A exclusão de Alox15 melhora a disfunção renal e inibe a fibrose pelo aumento de PGD2 no rim
Mar 12, 2022
CISTANCHE VAI MELHORAR A INFECÇÃO RENAL/RENAL
Introdução
Os ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) e seus metabólitos estão ligados à inflamação e sua resolução em vários órgãos [1]. As oxilipinas, que são produzidas pela oxidação de PUFA, são importantes para a atividade biológica de PUFA como mediadores lipídicos [1, 2]. A biossíntese de oxilipinas é mediada por várias enzimas, como lipoxigenase (LOX), ciclooxigenase (COX) e citocromo P450 (CYP) [3]. Essas enzimas produzem vários metabólitos lipídicos, como prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas, que estão fortemente envolvidos na regulação da inflamação [1, 4]. Por exemplo, ALOX15, um subtipo principal de LOX, tem um duplo aspecto de propriedades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias através de seus metabólitos [5]: ALOX15 é altamente expresso em eosinófilos, células epiteliais broncoalveolares e macrófagos alveolares em condições não patológicas [5, 6 ], e promove a gravidade da asma [7], lesão pulmonar [8] e insuficiência cardíaca [9], enquanto neutraliza a inflamação na artrite [10] e cérebro isquêmico [11]. Além disso, os mediadores lipídicos e suas enzimas afetam a fibrose do órgão, bem como a inflamação. Mediadores lipídicos específicos estão envolvidos na patogênese da fibrose pulmonar [12], hepática [13] e cardíaca [14]. Da mesma forma, o ALOX15 acima mencionado também está ligado à patogênese da fibrose, como a fibrose dérmica [15].
Uma das doenças crônicas comuns é crônica doenca renal(DRC), que afeta aproximadamente 8-16 por cento da população geral em todos os estágios combinados [16]. Embora a patogênese da DRC seja complexa e varie de acordo com a doença de base, arimtecido geralmente se torna disfuncional, levando ao estágio finalinsuficiência renalcausada por inflamação crônica e fibrose subsequente [17]. Como mencionado, os mediadores lipídicos derivados de PUFAs estão fortemente ligados à inflamação e sua fibrose resultante. Por exemplo, lipoxinas e resolvinas inibem a fibrose renal [18, 19], mas esses efeitos ainda não foram examinados no modelo de DRC com comprometimentofunção renal.Além disso, perfis lipidômicos abrangentes na DRCrimtecidos ainda não são relatados. Assim, o papel das enzimas metabólicas lipídicas e seus produtos na patogênese da DRC permanece pouco compreendidoEste estudo teve como objetivo elucidar o envolvimento de enzimas metabolizadoras de ácidos graxos e seus produtos narenalcomprometimento de 5/6 camundongos modelo CKD nefrectomizados (Nx). Este estudo revelou que os níveis de transcrição e expressão proteica de Alox15 estavam aumentados na DRCrins, e os camundongos Alox15−/− demonstraram melhorarimdisfunção e fibrose no modelo de DRC. Além disso, PGD2, que é o metabólito lipídico aumentado na DRCrinsde camundongos Alox15-/-, inibiu a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células tubulares proximais cultivadas. Portanto, a inibição de Alox15 e/ou administração de PGD2 pode ser um novo alvo terapêutico para DRC e fibrose.
Palavras-chave:doença renal crônica; Lipoxigenase; ALOX15; Lipidômica mediadora; Ácidos graxos poliinsaturados; renal
CISTANCHE VAI MELHORAR A FUNÇÃO RENAL/RENAL
Materiais e métodos
Animais e experimentosEste estudo usou 8-camundongos machos C57BL/6 J de uma semana (CLEA Japan), que foram aclimatados por 1 semana antes de todos os experimentos serem realizados. Além disso, camundongos Alox15-/- foram gerados no fundo C57BL/6 J (Jackson Laboratory), e o modelo 5/6 Nx foi estabelecido de acordo com um estudo anterior [20]. Coletamos amostras de sangue para avaliação defunção renalerimamostras de tecido para immunoblotting e reação em cadeia da polimerase em 8 semanas após 5/6 Nx, e para análise histológica em 40 semanas após 5/6 Nx. Todos os experimentos estavam em conformidade com as diretrizes para pesquisa animal da TMDU, e o Comitê de Cuidados e Uso de Animais da TMDU aprovou nosso protocolo de estudo (número de aprovação: A2019-117C4).
Lipidômica mediadora baseada em LC–MS/MSConduzimos a análise LC-MS/MS conforme descrito anteriormente [21, 22]. Os detalhes do procedimento são descritos em Métodos Suplementares,Outros métodos experimentaisDescrevemos outros métodos experimentais em Métodos Suplementares.
Resultados
O nível de mRNA de Alox15 aumentou em 5/6 Nx rimAs mudanças quantitativas das enzimas oxilipinas na DRCrimforam investigados aplicando camundongos C57BL/6 para operação simulada ou 5/6 Nx como descrito anteriormente [20]. Para analisar a expressão das principais enzimas oxilipinas expressas no rim (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 e Cyp2c44) [23, 24], extraímosrimamostras. Entre as enzimas, Alox15 em 5/6 Nxrinstinha um nível de mRNA significativamente elevado (P=0.0004) em comparação com o de shamrins(Figura 1). Por outro lado, os níveis de mRNA das outras enzimas principais não mudaram significativamente neste modelo de DRC.
O nível de proteína de Alox15 foi aumentado nas células tubulares proximais renaisEm 5/6 Nxrins, os níveis de proteína ALOX15 também foram aumentados (P=0.0078), conforme esperado pelo aumento dos níveis de transcrição (Fig. 2a). Para determinar quais tipos de células aumentaram o nível de proteína Alox15 na DRCrim,examinamos a localização do mRNA Alox15 por hibridização in situ. A hibridização in situ para mRNA revelou que o alto nível de expressão de Alox15 estava localizado emrenalcélulas tubulares no modelo 5/6 Nx, mas não nos glomérulos (Fig. 2b). As características histológicas sugeriram que o mRNA de Alox15 foi fortemente expresso nos túbulos proximais.
Os camundongos Alox15−/− foram resistentes a danos renais e fibrose no modelo 5/6 NxEm 5/6 Nx CKDrins, os níveis de expressão transcricional e proteica de ALOX15 foram elevados. Portanto, investigamos se e como ALOX15 desempenha um papel na DRC em termos derimdisfunção e fibrose renal. Para isso, camundongos Alox15−/− foram aplicados ao modelo 5/6 Nx CKD. Curiosamente, os níveis séricos de Cre e nitrogênio ureico no sangue (BUN) foram mais baixos em camundongos Alox15−/− 5/6 Nx
do que aqueles em camundongos de tipo selvagem (WT) (Fig. 3a), indicando que a depleção de Alox15 mostrou um efeito protetor na patogênese da DRC. Assim, NGAL (umdano renalmarcador) a expressão da proteína foi suprimida em camundongos Alox15-/- em comparação com a de camundongos WT (Fig. 3b). Além disso, o mouse Alox15−/−rinsmostraram níveis reduzidos de mRNA de Col1a1, Fn e Acta2 (SMA) (Fig. 3c), e também mostraram diminuição da expressão de fibronectina e proteína SMA (Fig. 3d). Além disso, o mouse Alox15−/−rinsexibiram alterações fibróticas intersticiais claramente suprimidas mostradas na coloração tricrômica de Masson (Fig. 3e). Portanto, a deleção de Alox15 melhorarimdisfunção e fibrose no modelo animal de DRC.
A lipidômica mediadora revelou metabolismo alterado de PUFA em rins Alox15-/- CKDConforme mencionado na seção Introdução deste artigo, os efeitos biológicos do Alox15 estão relacionados aos mediadores lipídicos gerados pelo Alox15. Elucidar o perfil dos metabólitos lipídicos produzidos pelo Alox15 na DRCrim,examinamos e comparamos o sham e 5/6 Nxrimamostras por lipidômica de mediador baseada em LC-MS/MS para determinar os perfis de mediadores lipídicos entre camundongos WT e camundongos Alox15-/- CKD (Tabela Suplementar 1). A Tabela 1 mostra os metabólitos lipídicos que foram significativamente diferentes entre os camundongos Alox15 plus/plus e Alox15−/− sob condição de 5/6 Nx. Além disso, fizemos mapas de vias de mediadores lipídicos com classificação por seus substratos e suas enzimas metabolizadoras (Fig. 4). Uma série de metabólitos de PUFA derivados de Alox, como 14-HDoHE, 17-HDoHE e 15-HEPA [5, 25–27], foi significativamente aumentado em modelos de DRC correlacionados bem ao aumento do nível de expressão de ALOX15 norins (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">rinsem comparação com aqueles em rins WT CKD, enquanto apenas PGD2 foi significativamente aumentado em rins Alox15-/- CKD (Fig. 6).
PGD2 suprimiu EMT em células renais cultivadasOs efeitos dos metabólitos lipídicos que foram significativamente diferentes entre os camundongos Alox15 plus/plus e Alox15−/− sob condição 5/6 Nx foram examinados pela administração desses lipídios às células NRK-52E que foram ativadas pela citocina pró-fibrótica TGF - 1. Avaliamos a expressão de mRNA de Cola1a e Acta2 (SMA) em resposta a TGF- 1 para determinar os efeitos desses lipídios em cultura (Fig. 7a). Entre eles, o PGD2 conferiu um potente efeito antifibrótico nas células NRK-52E em resposta ao TGF- 1. O efeito supressor de PGD2 na expressão de COL1A1 e SMA foi dose-dependente com EC50 de 7,12 μM e 6,48 μM, respectivamente (Fig. 7b). Além disso, realizamos os mesmos experimentos em células HK-2, que são células epiteliais do túbulo proximal imortalizadas de humanos adultos normaisrins,e encontraram um resultado semelhante, ou seja, inibição de COL1A1 e SMA de maneira dose-dependente, em resposta ao tratamento com PGD2 (Fig. 7c). Portanto, níveis aumentados de PGD2 em Alox15−/− CKDrinspode contribuir para os efeitos antifibróticos na DRC.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DOR RENAL/RENAL
15-PGDH, uma importante enzima metabolizadora de PGD2, foi reduzida em rins Alox15-/- CKDPara esclarecer o mecanismo do aumento de PGD2 norinsde camundongos modelo Alox15−/− CKD, medimos o nível de mRNA da PGD2 sintase. PGD2 sintase (PGDS) tem duas isoformas: lipocalina PGDS (L-PGDS) e PGDS hematopoiético (H-PGDS) [28]. Ambos os níveis de L-PGDS e H-PGDS foram significativamente aumentados em condições 5/6 Nx quando comparados com aqueles sob condições simuladas norinsde camundongos WT (Fig. 8a, ambos P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, que são conhecidas por serem as principais enzimas metabolizadoras de PGD2- [29, 30]. Enquanto os níveis de mRNA de COX-1, COX-2 e AKR1C18 permaneceram inalterados, o nível de mRNA de 15-PGDH foi significativamente reduzido na DRCrinsde camundongos Alox15−/− quando comparados com os de camundongos WT (Fig. 8b, P=0.0325), que potencialmente levam ao aumento de PGD2 na DRCrinsde camundongos Alox15−/−.
Discussão
Este estudo demonstrou que na DRCrimamostras, os níveis de transcrição e proteína de Alox15 foram aumentados, erimdisfunção e fibrose foram melhorados em camundongos Alox15-/-. Além disso, a lipidômica do mediador baseado em LC-MS/MS revelou que o camundongo Alox15-/- CKDrinstinham níveis significativamente aumentados de PGD 2 em comparação com camundongos WT. PGD2 inibiu a EMT de células NRK-52E e HK-2; portanto, o aumento de PGD2 pode contribuir para a resistência de camundongos Alox15−/− alesão renale fibrose. O relacionamento entredoença renale perfis lipídicos usando lipidômica em soro ou plasma humano tem sido extensivamente investigado [31-33], mas não emrimtecido. Da mesma forma, embora os relatos sobre lipidômica usando modelos animais de DRC sejam poucos [34-36], todos esses estudos realizaram lipidômica em amostras de plasma de um modelo animal de DRC; no entanto, nenhuma lipidômica abrangente sobrerimtecidos do modelo CKD já foram relatados. A lipidômica direta no tecido também é eficaz, assim como amostras de plasma, na identificação de metabólitos funcionais. Além disso, as alterações de metabólitos nos tecidos, bem como as amostras de sangue, são consideravelmente diferentes por órgão [20]. No presente estudo, analisamos minuciosamente o perfil de mediadores lipídicos derivados de PUFA norimtecidos de um modelo animal de DRC.
Este estudo se concentrou em ALOX15, que é uma das principais enzimas que metabolizam PUFAs. Neste estudo, os níveis de expressão de proteína e mRNA de ALOX15 foram claramente aumentados na DRCrins. Abordamos os tipos celulares responsáveis pela expressão de ALOX15 na DRCrins,e por hibridização in situ, encontramos um aumento da expressão de ALOX15 mRNA emrenalcélulas tubulares no modelo 5/6 Nx.
ALOX15 está envolvido em doenças crônicas, como aterosclerose, e sua deleção em modelos de doenças animais melhora essas doenças [5]. Em relação à associação de ALOX15 comdoença renal, a proteinúria está diminuída em camundongos Alox15−/− sob lesão glomerular por um modelo de nefropatia diabética induzida por estreptozotocina [37]. No entanto, este modelo de camundongo com diabetes mellitus não mostra nenhum declínio nafunção renal; assim, o mecanismo de como ALOX15 está associado ao comprometimentofunção renalem modelos de DRC permaneceu obscura. No presente estudo, usando o modelo de camundongo 5/6 Nx, descobrimos que a deleção de ALOX15 melhorourimdisfunção erenalfibrose em modelo de DRC. Até o momento, apenas IL-4 e IL-13 em monócitos são conhecidos por serem fatores reguladores que aumentam diretamente a expressão de ALOX15 [5]. No entanto, ainda não está claro o que aumenta ALOX15 emrenalcélulas tubulares. Sabe-se que uma variedade de citocinas e toxinas urêmicas estão aumentadas no plasma e nos rins na DRC [38, 39]. Entre eles, pode haver novos reguladores de ALOX15. Mais estudos são necessários para elucidar os principais fatores regulatórios da ALOX15 na DRC. Em nossos estudos para identificar oxilipinas intervenientes específicas que ligam a deleção de Alox15 ao seu efeito renoprotetor no modelo 5/6 Nx, descobrimos que PGD2 pode estar envolvido na resistência adano renalcausada pela deleção de ALOX15. Como entendimento geral, para gerar PGD2, COX-1 e
CCOX-2 produz PGG2 a partir de ácidos araquidônicos, que é então convertido em PGH2. Quando o PGH2 é metabolizado pela PGD2 sintase (PGDS), o PGD2 é produzido [28]. A PGDS tem duas isoformas geneticamente distintas, a saber, PGDS do tipo lipocalino (L-PGDS) e PGDS do tipo hematopoiético (H-PGDS) [28]. Embora o PGD2 tenha aumentado no camundongo Alox15−/− CKDrins, nem L-PGDS nem H-PGDS foram aumentados no camundongo Alox15-/- CKDrins, apesar do grande aumento de PGDS no camundongo WT CKDrins(Fig. 8a). Além disso, também revelamos que nem COX-1 nem COX-2 foram aumentados nos rins de camundongos Alox15-/- CKD (Fig. 8b). Esses resultados sugerem que o aumento de PGD 2 nos rins de camundongos Alox15-/- CKD não foi devido a um aumento nas sintases, mas devido ao aumento da disponibilidade de substrato ou inibição da degradação e, de fato, revelamos uma redução em {{ 7}}PGDH, uma das principais enzimas metabolizadoras de PGD2 [29], nos rins de camundongos Alox15-/- CKD (Fig. 8b). Mais investigações são necessárias para elucidar a razão pela qual a deleção de Alox15 leva a uma diminuição de 15-PGDH.
Como mencionado acima, o PGD2 pode estar envolvido na resistência alesão renalcausada pela perda de ALOX15. Neste estudo, PGD2 inibiu EMT por TGF- 1 em células NRK-52E e HK-2, representando células tubulares proximais. O PGD2 se liga a dois receptores acoplados à proteína G diferentes, a saber, DP1 e DP2, cujas funções são diferentes [28]. No entanto, em nossos experimentos in vitro, PGD2 foi eficaz em concentrações que variam de 4 a 32 μM, que são relativamente altas, considerando que os valores de Ki de DP1 e DP2 são 1,7 nM e 2,4 nM, respectivamente [28]. Este resultado indica que PGD2 pode exercer efeitos antifibróticos não via receptores acoplados à proteína G, mas por outras vias, como PPAR, através do qual 15-d-PGJ2, um metabólito PGD2 a jusante, é conhecido por exercer seus efeitos [28]. Neste estudo, que se concentra em enzimas metabólicas lipídicas e seus metabólitos, a inibição de ALOX15 e/ou administração de PGD2 pode ser um alvo terapêutico promissor para a DRC. Infelizmente, nenhum inibidor específico de ALOX15 que possa ser usado na prática clínica foi desenvolvido [40, 41]. O direcionamento terapêutico de metabólitos funcionais a jusante, como PGD2, em vez da inibição de enzimas metabolizadoras de ácidos graxos, que afetam vários metabólitos, pode ser uma nova terapia ideal para DRC.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DIÁLISE RENAL/RENAL
