Determinação de equinacosídeo em extrato aquoso de Cistanche Herba por HPLC

Resumo:

Objetivo Um método de HPLC foi estabelecido paradeterminação de equinacósidonoextrato aquoso de Cistancheerva.

Métodos O equinacósido foi determinado por HPLC. A separação foi realizada na coluna Inertsil ODS-SP C18 com fase móvel composta por acetonitrila(A)e solução de ácido fosfórico 0,4%(B), por eluição gradiente. O comprimento de onda de detecção foi ajustado em 333 nm e a temperatura da coluna foi de 30 graus. A vazão foi de 1,0 mL·min-1 e o volume de injeção foi de 10 μL. Resultados A relação linear do equinacosídeo dentro da faixa de concentração de 44,939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 foi boa(r=0.999 8). As recuperações foram de 94,59%-105,31% (RSD= 2,93%,n=9). O conteúdo de equinacosídeo nos extratos aquosos de Cistanche herba foi de 15.527,7,347,12,267 mg·g-1. Conclusão O método de HPLC estabelecido com boa repetibilidade é preciso, simples e viável. É adequado para a determinação de equinacosídeo no extrato aquoso de Cistanche herba.

Palavras-chave:HPLC;extrato aquoso de Cistanche herba; equinacósido; determinação do conteúdo

Cistanche deserticola é um tônico da medicina tradicional chinesa comumente usado na prática clínica e é conhecido como "ginseng do deserto" [1]. A Cistanche deserticola registrada na edição de 2015 da Farmacopeia Chinesa é o caule carnudo seco com folhas escamosas de Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. É quente, doce e salgado e retorna aos meridianos dos rins e do intestino grosso. Tem os efeitos de nutrir o yang do rim, reabastecer a essência e o sangue e hidratar os intestinos e laxantes [2]. "A Matéria Médica de Shen Nong" diz que pode "tonificar o meio, nutrir os cinco órgãos internos, fortalecer o yin e nutrir a essência". Cistanche deserticola contém principalmente glicosídeos feniletanóides, iridóides e seus glicosídeos, lignanas e seus glicosídeos, polissacarídeos, compostos de éster e alcalóides [3]. Os glicosídeos feniletanol são os principais ingredientes ativos da Cistanche deserticola. Entre eles, o equinacosídeo e o verbascosídeo estão listados em Cistanche deserticola na Farmacopeia Chinesa.

Componentes indicativos para identificação e determinação de conteúdo. Estudos farmacológicos [4] mostram que Cistanche deserticola tem vários efeitos farmacológicos, como laxante, proteção hepática, anti-osteoporose, antioxidante, anti-envelhecimento e anti-fadiga. O extrato aquoso de Cistanche deserticola pode promover a expressão do gene da proteína morfogenética óssea 2 em osteoblastos de ratos, fosfatase ácida resistente ao tartarato, osteocalcina no soro de camundongos ovariectomizados e genes Smad1, mad5, fator de crescimento transformador, etc. , tem efeitos anti-osteoporose [5-6].

A equinácea pode promover a proliferação de osteoblastos e promover a diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea cultivadas in vitro em osteoblastos [7-9]. Nos últimos anos, tem havido muitos relatórios de pesquisa sobre a determinação do conteúdo de equinacosídeo e verbascosídeo no extrato etanólico de Cistanche deserticola e suas preparações compostas [10-12], mas há poucos relatórios sobre a determinação do conteúdo dos componentes do índice em Cistanche deserticola extrato aquoso. Neste estudo, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi utilizada para determinar o teor de equinácea no extrato aquoso de Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instrumentos

LC-20AT cromatografia líquida de alto desempenho, SPD{2}}detector A, SIL-20amostrador automático A, CTO-10forno de coluna ASvp, estação de trabalho de cromatografia líquida em solução LC, Shimadzu Corporation of Japão; Balança analítica eletrônica MES125P-OCE-DU, Sartorius Company, Alemanha; Bomba de vácuo multifuncional de água circulante SHZ-D (Ⅲ), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistema de circulação de resfriamento de evaporador rotativo RC2B SO25, evaporador rotativo RV 10 D S96, IKA Company, Alemanha; DK-S26

Banho-maria elétrico de temperatura constante, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Máquina de água ultrapura série UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiais medicinais e reagentes

O material medicinal Cistanche deserticola foi adquirido da Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., número de lote: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, farmacêutico tradicional chinês chefe do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, identificou-o como o caule carnudo seco com folhas escamosas de Cistanche deserticola YCMa. A amostra é armazenada na Sala de Testes de Drogas do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou; Substância de referência Echinacea Glycoside, conteúdo 89,7%, Instituto Chinês de Controle de Alimentos e Medicamentos, número de lote: 111670-

201706; o acetonitrilo é cromatograficamente puro (Merck, Alemanha); metanol e ácido fosfórico são analiticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); a água é água ultrapura.

2 Métodos e resultados

2.1 Preparação do extrato aquoso de Cistanche deserticola

Pegue o pó grosso do material medicinal Cistanche deserticola, adicione 10 vezes a quantidade de água destilada, aqueça e refluxe para extração duas vezes, 1 hora de cada vez, filtre, combine o filtrado e concentre o filtrado com um evaporador rotativo até um conteúdo bruto de droga de 0,100 g·mL-1 e armazená-lo a 4 graus para uso posterior.

2.2 Condições cromatográficas e adequação do sistema

Coluna cromatográfica: coluna Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvel: acetonitrila (A) -0 solução de ácido fosfórico 0,4% (B), eluição gradiente: 0 ~ 5 min, 17%

UM; 5 ~ 25 min, 20% A; 25~30 min, 17% de A; comprimento de onda de detecção: 333 nm; temperatura da coluna: 30 graus; vazão: 1,0 mL·min-1;

Volume de injeção: 10 μL. Sob estas condições cromatográficas, a separação entre o equinacosídeo e os picos dos componentes adjacentes é superior a 1,5, e o número de placas teóricas com base no pico do equinaceasídeo não deve ser inferior a 4,000. O cromatograma é mostrado na Figura 1.

2.3 Preparação da solução

2.3.1 Solução da substância de referência Pesar uma quantidade apropriada de substância de referência equinacosídeo, pesá-la com precisão, colocá-la em um balão volumétrico de 10 mL, adicionar metanol para dissolvê-la e preparar uma solução da substância de referência contendo 898,794 ug de equinaceasídeo por ml, 4 graus Guarde para uso posterior.

2.3.2 Solução de teste

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evapore até a secura em banho-maria, adicione metanol para dissolver, dilua até o volume em um balão volumétrico de 10 mL, agite bem e filtre com uma membrana microporosa de 0,22 μm para obter.

2.4 Investigação da relação linear

Meça com precisão {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 mL da solução de referência do item 2.3.1, colocar em um balão volumétrico de 5 mL, adicionar metanol para completar o volume e agitar bem para obter um gradiente de concentração de 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 solução de referência, filtrada através de membrana microporosa de 0,22 μm. Medir de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registrar a área do pico. Realize a regressão linear com a concentração de massa da substância de referência como a abcissa (X, ug·mL-1) e a área do pico como a ordenada (Y), e a equação de regressão é obtida: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Os resultados mostram que a equinácea tem uma boa relação linear dentro da faixa de concentração de 44,939 7 ~ 539,276 4 ug·mL-1.

2.5 Teste de precisão

Pegue 539.276 4 ug ·mL- 1 de solução de referência, injete e meça 6 vezes continuamente de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Os resultados mostraram que o RSD da área do pico do equinacosídeo foi de 1,81%, indicando boa precisão do instrumento.

2.6 Teste de estabilidade

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evapore até a secura em banho-maria, adicione metanol para dissolver, dilua para um balão volumétrico de 10 mL, agite bem, filtre com um {{ 7}} membrana microporosa de 0,22 μm, seguir as condições cromatográficas do item 2.2 e colocar em 0 e 2 respectivamente. , 4, 8, 12, 24 h de medição de injeção, registre a área de pico. Os resultados mostraram que o RSD da área do pico do equinacosídeo foi de 1,16%, indicando que a solução de teste apresentou boa estabilidade em 24 horas.

2.7 Teste de repetibilidade

Meça com precisão 2,0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola e prepare 6 soluções de teste em paralelo de acordo com o método em 2.3.2. Injete amostras para medição de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Os resultados mostraram que o RSD doequinacósidoa concentração mássica foi de 1,28%, indicando boa repetibilidade do método.

2.8 Teste de recuperação de amostra

Meça com precisão 9 porções de 1,0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, adicione 0,8, 1,0 e 1,2 mL de solução de referência (1,552 mg·mL{{11 }}) respectivamente, evaporar até a secura em banho-maria, adicionar metanol para dissolver e ajustar para um balão volumétrico de 10 mL; Agite bem e filtre através de uma membrana microporosa de 0,22 μm para preparar soluções de teste de alta, média e baixa concentração. Prepare 3 cópias de cada concentração em paralelo. Medir de acordo com as condições cromatográficas em 2.2. Registre a área do pico e calcule a recuperação da amostra. Avaliar. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

2.9 Determinação do conteúdo da amostra

Medir com precisão 3 porções de 2,0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evaporar até a secura em banho-maria, adicionar metanol para dissolver, diluir para um balão volumétrico de 10 mL, agitar bem, filtrar com uma membrana microporosa de 0,22 μm e medir de acordo com as condições cromatográficas em 2.2. Registre a área do pico e calcule o conteúdo de equinácea. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 1 Resultados dos testes de recuperação do equinacosídeo

Tabela 2 Resultados da determinação do teor de equinacosídeo no extrato aquoso de Cistanche herba