gasoso, 1,5 mL/min; fabricante, Phenomenex; padrão de aminoácidos; e concentração, 200 μmol/L.

Os aminoácidos compostos do produto bruto T65 foram determinados pelo método GC-FID (cromatografia gasosa – detector de ionização de chama) no Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Para GC-FID, a máquina utilizada foi uma Agilent 6890N GC-FID; coluna, ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); temperatura da peça de injeção, 250 ◦C; coluna de injeção, 2 μL; proporção de divisão, 5:1; condição de temperatura, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detector, FID @ 320 ◦C; transportador, azoto gasoso, 1,5 mL/min; fabricante, Phenomenex; padrão de aminoácidos; e concentração, 200 μmol/L.

2.14. Ácido Graxo

O ácido graxo do produto bruto T65 foi determinado pelo método GC-FID (cromatografia gasosa – detector de ionização de chama) no Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Para GC-FID, a máquina utilizada foi Agilent 6890N GC-FID; coluna, Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 μm); temperatura da peça de injeção, 250 ◦C; coluna de injeção, 1 μL; razão de divisão, 50:1; condição de temperatura, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); detector, FID @ 285 ◦C; transportador, azoto gasoso, 0,8 mL/min; fabricante, SUPELCO 37 Componente FAME Mix; e concentração, 0,5 mg/mL.

2.15. Atividades antimicrobianas

A inibição de bactérias patogênicas foi realizada pelo método de difusão em disco. Cem microlitros de cultura de P. acnes a 108 UFC (unidade formadora de colônia)/mL foram espalhados e incubados a 35 ◦C anaerobicamente por 2-3 dias em placas de ágar Schaedler juntamente com um disco de 6 mm (Whatman) contendo 15 ug de extrato bruto dissolvido em metanol, e as zonas de inibição foram medidas. Da mesma forma, 100 μL de S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli e P. aeruginosa a 108 UFC/mL foram espalhados e incubados a 35 ◦C aerobicamente em placas R2A ou LBA por 1-2 dias e as zonas de inibição foram medidas.

2.16. Síntese de Partículas de Sílica Mesoporosa

O polímero indutor de estrutura foi dissolvido em água desionizada para preparar uma solução micelar. Materiais de sílica mesoporosa foram sintetizados de acordo com os métodos descritos na literatura [37]. Para a síntese de partículas de sílica mesoporosa (SBA-15), 10 g de Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, EUA), foi dissolvido em 55 mL de HCl 2 M, seguido de agitação em ambiente temperatura por 30 minutos. Além disso, 22 g de tetraetilortossilicato (TEOS) foram adicionados à solução e posteriormente agitados por 30 min e colocados a 36 ◦C por 24 h e depois levados à estufa, onde a temperatura foi mantida a 100 ◦C, e foi deixado para 4 dias sob a condição estática. Após 4 dias, a solução mudou para uma solução turva no frasco. A solução turva foi filtrada com as duas camadas de papel de filtro de celulose e lavada com EtOH (duas vezes) e água DI (desionizada) (duas vezes). O pó filtrado resultante foi seco no forno de convecção a 120 ◦C e colocado no forno mufla (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Seul, Coréia do Sul). Seis amostras foram sintetizadas com as mesmas condições, mas em um lote diferente. Micrografias eletrônicas de transmissão (TEM) de SBA sintetizado-15 foram tiradas na Universidade Nacional de Seul por microscopia eletrônica de transmissão (Talos L120C; FEI).

2.17. BET Análise de Área de Superfície

O tamanho das partículas de sílica foi medido pelo Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Reino Unido). Para a preparação da amostra da análise BET (Brunauer-Emmett-Teller), 5 g de P-123 foram adicionados a 76 g de HCl 2M e agitados a 250 rpm por 24 h. Após 24 h, quando P-123 foi completamente dissolvido, 160 mL de água DI (deionizada) e TEOS foram adicionados uniformemente (15 mL/min) e agitados a 750 rpm por 24 h. Em seguida, o pó formado foi separado por filtração e o pó separado foi colocado em um dedal e lavado com Soxhlet por 24 h. Em seguida, foi lavado com água DI e queimado em forno mufla (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Coreia do Sul). As análises de área de superfície BET foram realizadas para confirmar o desempenho do pó produzido pela síntese de SBA{14}}. As análises BET foram concluídas pela Universidade de Inha e pela Universidade Nacional de Changwon.

O analisador de sorção de gás (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, EUA) foi empregado para examinar a área de superfície e as distribuições de tamanho de poro de materiais de sílica mesoporosa preparados. As distribuições de área de superfície e tamanho de poro foram calculadas usando o software ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, EUA) com base em isotermas de adsorção-dessorção. As partículas sintetizadas primitivas foram desgaseificadas a 300 ◦C/3h, então as isotermas de adsorção e dessorção de N2 foram medidas a uma temperatura de -196 ◦C. A análise multiponto BET foi aplicada para o cálculo da área de superfície total.

2.18. Avaliação de sustentabilidade

Para confirmar a presença de T65 em SBA incorporado-15, o seguinte desempenho foi realizado da seguinte forma: 12 g de SBA-15 e 1,2 g de produto bruto T65 foram misturados em 500 mL de acetonitrila. A solução foi agitada por 18 h sob 30 ◦C. Após filtração, a mistura foi filtrada e as partículas filtradas foram secas em estufa de convecção a 100 ◦C. Para encontrar a própria partícula de T65 em SBA-15, 1 g de T65 seco incorporado em SBA-15 foi dissolvido em acetonitrila e 25 mL de ácido fluorídrico 3 M foram adicionados. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 h até a solução ficar límpida. Em seguida, a solução foi filtrada e a solução filtrada foi usada como amostra. As amostras obtidas das experiências anteriores foram analisadas por HPLC.

Para determinar a propriedade de liberação controlada, 35 mL de SBA incorporado-15 foram despejados em 50 mL de óleo mineral (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e bem misturados. Em seguida, 50 mL de água DI foram adicionados à mistura e agitados em temperatura ambiente por 6 h, e então deixados na mesa por 12 h. Quando a camada líquida foi separada, a camada de água foi descartada e 1 mL de camada de óleo foi coletado como amostra para análise de HPLC. A mesma experiência foi repetida no segundo e terceiro dia e a amostra foi novamente analisada por HPLC.

2.19. Formulação e Aplicação Cosmética

2.19.1. Formulação e Teste de Estabilidade

Um produto cosmético foi formulado a partir de um creme tipo emulsificante. A estabilidade da formulação cosmética foi determinada mantendo o produto cosmético em várias temperaturas (37, 45 e 60 ◦C), inclusive no freezer, geladeira e em temperatura ambiente por até 28 dias. A estabilidade do creme cosmético foi observada na primeira, segunda, terceira e quarta semanas.

2.19.2. Ensaios Clínicos, Voluntários e Métodos de Aplicação

Creme cosmético funcional contendo produto bruto T65 foi aplicado a 21 voluntárias do sexo feminino para determinação da melhora das rugas e eficácia do clareamento através da rugosidade e brilho da pele. Todos os procedimentos experimentais para envolvimento humano para este estudo foram aprovados pelo Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes individuais. Os testes foram realizados antes da aplicação do produto, após 2 semanas e após 4 semanas. Aproximadamente 5 mg de produto cosmético foi aplicado duas vezes ao dia (manhã e noite) no rosto após a limpeza do rosto, e foi espalhado suavemente de acordo com a textura da pele. Os voluntários não foram autorizados a usar quaisquer outros cremes ou produtos 1 semana antes do ensaio e durante o ensaio.

2.19.3. Métodos de captura e processamento de imagens

As fotos foram capturadas pelo VISIA-CR. A rugosidade das imagens foi analisada pelo software PRIMOS (PRIMOS versão 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, EUA). A rugosidade média (Ra) e a profundidade de rugosidade máxima (Rmax) foram calculadas usando a seguinte fórmula:

Taxa de Ra ou Rmax ( por cento )=(valor antes do tratamento − valor após o tratamento)/valor antes do tratamento × 100 (2)

O brilho das imagens foi analisado pelo Chromameter CR-400. L* é o parâmetro de brilho e é medido pela seguinte fórmula:

L* taxa crescente ( por cento )=(valor antes do tratamento − valor após o tratamento)/valor antes do tratamento × 100 (3)

2.20. Análise estatística

Os cálculos estatísticos do valor IC50 foram realizados pelo software estatístico OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA). Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata e todos os resultados foram apresentados como média ± SD de três experimentos separados. Os dados foram analisados ​​por análise de variância de uma via do teste t de amostra independente (ANOVA de uma via), seguida pelo teste post-hoc de Tukey usando OriginPro 8.5. As diferenças foram consideradas significativas em p <>

3. Resultados e Discussões

3.1. Isolamento, Seleção e Filogenia de Cepas Ativas Selecionadas

Um total de 2.285 cepas de bactérias foram isoladas das amostras de solo coletadas. Os resultados da triagem mostraram que 102 cepas de bactérias tinham funções aplicáveis ​​aos cosmecêuticos (Tabela S4). Com base na triagem primária, Streptomyces sp. Descobriu-se que o T65 possui atividades mais altas para todas as aplicações cosméticas, ou seja, atividades antioxidantes, anti-elastase, anti-tirosinase e antimicrobianas. Por fim, a cepa T65 foi escolhida para posterior avaliação para identificar sua potencial aplicação em cosmecêuticos. A análise filogenética mostrou que a cepa T65 formou um clado com Streptomyces bungoensis DSM 41781T (a cepa mais próxima com base na sequência do gene 16S rRNA) com um forte valor de bootstrap (Figura S1).

3.2. Detecção e Coleta de Material Bioativo

Materiais bioativos misturados de extrato de cultura de acetato de etil T65 foram coletados de Prep-HPLC. Materiais bioativos foram medidos em 208, 230, 254 e 280 nm por detectores. As frações foram coletadas com base no tempo (de 14 min a 21 min). As frações coletadas foram evaporadas até a secura e dissolvidas em metanol (produto bruto T65) e foram utilizadas para todas as avaliações, incluindo atividades antimicrobianas.

3.3. Citotoxicidade na célula HaCaT

A viabilidade celular na linha celular de queratinócitos humanos (célula HaCaT) permaneceu inalterada pelo produto bruto T65 até 10 mg/mL. Por outro lado, a viabilidade celular aumentou de forma dose-dependente quando foram aplicadas concentrações de 10 ng/mL a 10 mg/mL do produto T65 bruto (Figura S2). Essa faixa de concentração resultou em mais de 100 por cento de viabilidade celular, indicando que promoveu a proliferação de células HaCaT e, portanto, não foi tóxica para a linhagem celular HaCaT.

3.4. Atividades antioxidantes

3.4.1. Citotoxicidade na célula RAW264.7

A citotoxicidade do produto bruto T65 foi avaliada pela viabilidade celular em macrófagos RAW264.7 pelo método de ensaio MTT. O produto bruto T65 não apresentou efeito citotóxico em linhagens celulares RAW264.7.

Pelo contrário, o produto bruto T65 ajudou a proliferar células RAW264.7 de maneira dose-dependente quando tratado com 13,5 a 1{13}}00 ug/mL. Quando se utilizou 1000 ug/mL de produto bruto T65, a viabilidade celular das células RAW264.7 foi de 118,7 por cento (p < 0,05).="" esses="" resultados="" mostraram="" que="" o="" composto="" bruto="" t65="" foi="" atóxico="" até="" 1="" mg/ml="" e="" pode="" ser="" utilizado="" em="" formulações="">

3.4.2. Inibição da Produção de Óxido Nítrico (NO)

O reagente de Griess foi usado para determinar os níveis de NO. Para determinar a inibição de NO, RAW264.7as células foram tratadas com 1 ug/mL de LPS (lipopolissacarídeo) juntamente com várias concentrações de produto bruto T65. As células RAW264.7 foram ativadas por LPS e a produção de NO foi medida como concentração de nitrito no meio de cultura. Comparado ao LPS sozinho, o produto bruto T65 inibiu significativamente (p <{5}},001) a="" concentração="" de="" nitrito="" nas="" células="" raw264.7="" estimuladas="" por="" lps="" de="" uma="" maneira="" dependente="" da="" concentração="" quando="" usado="" de="" 15,5="" a="" 125="" ug/ml="" (figura="" 2).="" os="" macrófagos="" foram="" a="" expressão="" do="" tipo="" lps-toll="" da="" sintase="" de="" no="" induzível="" (inos)="" por="" sinalização="" da="" ativação="" celular="" via="" receptores="" [38].="" o="" lps="" é="" um="" ativador="" de="" macrófagos="" e="" desempenha="" um="" papel="" importante="" na="" produção="" de="" no="" em="" células="" de="" mamíferos.="" o="" no="" é="" um="" radical="" livre="" produzido="" por="" células="" imunocompetentes="" como="" os="" macrófagos="" [40].="" a="" produção="" de="" no="" tem="" um="" efeito="" fagocitário="" nos="" macrófagos.="" assim,="" a="" linhagem="" celular="" de="" macrófagos="" raw264.7="" foi="" selecionada="" para="" ensaio="" antioxidante.="" por="" muito="" tempo,="" considerável="" atenção="" tem="" sido="" dada="" à="" busca="" de="" antioxidantes="" naturais="" para="" inibir="" a="" produção="" de="" no="" [41].="" a="" 125="" ug/ml,="" o="" produto="" bruto="" t65="" diminuiu="" suficientemente="" os="" níveis="" de="" no="" em="" 57,4="" por="" cento="" em="" comparação="" com="" o="" no="" produzido="" por="" 1="" ug/ml="" de="" lps.="" com="" base="" na="" inibição="" do="" no="" produzido="" na="" linhagem="" celular="" de="" macrófagos="" raw264.7="" induzida="" por="" lps,="" o="" extrato="" de="" cultura="" t65="" pode="" ser="" considerado="" um="" potente="">

DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges em diferentes concentrações e valor de IC50 do produto bruto T65 são dados na Tabela S5. O ácido ascórbico (vitamina C) foi usado como padrão porque é usado em loções, cremes, soros e adesivos, que são bem conhecidos por terem poderosas atividades antioxidantes para aplicações tópicas [42]. IC50 para atividades de eliminação de radicais DPPH para produtos secundários de vitamina C e T65 foram encontrados em 5,01 e 6,31 ug/mL, respectivamente (Figura 3).

Existem apenas alguns estudos sobre as atividades antioxidantes de isolados bacterianos em comparação com os de materiais vegetais e a maioria dos estudos se concentrou em produtos vegetais bem estabelecidos [43-49]. Uma concentração de 10 ug/mL de produto foi capaz de eliminar 68,66 ± 2,83 por cento do radical livre de DPPH. A CI50 do produto bruto T65 foi quase comparável à do antioxidante mais forte vitamina C, o que mostrou que pode ser utilizado como agente antioxidante na formulação de cosmecêuticos.

3.5.1. Citotoxicidade em CCD-986Células Sk

A citotoxicidade de compostos brutos de T65 em células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foi avaliada na linha celular CCD-986Sk usando o ensaio MTT. Quando a concentração do produto bruto T65 de 0 a 1 mg/mL foi fornecida, as células HDF proliferaram de maneira dose-dependente até a concentração de 500 ug/mL. Este resultado mostrou que os compostos brutos de T65 eram não citotóxicos para células HDF. No entanto, uma concentração de mais de 1 mg/mL foi considerada citotóxica e apenas 81,34 por cento das células sobreviveram em comparação com o controle (Figura 4).

3.5.2. Proliferação de HDF

A proliferação de células HDF foi determinada usando a linha celular CCD{{0}}Sk. O produto bruto T65 proliferou as células HDF de uma maneira dependente da concentração de 0 a 500 ug/mL (Figura 5). No entanto, foi citotóxico na concentração de 1 mg/mL. O crescimento de células epiteliais dérmicas humanas confirmou a capacidade de melhora das rugas através da mudança nas células cultivadas primárias isoladas de células dérmicas humanas e colágeno secretado [50,51].

3.5.3. Síntese de colágeno tipo I

A síntese de colágeno tipo I foi detectada por ELISA. O produto bruto de T65 a 250 pg/mL aumentou a concentração de colágeno tipo I de maneira dose-dependente até 145,91 por cento ± 9,11 por cento (média ± SD; média de 24, 48 e 72 h). O resultado de três experimentos em 24, 48 e 72 h mostrou a síntese de colágeno tipo I (Figura 6). Assim, a secreção de colágeno pelas células dérmicas acompanhada pelo crescimento de células epiteliais dérmicas humanas confirmou a capacidade de melhora das rugas dos compostos T65.

3.6. Atividades de clareamento

3.6.1. Citotoxicidade em células B16F1

O resultado da citotoxicidade do produto bruto T65 em células de melanoma B16F1 pelo ensaio MTT é mostrado na Figura 8. O resultado da incubação do produto bruto T65 em células B16F1 mostrou efeitos não tóxicos de até 1 mg/mL de concentração. As células B16F1 proliferaram de maneira dose-dependente até uma concentração de 62,5 ug/mL, mas uma diminuição significativa (p <{14}}.05) dependente="" da="" dose="" na="" viabilidade="" celular="" foi="" avaliada="" de="" 125="" para="" 1000="" ug/ml.="" no="" entanto,="" na="" concentração="" de="" 1="" mg/ml,="" foram="" observados="" 99,12="" por="" cento="" ±="" 4,16="" por="" cento="" de="" células="" viáveis="" ​​(figura="" 8).="" os="" resultados="" experimentais="" mostraram="" que="" o="" extrato="" de="" acetato="" de="" etila="" da="" cultura="" da="" cepa="" t65="" foi="" não="" citotóxico="" para="" a="" linhagem="" celular="" de="" melanoma="" b16f1="" e="" pode="" ser="" utilizado="" na="" formulação="" de="" produtos="" cosméticos="" para="" clareamento="" da="" pele="">

3.6.2. Inibição da síntese de melanina em células B16F10

Para confirmação do efeito clareador, células B16F10, linhagem celular que secreta e produzmelanina nas células. Para promover a síntese de melanina, B16F10 foi suplementado com 1 ug de -MSH. Arbutin (100 ug/mL; um agente clareador comercializado) foi usado como controle positivo. A observação microscópica deste experimento mostrou inibição quase completa da melanina pela aplicação de 125 ug/mL de extrato de cultura T65 em 48 h (Figura 9A, B). Este experimento comprovou que o extrato de cultura T65 tem potencial para inibir a síntese de melanina de forma dose-dependente e pode ser usado como agente clareador para a formulação de produtos cosméticos para aplicações tópicas.

3.7. Materiais de Sílica Mesoporosa

O material mesoporoso é um material que contém poros com um diâmetro de 2 a 50 nm de acordo com a nomenclatura IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) e, portanto, o material de sílica mesoporosa é um material de sílica que possui poros de 2 a 50 nm de diâmetro. Este material foi relatado na década de 1970 primeiramente em patentes dos EUA, mas não foi bem notado nas áreas relacionadas, e assim material similar foi pesquisado e sintetizado independentemente pelo Japão novamente em 1990 [69]. Pesquisas mais detalhadas foram seguidas pelos Laboratórios Mobil Corporation, que denominaram este material MCM (Mobil crystalline material), com exemplos como MCM-41 ou MCM-48, cujo diâmetro do mesoporo varia de 2 a 6 nm [70,71]. Outro grupo de pesquisa da Universidade da Califórnia, em Santa Bárbara, conseguiu sintetizar uma sílica mesoporosa de tamanho de poro maior (5-30 nm) 6 anos depois, e a denominou SBA (material amorfo de Santa Bárbara)-15 [72] . O material de sílica mesoporo foi projetado inicialmente para ser usado como uma peneira molecular devido ao seu próprio caráter estrutural, mas recentemente encontrou uma ampla gama de aplicações em entrega de drogas, catalisador, biossensor, armazenamento de energia e assim por diante.

Existem várias diferenças nos materiais mesoporosos SBA-15 e MCM-41. No entanto, a maneira mais simples de distinguir esses dois é a espessura da parede de sílica. O SBA-15 com uma parede de sílica mais espessa tem uma estrutura mais estável e rígida em comparação com o MCM-41, que tem uma espessura de parede mais fina. Além disso, o método sintético de SBA-15 é mais simples que o de MCM-41. Devido a essas diferenças, o SBA-15 foi selecionado para transportar o produto bruto bioativo T65 dentro do mesoporo do material de sílica.

3.8. Síntese de Partículas de Sílica Mesoporosa

Após o processo de calcinação ter sido realizado a 200 ◦C por 2 h e 600 ◦C por 3 h continuamente, obteve-se o pó mesoporoso de sílica branca resultante. SBA-15 de poros de 8 nm foram sintetizados neste processo. Os tamanhos de partículas de SBA-15 foram encontrados em 11,539–13,630 mm de diâmetro (Figura S4) e foram determinados por duas instalações diferentes: o Laboratório da Universidade de Inha e o Laboratório da Universidade Nacional de Changwon. Além disso, todas as seis amostras na Figura S4 foram sintetizadas pelo mesmo método, mas em um lote diferente.

Quando a mistura foi mantida a 60 ◦C e deixada por 4 dias em condições estáticas seguindo o método acima, SBA-15 de poro de 5 nm foi conhecido. Além disso, quando a temperatura foi controlada em 120 ◦C, SBA-15 de 10 nm foi sintetizado. De acordo com os resultados, o tamanho do mesoporo pode ser controlado dependendo do processo de envelhecimento [73]. SBA-15 de poro de 10 nm (Figura 11) foi usado para processamento adicional porque nanomateriais de sílica mesoporosa de poro grande têm melhores ações de entrega para biomoléculas do que o poro estreito [74].

3.9. Avaliação de Desempenho Sustentável

Para determinar se o SBA mesoporoso-15 tem uma capacidade de liberação controlada, SBA-15 e o produto bruto T65 foram combinados em água DI, metanol, acetonitrila ou solvente de etileno glicol. Quando SBA-15 e água foram misturados, a solução tornou-se uma pasta devido à coagulação entre a superfície da sílica e a água. O metanol foi um bom solvente tanto para a sílica quanto para o produto bruto T65. No entanto, devido à toxicidade, o metanol foi substituído por acetonitrila. As partículas para a razão de imersão de T65 foram determinadas pelo valor de PV (Tabela S13). Conforme mostrado na Tabela S13, o valor de PV de SBA-15 diminuiu após a imersão com o produto bruto T65. Isso mostrou que os materiais T65 estavam bem imersos dentro das partículas de sílica mesoporosas.

Para determinar se havia T65 dentro da partícula, o próprio T65 foi investigado por HPLC (Figura S5). Como mostram os dados, houve dois picos específicos (dentro da caixa vermelha) que sempre foram visíveis no caso dos extratos de cultura de T65, mesmo que o lote de preparação de T65 tenha sido alterado. Esses dois picos tiveram tempos de retenção de 10 min e 12 min a 230 nm. A amostra do filtrado foi investigada em HPLC para determinar se T65 estava presente dentro do SBA incorporado-15. Conforme mostrado na Figura S6, dois picos específicos foram observados perto de 10 min e 12 min. Além disso, um pequeno pico foi observado próximo a 18 min de tempo de retenção, o que é muito importante para rastrear os produtos de T65 que são liberados no tempo.

A Figura 12 representa a liberação controlada do teste sustentável do SBA incorporado ao T65-15 de 0 a 3 dias. O pico específico de T65 foi visível próximo a 15 e 20 min dos dias 0 a 3. Os produtos brutos de T65 foram devidamente imersos e foram gradualmente secretados ao longo do tempo. Além disso, os materiais mesoporosos de sílica (SBA-15) propostos neste estudo podem transportar substâncias fisiologicamente ativas no produto bruto T65 e confirmaram que as substâncias fisiologicamente ativas foram liberadas de forma sustentada após o carregamento. Além disso, o material mesoporoso de sílica proposto neste estudo poderá, no futuro, ser utilizado como um bom carreador para impregnar diversos materiais funcionais e como material de liberação sustentada por suportar várias substâncias fisiologicamente ativas.

4. Conclusões

Materiais bioativos secundários extraídos de microrganismos do solo são de interesse para aplicações cosméticas devido às suas atividades antimicrobiana, antioxidante, antirrugas, clareadora da pele e antimicrobiana. Este estudo descreve a nova atividade do extrato de acetato de etila da cultura da cepa T65 para os ingredientes funcionais em formulações cosméticas. O produto bruto T65 não foi tóxico para as diferentes linhagens celulares, como HaCaT (queratinócitos humanos), RAW264.7 (células de macrófagos), CCD-986Sk (células de fibroblastos de pele humana) e células de melanoma B16F1 e B16F10 . Além disso, o produto bruto T65 apresentou regulação positiva da síntese de colágeno tipo I, o que é muito importante para a redução de rugas na pele. Além disso, o produto bruto T65 inibiu suficientemente as bactérias patogênicas humanas, como B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus e S. epidermidis, o que pode ajudar a prevenir a deterioração do produto cosmético e a colonização de bactérias patogênicas formando acne vulgar na pele humana. Além disso, o produto bruto T65 inibiu a tirosinase de cogumelo para efeito clareador e elastase pancreática suína para atividades antienvelhecimento, e inibiu NO e radicais DPPH para atividades antioxidantes. A síntese de partículas de sílica mesoporosas, SBA-15, provou que o produto bruto T65 seria eficaz nas formulações cosmecêuticas com propriedades de liberação controlada eficazes. Por fim, a aplicação in vivo do produto cosmético formulado juntamente com o produto bruto T65 nas faces dos voluntários comprovou o efeito clareador e antirrugas do T65. No entanto, a química de diferentes compostos bioativos e os mecanismos moleculares relacionados às diferentes atividades de inibição enzimática e de inibição de patógenos ainda precisam ser descobertos. Em conclusão, nosso estudo apoiou fortemente a ideia de que recursos bacterianos podem ser adicionados a produtos cosméticos aplicados topicamente para efeito clareador, formação de rugas, efeito antioxidante e atividades antimicrobianas.

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