Determinação de Equinacosídeo em Extrato Aquático de Cistanche Herba por HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Terceira Faculdade de Medicina Clínica da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, Cantão 510405 Guangdong, China; 2. Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou,Cantão 510378 Guangdong,China） 

Abstrato: Objetivo Um método de HPLC foi estabelecido para a determinação deEchinacosideem extrato aquoso de Cistanche deserticola. MétodosO equinacósido foi determinado por HPLC. A separação foi realizada em Inertsil ODSSP C18 coluna com fase móvel consistia em acetonitrila（A）e 0 solução de ácido fosfórico a 4 por cento（B）,por eluição gradiente. O comprimento de onda de detecção foi definido em 333 nm,e a temperatura da coluna era de 30 graus. A taxa de fluxo foi de 1,0 mL·min-1 e o volume de injeção foi de 10 μL.ResultadosA relação linear de equinacosídeo dentro da faixa de concentração de 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 foi bom（r = 0.999 8）. As recuperações foram de 94,59 por cento -105,31 por cento（RSD= 2,93 por cento,n = 9）. O conteúdo de equinacosídeo nos extratos aquosos de Cistanche herba foi de 15.527,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Conclusão: O método HPLC estabelecido com boa repetibilidade é preciso,simples e viável. É adequado para a determinação de equinacosídeo em extrato aquoso deCistanche deserticola ma. 

Palavras-chave:HPLC;extrato de água deCistanche deserticola;Echinacoside;determinação de conteúdo

Cistanche deserticolaé um tônico comumente usado na medicina tradicional chinesa na prática clínica e tem a reputação de "ginseng do deserto". O Cistanche deserticola incluído na edição de 2015 da Farmacopeia Chinesa é o caule seco, escamoso e carnudo da planta Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Tem natureza quente, sabor doce e salgado e pertence aos meridianos dos rins e do intestino grosso. Tem os efeitos de tonificar o yang do rim, beneficiando a essência e o sangue, umedecendo os intestinos e aliviando a constipação. [2]. 

Ginseng do deserto

O "Shennong Materia Medica Classic" afirma que pode "nutrir o meio, nutrir os cinco órgãos internos e fortalecer o yin e nutrir a essência".Cistanche deserticola contém principalmente glicosídeos feniletanóides, iridóides e glicosídeos, lignanas e glicosídeos, polissacarídeos, ésteres e alcalóides [3].glicosídeos de feniletanolsão os principais componentes ativosCistanche deserticola, entre os quais echinacea e poolside são os componentes indicadores para a identificação e determinação do conteúdo de Cistanche deserticola na Farmacopeia Chinesa. 

O feniletanol glicosídeo é o principal componente ativo da Cistanche deserticola

Estudos farmacológicos [4] indicam que Cistanche deserticolatem vários efeitos farmacológicos, como umedecer os intestinos e aliviar a constipação, proteger o fígado, resistir à osteoporose, antioxidante, antienvelhecimento e antifadiga. O extrato aquoso deCistanche deserticolapode promover os genes da proteína morfogenética óssea 2 de osteoblastos em ratos, bem como a fosfatase ácida resistente ao tartarato e a osteocalcina no soro de camundongos ovariectomizados, bem como os genes Smad1 e Smad5 e fatores de crescimento transformadores na medula óssea- A expressão de, etc., tem umefeito anti-osteoporose [5-6]. Equinosídeo pode promover a proliferação de osteoblastos e promover a diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea em osteoblastos in vitro[7-9]. 

Equinosídeo, o principal componente químico da Cistanche deserticola

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Nos últimos anos, tem havido muitos relatórios sobre a determinação do conteúdo de echinacoside e poolside no extrato alcoólico de Cistanche deserticola e suas preparações compostas [10-12], mas há poucos relatórios sobre a determinação do conteúdo de componentes indicadores no extrato aquoso de Cistanche deserticola. Neste estudo, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi usada para determinar o conteúdo de equinacosídeo no extrato aquoso de Cistanche deserticola.

1. Material

1.1 Aparelho

LC-20AT cromatografia líquida de alto desempenho, SPD-20Um detector, SIL-20Um amostrador automático, CTO-10ASvp caixa de temperatura da coluna, estação de trabalho de cromatografia líquida LCsolution, Shimadzu Corporation do Japão; Balança Analítica Eletrônica MES125P-OCE-DU, Sartorius, Alemanha; Bomba de vácuo multifuncional de circulação de água SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 sistema de circulação de resfriamento do evaporador rotativo, evaporador rotativo RV10DS96, IKA, Alemanha; Banho de água termostático elétrico DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Máquina de água ultrapura da série UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiais Medicinais e Reagentes

Material medicinal Meat Rong, adquirido da Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., número do lote: 18010011806001, 181001. Os caules carnudos, escamosos e secos da planta Leobaceae Cistanche deserticola identificados pelo Herbalista Chinês Chefe Tu Xingming da Terceira Afiliada Hospital da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guangzhou são armazenados na Sala de Inspeção de Medicamentos do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guangzhou; Substância de referência Echinoside, conteúdo 89,7 por cento, Instituto Chinês para o Controle de Alimentos e Controle de Drogas, número do lote: 111670-201706; O acetonitrilo é cromatograficamente puro (Merck, Alemanha); Metanol e ácido fosfórico são analiticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Água é água ultrapura.

2. Métodos e Resultados

2.1 Preparação do Extrato Aquático de Cistanche deserticola

Levar acistanche em pó, adicione 10 vezes a quantidade de água destilada, aqueça e refogue para extrair duas vezes, cada vez por 1 hora. Filtrar, combinar o filtrado e usar um evaporador rotativo para concentrar o filtrado até um teor bruto de droga de 0,100 g · mL-1. Armazene a 4 graus para o modo de espera. 2.2 Condições cromatográficas e adequação do sistema Coluna cromatográfica: coluna InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μ m）; Fase móvel: acetonitrila (A) - 0 solução de ácido fosfórico a 4 por cento (B), gradiente de eluição: 0~ 5min, 17% A; 5~25min,20% A; 25~30min,17% A; Comprimento de onda de detecção: 333nm; Temperatura da coluna: 30 graus; Vazão: 1,0mL · min-1; Volume de injeção: 10 μ L. Nesta condição cromatográfica, a resolução entre os picos de equinácea e componentes adjacentes é maior que 1,5, e o número teórico de colunas não deve ser inferior a 4.000 para picos de equinácea. O cromatograma é mostrado na Figura 1.

Figura 1 Cromatogramas de HPLC de equinacosídeo (A) e extrato aquoso de Cistanche herba (B)

2.3 Preparação da solução

2.3.1 Solução de referência

Pesar uma quantidade adequada deEchinacetinasubstância de referência, pese-a com precisão, coloque-a em um balão volumétrico de 10 mL, adicione metanol para dissolver e faça com que contenha 898,794 Echinacetin por mililitro μ G da solução de referência, armazenada a 4 graus em espera.

Equinósido de Cistanche deserticola

2.3.2 Solução de teste

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evapore em banho-maria, dissolva em metanol, leve a um volume constante em um balão volumétrico de 10 mL, agite bem, 0,22 μ M microporoso filtração por membrana, ou seja.

2.4 Investigação de uma relação linear

Medir com precisão {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, e 3.00 mL da solução de referência em 2.3.1 e coloque-os em um balão volumétrico de 5 mL, adicione metanol a um volume constante e agite bem para obter concentrações de gradiente de 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970 , e 539,2764 μ G · mL-1 da solução de referência, 0,22 μ M de filtração por membrana microporosa. Realize a determinação de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Usando a concentração de massa da substância de referência como a abcissa (X, μ G · mL-1), a área do pico é a ordenada (Y) e a equação de regressão linear é obtida: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Os resultados mostraram que a echinacea variou de 44,9397 a 539,2764 μ. A relação linear dentro da faixa de concentração de g · mL-1 é boa.

2.5 Teste de precisão

Tome 539,2764 μ G · mL-1 solução de referência, injete a amostra continuamente 6 vezes de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Resultados O RSD da área do pico da echinacea foi de 1,81%, indicando boa precisão do instrumento.

2.6 Teste de estabilidade

Meça com precisão 2.0 mL deCistanche deserticolaextrato aquoso, evaporar até a secura em banho-maria, dissolver em metanol, levar a um volume constante em um balão volumétrico de 10 mL, agitar bem, 0.22 μ Filtrar com uma membrana microporosa, injetar amostras para determinação em 0, 2, 4, 8, 12 e 24 horas de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Resultados O RSD da área do pico da echinacea foi de 1,16%, indicando que a solução de teste apresentou boa estabilidade em 24 horas.

2.7 Teste de repetibilidade

Meça com precisão 6 porções de 2,0 mL aquosoextrato de Cistanche deserticola, preparar 6 porções da solução de teste em paralelo de acordo com o método descrito em 2.3.2, injetar amostras para determinação de acordo com as condições cromatográficas descritas em 2.2 e registrar a área do pico. Resultados O RSD da concentração em massa de echinacea foi de 1,28 por cento, indicando que o método teve boa repetibilidade.

Experiência de Cistanche deserticola

2.8 Teste de Recuperação de Adição de Amostra

Meça com precisão 9 porções de 1.0 mL deCistanche deserticolaextrato aquoso, adicionar {{0}}.8, 1.0 e 1,2 mL da solução de referência (101,552 mg · mL - 1), evaporar em banho-maria, dissolver em metanol e completar o volume em balão volumétrico de mL; Agite bem, filtro de 0,22 μ com membrana de filtro microporoso m para preparar a solução de teste de concentração alta, média e baixa. Prepare 3 partes de cada concentração em paralelo, meça de acordo com as condições cromatográficas em 2.2, registre a área do pico e calcule a recuperação do vício da amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

2.9 Determinação do conteúdo da amostra

Meça com precisão 3 porções de 2.0mLextrato de água de Cistanche deserticola, evaporar até a secura em banho-maria, dissolver em metanol, levar a volume constante em balão volumétrico de 10mL, agitar bem, 0,22 μ Filtrar com membrana microporosa, medir de acordo com as condições cromatográficas em 2.2, registre a área do pico e calcule o conteúdo de echinacea. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 1 Resultados dos testes de recuperação de equinacosídeo

Tabela 2 Resultados da determinação do teor de equinacosídeo no extrato aquoso de Cistanche herba

3.Discussão

3.1 Método de preparação do artigo de teste

O extrato aquoso deCistanche deserticolacontém vários componentes químicos, como glicosídeos de fenil etanol e polissacarídeos, que causam certa interferência nos componentes a serem testados. Este estudo investigou duas concentrações diferentes de solventes, 50 por cento de metanol e metanol. Os resultados mostraram que o efeito de separação dos picos no cromatograma do produto de teste usando 50% de metanol como solvente foi fraco entre a echinacea e os componentes adjacentes; Usando metanol como solvente, a resolução do pico do glicosídeo da echinacea é boa e não há interferência de outros picos de impurezas. Portanto, o metanol foi selecionado como solvente para a solução de teste. Usando metanol como solvente, o extrato aquoso de Cistanche deserticola foi evaporado até a secura em banho-maria. Dois métodos de tratamento foram usados: dissolução de metanol, agitação de volume constante e dissolução ultrassônica de metanol (10 min). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre os dois métodos. Este método foi escolhido para preparar a solução de teste devido à operação simples de dissolução do metanol e agitação a volume constante.

erva chinesa cistanche

3.2 Seleção da fase móvel

Neste estudo, foi feita referência à fase móvel (metanol-0,1 por cento de ácido fórmico) usada para a determinação do conteúdo de Cistanche deserticola na Farmacopeia Chinesa (Volume I) (2015). Os resultados mostraram que o pico do glicosídeo de echinacea aumentou e houve um fenômeno de borda de ataque, que pode estar relacionado à fraca capacidade de eluição da fase móvel; Referindo-se à literatura relevante [12-13], acetonitrila-0.5 por cento de ácido acético foi usado como a fase móvel, mas a forma do pico da echinacea era ruim e havia um fenômeno de cauda. Considerando o valor de pH da fase móvel, acetonitrila-0,4 por cento de ácido fosfórico foi finalmente usado como fase móvel. Como resultado, o número teórico de placas de picos de equinácea foi superior a 4000 e a resolução entre a equinácea e os picos de componentes adjacentes foi superior a 1,5. A forma do pico era simétrica, sem interferência de picos de impurezas, e a linha de base era estável. Portanto, neste estudo, acetonitrila - 00,4 por cento de ácido fosfórico foi usado como a fase móvel cromatográfica para a determinação do teor de echinacea. Neste estudo,o método de HPLC foi usado para determinar o extrato aquoso de Echinacea em Cistanche deserticola.

Extrato de cistanche em pó

O método é simples, preciso e reprodutível. É adequado para a determinação de echinacea no extrato aquoso de cistanche deserticola e pode ser usado como um método de controle de qualidade para o extrato aquoso de cistanche deserticola.Este estudo determinou apenas o teor de echinacea no extrato aquoso de Cistanche deserticola.No futuro,planeja-se determinar o conteúdo de echinacea na decocção composta de Cistanche deserticola para explorar o impacto de vários fatores no conteúdo de echinacea, fornecendo uma referência para o controle de qualidade da decocção contendo Cistanche deserticola.

referência:

[1] Zhong Ping Desert ginseng e cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Comissão Nacional de Farmacopéia Farmacopéia da República Popular da China (Parte I) [M] Pequim: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al Progresso da pesquisa em Cistanche deserticola [J] Drug Evaluation Study, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian Avanços na pesquisa farmacológica sobre Cistanche deserticola [J] Medicina Tradicional Chinesa de Guangming, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Efeito do extrato aquoso de cistanche deserticola na expressão gênica da proteína morfogenética óssea 2 em osteoblastos de ratos [J] China AnimalManejo e Medicina Veterinária, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H,YU F,TONG Z,et al. Extrato aquoso de ervas Cistanches afetando os níveis de expressão de mRNA Smad1, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA e TIEG1 mRNA sérico e da medula óssea na doença de osteoporose [J]. Relatórios de Biologia Molecular, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming, et al Observação sobre Equinosídeo Promovendo a Proliferação de Osteoblastos de Rato Ativando ERK/BMP-2 Caminho do Sinal [J] Fórum Médico de Base, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Estudo Tian Yuan sobre a diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea em osteoblastos induzidos por equinasídeo e seu mecanismo [D] Shenyang: Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan, etc. Estudo sobre a diferenciação induzida por equinosídeos de células-tronco mesenquimais da medula óssea em osteoblastos [J] Farmacologia e Clínica da Medicina Tradicional Chinesa, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al Determinação de equinosídeo e pilósido em micropó de Cistanche deserticola por HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, et al Determinação Simultânea de Equinosídeo, Pilosídeo e Isopilosídeo em Cápsulas de Glicosídeo Cistanche Total por HPLC [J] Ciência e Tecnologia Mundial - Modernização da Medicina Tradicional Chinesa, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Estudos farmacodinâmicos e metabonômicos sobre os efeitos anti-osteoporose de Cistanche deserticola e seus componentes eficazes [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan, et al Determinação de Equinosídeo e Pilosídeo em Qirong Runchang Oral Liquid por Cromatografia Líquida de Alta Performance [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892