Ciclopentanona exerce atividades anti-melanogênese e anti-rugas no melanoma B16F10

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Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 e Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Abstrato:A exposição à radiação ultravioleta (UV) é a principal causa do envelhecimento extrínseco da pele, que resulta em hiperpigmentação e enrugamento da pele. Neste estudo, investigamos o efeito clareador de (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroxi-4-metoxibenzilideno)ciclopentanona (BHCP) no melanoma B16F10 e seu anti- atividade de rugas em células de fibroblastos Hs27. Descobriu-se que o BHCP inibe a tirosinase de forma potente, com valores de concentração de inibição de 50% (IC50) de 1,10 μM e 8,18 μM de formicofenolato (L-tirosina) e difenolase (L-DOPA), e o estudo de cinética enzimática revelou que o BHCP é um inibidor de tirosinase do tipo competitivo . Além disso, o BHCP inibiu significativamente o conteúdo de melanina e a atividade da tirosinase celular e regulou negativamente os níveis de fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), os níveis fosforilados da proteína de ligação ao elemento de resposta de cAMP (CREB) e a tirosinase induzida pelo hormônio estimulador de melanócitos (-MSH). Células de melanoma B16F10. Além disso, BHCP inibiu a fosforilação de p65 e a expressão de metaloproteinases de matriz (MMP-1, MMP-9, MMP-12 e MMP-13) em fibroblastos Hs27 estimulados com radiação UV. Portanto, nossos resultados demonstram que o BHCP pode ser um bom candidato para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças associadas à hiperpigmentação e rugas.

Palavras-chave: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroxi-4-metoxibenzilideno)ciclopentanona (BHCP); inibidor de tirosinase; anti-melanogénese; anti-rugas

Cistanche éanti-rugas.

1. Introdução

O envelhecimento cutâneo é um processo complexo e progressivo que leva a alterações funcionais e estéticas da pele, sendo os fatores intrínsecos e extrínsecos responsáveis ​​[1]. O envelhecimento extrínseco da pele é causado por agressores ambientais, como radiação ultravioleta (UV), estresse ou tabagismo. No entanto, é causado principalmente pela exposição repetida aos raios UV do sol, o que é chamado de fotoenvelhecimento. O fotoenvelhecimento da pele é caracterizado por rugas grossas e profundas, espessura, aspereza, despigmentação e alterações histológicas [2-4].

A tirosinase (EC 1.14.18.1), que também é conhecida como polifenol oxidase, é uma das enzimas multifuncionais contendo cobre envolvidas na síntese de melanina e é encontrada amplamente na natureza [5]. e animais. Em plantas, a tirosinase atua oxidando monofenóis em difenóis (atividade micofenolato) e está envolvida na oxidação de o-difenóis em o-quinonas (atividade de difenolase), seguida pela oxidação de quinonas em pigmentos marrom-escuros.

A melanogênese é a transformação da L-tirosina em 3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA), pela qual a L-DOPA é convertida em DOPA quinina [7]. Assim, a tirosinase desempenha um papel importante na produção de melanina nos melanócitos, e a inibição da tirosinase é um alvo atraente para a melhora de distúrbios relacionados à pigmentação e para o desenvolvimento de agentes clareadores [8,9]. A síntese de melanina é induzida por vários estímulos, como UV e substâncias químicas, incluindo isobutilmetilxantina (IBMX) e hormônio estimulador de alfa-melanócitos (-MSH). -MSH liga-se ao seu receptor de melanocortina 1 (MC1R), aumentando subsequentemente o nível de AMP cíclico citoplasmático (cAMP). O aumento do nível de cAMP ativa a proteína quinase A (PKA), que induz a expressão do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) através da fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta de cAMP (CREB). O MITF induz a expressão de tirosinase, proteína relacionada à tirosinase (TRP)-1 e TRP-2, que finalmente resulta em aumento da síntese de melanina [10]. O MITF é considerado um fator chave de transcrição da melanogênese; portanto, muitos estudos têm sido realizados para controlar a expressão de MITF para inibir a melanogênese [11].

Sabe-se que a formação de rugas está intimamente associada à degradação da matriz extracelular da pele, e a radiação UV ativa o fator nuclear κB (NF-κB), aumentando assim a produção de fragmentação de colágeno e metaloproteinases de matriz (MMPs) [2]. As MMPs são endopeptidases zinco-dependentes que são importantes na remodelação da estrutura da matriz extracelular na pele. Portanto, a degradação excessiva do colágeno e da matriz pelas MMPs induzidas por UV é uma característica da pele fotodanificada, e as MMPs são usadas como um importante marcador do fotoenvelhecimento induzido por UV, bem como da inflamação da pele [12].

Os derivados do esqueleto diarilheptanoide semelhantes à curcumina têm sido incluindo antioxidantes, anticancerígenos relatados, atividades. andaimes, incluindo (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroxi-4-metoxibenzilideno)ciclopentanona (BHCP) (Figura 1),para exibir uma ampla gama de anti-inflamação, anti-melanogênese, especialmente, Leow et al. [19] relataram em bioatividades e anti-tirosinase [13-18]dibenzilideno-ciclopentanona 2014 que podem contribuir para os efeitos protetores no osteossarcoma humano através da regulação da via de sinalização Wnt/-catenin. No entanto, os efeitos anti-melanogênese e anti-rugas do BHCP ainda precisam ser descobertos, e os mecanismos moleculares subjacentes à sua atividade ainda não foram claramente estabelecidos.

Figura 1. Estrutura de (2E,5E)-bis(3-hidroxi-4-metoxibenzilideno)ciclopentanona (BHCP).

No presente estudo, investigamos o potencial anti-melanogênese e antirrugas da BHCP, e buscamos identificar o mecanismo envolvido, principalmente no que diz respeito ao conteúdo de melanina e atividade da tirosinase celular, que foram explorados através do ensaio de inibição da tirosinase e análise da cinética enzimática. Além disso, demonstramos que o BHCP exerce um efeito inibitório na melanogênese e rugas que está associado à regulação negativa de CREB/MITF/tirosinase em células de melanoma de camundongo B16F10 induzidas por MSH e inibição da fosforilação de p65 e expressão de MMP em fibroblastos humanos Hs27 induzidos por UV.

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2. Resultados e Discussão

2.1. Síntese de (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroxi-4-metoxibenzilideno)ciclopentanona (BHCP)

Uma solução de {{0}}hidroxi-4-metoxibenzaldeído (100 mg, 0,66 mmol, isovanilina) e ciclopentanona (0,03 mL, 0,33 mmol) em solução de ácido acético 1 N HCl (0,02 mL) foi agitado a 25 ◦C por 2 h. Depois de repousar por 1 dia, a mistura de reação foi tratada com água fria na presença de uma pequena quantidade de metanol, filtrada e lavada com água fria para produzir BHCP (65,9 mg) com 56,9% de rendimento. BHCP foi identificado por métodos espectroscópicos, incluindo 1H e 13C-NMR, bem como por comparação com dados espectrais publicados e análise de cromatografia em camada fina (TLC) [19]. A estrutura é mostrada na Figura 1.

BHCP: pó amorfo amarelo (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28(s,2H,2×vinílicoH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8,5, 2,0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-RMN (100 MHz,DMSO-d6) ô: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M − H)−.

2.2. Efeito Inibitório do BHCP na Atividade da Tirosinase do Cogumelo

Conforme mostrado na Tabela 1, o BHCP inibiu a tirosinase com valores de IC50 de 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM, enquanto o ácido kójico (controle positivo) teve valores de IC50 de 18,68 ± 1,40 μMand 33,89 ± 1,16 μM para monofenolase e difenolase, respectivamente. Em nosso estudo anterior de potenciais inibidores sintéticos da tirosinase, encontramos o mecanismo através de estudos de modelagem molecular pelo qual os grupos 3-hidroxi e 4-metoxi do benzilideno tinham grandes tendências de ligação ao sítio ativo da tirosinase [20]. A partir do resultado deste estudo, foi demonstrado que seus grupos funcionais (grupos 3-hidroxi e 4-metoxi) foram associados a um aumento significativo na atividade inibidora da tirosinase.

Tabela 1. Atividade inibidora da tirosinase e análise cinética enzimática de BHCP.

Além disso, o mecanismo responsável pela inibição da tirosinase pelo BHCP foi investigado por análise cinética enzimática no presente estudo (Tabela 1 e Figura 2). Os gráficos de Lineweaver-Burk foram desenhados a partir dos dados obtidos dos estudos cinéticos, e a constante de inibição (Ki) foi obtida dos gráficos de Dixon. Os gráficos recíprocos duplos de Lineweaver-Burk indicaram inibição do tipo competitivo. Conforme mostrado na Figura 2a–c, o BHCP atuou como um inibidor competitivo de L-tirosina e L-DOPA. Além disso, as interceptações no eixo x dos gráficos de Dixon são comumente usado para determinar os tipos de constantes de inibição enzimática (Ki) para um complexo enzima-inibidor [21,22], onde o valor do eixo x indica o valor de −Ki. Conforme ilustrado na Figura 2b–d, os valores de Ki de BHCP foram 1,7 μMan e 10,5 μM como substratos para L-tirosina e L-DOPA, respectivamente. Como o valor de Ki representa a concentração necessária para formar um complexo enzima-inibidor, um valor de Ki mais baixo sugere uma inibição mais efetiva contra a tirosinase.

Figura 2. Gráficos de Lineweaver–Burk (a,c) e Dixon (b,d) para inibição da enzima tirosinase por BHCP.

2.3. Efeitos do BHCP na viabilidade celular de células de melanoma B16F10 e fibroblastos Hs27

Antes de determinar se o BHCP exerceu qualquer atividade anti-melanogênese e anti-rugas, examinamos a citotoxicidade do BHCP para células B16F10 e células Hs27 por tratamento com diferentes concentrações de BHCP por diferentes intervalos de tempo, e a viabilidade celular foi medida com o ensaio EZ-Cytox. Conforme mostrado na Figura 3a,b, até 10 μM de BHCP por 48 h não reduziu a sobrevivência das células B16F10 ou Hs27. Posteriormente, mais estudos in vitro sobre as atividades anti-melanogênese e anti-rugas do BHCP foram realizados com 1, 5 e 10 μM.

2.4. Inibição de BHCP contra o conteúdo de melanina e atividade de tirosinase celular em células de melanoma B16F10

Para determinar se o BHCP exerce potencial inibitório sobre o conteúdo de melanina das células B16F10 induzidas por -MSH, as células foram pré-tratadas com as diferentes concentrações indicadas (1, 5 e 10 μM) de BHCP ou ácido kójico (5 mM) por 24 h e depois estimuladas com -MSH por 48 h. Conforme mostrado na Figura 4a, o teor de melanina nas células tratadas com BHCP na presença de -MSH diminuiu de maneira dependente da concentração, mostrando 113 por cento a 1 μM, 106 por cento a 5 μM e 102 por cento a 10 μM, em comparação com o grupo controle tratado apenas com -MSH (186 por cento). Curiosamente, o BHCP (1 μM) inibiu o conteúdo de melanina mais fortemente do que o ácido kójico (5 mM). Além disso, um ensaio de atividade de tirosinase celular foi realizado para medir o efeito inibitório de BHCP em células B16F10. Conforme mostrado na Figura 4b, o BHCP diminuiu de maneira dependente da concentração com a atividade da tirosinase em 120 por cento a 1 μM, 116 por cento a 5 μM e 105 por cento a 10 μM, em comparação com o grupo controle tratado apenas com -MSH (181 por cento). O efeito inibitório do BHCP foi muito mais potente que o do ácido kójico; a inibição do BHCP a 1 μM foi superior à do ácido kójico a 5 mM (131 por cento). Esses resultados sugerem que o BHCP tem efeito clareador ao inibir a biossíntese de melanina e a síntese de tirosinase intracelular em melanócitos B16F10.

Figura 4. Inibição do conteúdo de melanina (a) e da atividade celular da tirosinase (b) de BHCP em células de melanoma B16F10.

2.5. Efeitos do BHCP na Expressão de MITF/Tirosinase e CREB Fosforilado em Células B16F10

O MITF, um fator de transcrição específico, desempenha um papel fundamental na ativação efetiva dos genes melanogênicos, incluindo a tirosinase, catalisando a etapa limitante da biossíntese de melanina: TRP-1 e TRP-2. A expressão de MITF poderia ser aumentada pela fosforilação de CREB [23]. O CREB é um importante promotor do MITF [24,25], e a fosforilação do CREB nos melanócitos aumenta a expressão do MITF pela ligação ao CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta c-AMP) nos melanócitos [26]. Para elucidar as vias moleculares responsáveis ​​pelo efeito anti-melanógeno do BHCP em células B16F10, examinamos os níveis de proteínas de moléculas-chave, incluindo CREB e MITF, que desempenham papéis importantes na melanogênese por análise de Western blot. As células foram tratadas com BHCP ou ácido kójico e, em seguida, estimuladas por -MSH por 48 h. O intervalo de tempo para as medidas seguiu a metodologia descrita em estudos anteriores [27]. Conforme mostrado na Figura 5, os níveis de tirosinase e MITF aumentaram com -MSH, mas BHCP diminuiu esses níveis de proteína. Além disso, a fosforilação do CREB foi significativamente suprimida pelo BHCP. A regulação da fosforilação de CREB induzida por -MSH é conhecida por ser potencialmente importante na regulação da pigmentação [28]. Esses resultados indicam que os efeitos anti-melanógenos do BHCP resultam da regulação negativa de MITF e tirosinase via regulação negativa de CREB fosforilado. O presente estudo sugere que a elucidação do mecanismo de inibição da BHCP na tirosinase e na melanogênese é crucial e deve ser mais investigada no futuro. Embora a linhagem celular de melanoma B16F10 seja geralmente mais adequada para investigação de mecanismos de sinalização in vitro, a linhagem celular B16F10 é de um melanoma de roedor. Portanto, mais estudos em melanócitos humanos serão necessários para confirmar os achados.

2.6. Efeito de BHCP na ativação de NF-κB p-p65 induzida por UV em células Hs27

Em seguida, investigamos o efeito do BHCP na expressão induzida por UV de mediadores inflamatórios usando fibroblastos Hs27. Foi relatado anteriormente que a fosforilação de p65 (Ser536) é essencial para sua capacidade de transativar genes [29]. Portanto, os níveis de proteína de p-p65 (Ser536) e p65 foram examinados na fração do núcleo por Western blotting. Conforme indicado na Figura 6a,b, em células Hs27, UV aumentou os níveis de proteína p-p65 (Ser536) no núcleo, enquanto o tratamento de BHCP diminuiu os níveis de proteína p-p65 (Ser536) no núcleo. Correspondentemente, a quantidade total de p65 foi diminuída no citoplasma por UV e restaurada por BHCP (Figura 6c,d). Embora os níveis de expressão da proteína p65 tenham diminuído no citoplasma e aumentado no núcleo após a indução UV, o pré-tratamento com BHCP reverteu essas tendências de maneira dose-dependente. Assim, esses resultados sugerem que a inibição da p-p65 pelo BHCP pode contribuir para os efeitos protetores na pigmentação da pele e na destruição do colágeno contra os raios UV.

Figura 6. Efeitos de BHCP nos níveis de expressão de p-p65 (Ser536) em células de fibroblastos humanos Hs27 induzidas por UV.

2.7. Efeito do BHCP na Expressão de MMPs em Células Hs27

As MMPs desempenham um papel vital no envelhecimento da pele. A irradiação UV altera os tecidos conjuntivos da pele ao aumentar a expressão de MMPs [30,31]. A MMP-1 é uma enzima decompositora de colágeno que acelera a quebra do colágeno sintetizado a partir do procolágeno tipo I. A MMP-9 é uma enzima decompositora de gelatina que quebra as fibras de colágeno cortadas pela MMP-1, aumentando a produção de rugas e a perda de elasticidade. Para examinar o efeito antirrugas do BHCP contra a indução de UV, determinamos os níveis de proteína MMP-1 e MMP-9 por Western blotting. Além disso, as células induzidas por UV apresentaram níveis significativamente elevados de MMP-13, que inicia a degradação do colágeno tipo I e III em vez de MMP-1 [32]. Nós investigamos o aumento de MMPs (MMP1, MMP9, MMP12 e MMP13) após o tratamento de células Hs27 induzidas por UV com BHCP em 1 e 10 μM. Conforme mostrado na Figura 7, os níveis de expressão de MMP-1, MMP-9, MMP-12 e MMP-13 aumentaram após a indução UV; no entanto, o tratamento com BHCP diminuiu a expressão em uma dose -maneira dependente. Nossos resultados sugerem que o BHCP pode contribuir para a prevenção da formação de rugas, reduzindo a produção anormal de MMPs induzida pela exposição aos raios UV. Esses resultados implicam que o BHCP inibe a expressão de MMP nos fibroblastos Hs27 para evitar a decomposição do colágeno e, portanto, a produção de rugas. Portanto, o BHCP apresenta potencial para uso como medicamento preventivo e de tratamento de doenças relacionadas à pele.

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3. Materiais e Métodos

3.1. Produtos Químicos e Instrumentação

Tirosinase de cogumelo (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirosina, 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), dimetilsulfóxido (DMSO) e ácido kójico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal, estreptomicina e anfotericina foram adquiridos da Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, EUA). Anticorpos contra MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirosinase, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , e -actinforam adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). As membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) foram obtidas da Millipore Corporation (Bedford, MA, EUA). A louça plástica estéril para culturas de tecidos foi adquirida da SPL Labware (Seul, Coréia). A fonte de luz UV foi fornecida pela unidade de 6 lâmpadas da série Crosslinker 800 (UVP, CA, EUA) (8 watts/lâmpada). Cromatografia em camada fina e gel de sílica 60 (malha 230–400) foram realizados em gel de sílicaF{{27} } placas pré-revestidas da Merck Millipore (Darmstadt, Alemanha). Os espectros de RMN foram registrados usando instrumentos Varian Unity INOVA 400 (400 MHz para 1H, 100 MHz para 13C) e Varian Unity AS 500 (500 MHz para 1H). Os valores de deslocamento químico (δ) são relatados com referência aos respectivos picos de solvente residual ou deuterados (δH 2,50 e δC 39,51 para DMSO). Os dados de espectrometria de massa de baixa resolução foram obtidos com um espectrômetro de massa Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, EUA).

3.2. Ensaio de Inibição de Tirosinase de Cogumelo

A atividade inibitória da tirosinase do cogumelo foi determinada usando L-tirosina e L-DOPA como substratos, com base no procedimento descrito por Jung et al. [23]. Resumidamente, 190 μL de enzima tirosinase (1000 U diluídos com tampão de tirosinase de cogumelo, incluindo 1 mM de L-tirosina e solução de L-DOPA) foram adicionados, na presença ou ausência de compostos (concentração final variando de 1 a 20 μM, dissolvido em 100 por cento de DMSO), para cada poço de uma 96-placa de poço, para fornecer um volume final de 200 μL. A placa foi incubada a 37 ◦C por 30 min. A atividade da tirosinase foi quantificada medindo a absorbância a 492 nm usando um leitor de microplacas (TECAN, Salzburg, Áustria) e a porcentagem de inibição ( por cento ) foi obtida a partir da seguinte equação:

porcentagem de inibição=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

onde Ac é a absorbância do controle e As é a absorbância da amostra. Os valores de IC50 foram calculados a partir das curvas log-lineares e suas equações. Os resultados médios para três determinações são mostrados. O ácido kójico foi usado como controle positivo.

3.3. Análise Cinética da Inibição da Tirosinase

Para determinar os mecanismos cinéticos, dois métodos cinéticos (Lineweaver-Burk e gráficos de Dixon) foram usados ​​complementarmente [21,22,33]. Para os gráficos recíprocos duplos de Lineweaver-Burk (um gráfico de 1/velocidade da enzima (1/V) versus 1/concentração de substrato (1/[S])), o tipo de inibição foi determinado usando várias concentrações de L-tirosina (1, 2, e 4 mM) e L-DOPA (0,5, 1 e 2 mM) como substratos na presença de diferentes concentrações de BHCP. As concentrações de BHCP foram as seguintes:0, 0.5, 1.{{20}}, e 2.0 μM para L-tirosina; e 0, 2,5, 5 e 10 μM para L-DOPA. O gráfico de Dixon é um método gráfico (gráfico de 1/velocidade enzimática (1/V) versus concentração de inibidor (I)) para a determinação do tipo de inibição enzimática e foi utilizado para determinar a constante de dissociação ou Ki para o complexo enzima-inibidor. Os gráficos de Dixon (gráficos recíprocos simples) da inibição foram obtidos na presença do substrato L-tirosina a 1, 2 e 4 mM e {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} e 2.0 μM para BHCP; e L-DOPAsubstrato em {{50}},5, 1.0 e 2,0 mM e 0, 2,5, 5,0 e 10,0 μM para BHCP.

planta de cistacheé um inibidor da tirosinase.

3.4. Linhas de células e cultura de células

As células de melanoma murino B16F10 foram obtidas do Korean Cell Line Bank. A linha celular de fibroblastos de pele humana Hs27 foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Essas células foram mantidas em DMEM suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5 por cento de CO2 a 37 ◦C. Fibroblastos dérmicos em uma placa de 100 mm foram tratados com BHCP e expostos a 50 mJ/cm2UV em DMEM sem soro (fonte de luz UV, UVP). As células Hs27 foram cultivadas a 70-80 por cento de confluência em uma placa de 100 mm de diâmetro e foram usadas entre as passagens números 5 e 15.

3.5. Ensaio de Viabilidade Celular

A viabilidade das células foi avaliada usando o ensaio do kit EZ-Cytox. Em resumo, células B16F10 e fibroblastos Hs27 foram semeados em uma placa 96-poço a uma densidade de 1 × 104 células/poço e incubados a 37 ◦C por 24 h. As células foram alimentadas com DMEM fresco e sem soro que continha diferentes concentrações (0, 1, 2, 5 e 10 μM) de BHCP e incubadas por 24 e 48 h. Subsequentemente, 10 μL de solução EZ-Cytox foi carregado em cada poço e as células foram incubadas por 2-4 h. A medição da absorbância das células na ausência de qualquer tratamento foi considerada como 100 por cento de sobrevivência das células. Cada tratamento foi realizado em triplicado e cada experimento foi repetido três vezes.

3.6. Determinação do Ensaio do Conteúdo de Melanina

O efeito do BHCP na melanogênese induzida por -MSH em células B16F10 foi baseado em um método usado anteriormente com pequenas modificações [34]. Resumidamente, células B16F10 (5 × 104 células/poço) em 6-placas de poços cresceram até 70-80 por cento de confluência. As células foram então tratadas com diferentes concentrações de BHCP (1, 5 e 10 μM) ou ácido kójico (5 mM) por 24 h e, em seguida, estimuladas com -MSH (5 μM) por 48 h. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, dissolvido em 90 μL de solução de NaOH 1 M incluindo DMSO (5 por cento) a 60 ◦C por 1 h, e a absorbância foi medida a 405 nm com um espectrofotômetro de microplaca (TECAN, Salzburg , Áustria). Para medir a quantidade de melanina no experimento, a taxa de inibição nos grupos de tratamento foi calculada a partir da absorbância das concentrações conhecidas de melanina sintética, que foram corrigidas para a quantidade total de proteína que estava presente no sobrenadante dos lisados ​​celulares. A absorvância das células não tratadas foi medida em triplicado.

3.7. Ensaio de Atividade da Tirosinase Celular

O ensaio de atividade da tirosinase celular foi realizado medindo a taxa de oxidação da L-DOPA [35]. As células B16F10 a uma densidade de 5 × 104/células foram colocadas em 6-pratos de poço e incubadas durante a noite. As células foram então tratadas com várias concentrações de BHCP (1, 5 e 10 μM) ou ácido kójico (5 mM) por 24 h e, em seguida, estimuladas com -MSH (5 μM) por 48 h. As células foram lavadas com PBS e lisadas em uma solução contendo 100 μL de 50 mM de tampão fosfato (pH 6,5), 0,1 mMfenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) e 1 por cento de Triton X-100. Em seguida, as células foram colocadas em uma máquina de ultracongelamento (-80 ◦C) por 30 min. Após o descongelamento das células, os extratos celulares foram purificados por centrifugação a 12,000 rpm por 30 min a 4 ◦C. Um total de 80 μL do sobrenadante e 20 μL de L-DOPA (2 mg/mL) foram adicionados a uma placa de poço 96-e a absorbância em um comprimento de onda de 492 nm foi medida a cada 10 min durante 1 h a 37 ◦ C com um leitor de placas ELISA (TECAN, Salzburg, Áustria).

3.8. Preparação de extratos citosólicos e nucleares de células Hs27

As células Hs27 foram lavadas com PBS gelado e colhidas. Um tampão contendo 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 por cento NP-40 e inibidores de protease foi usado para a extração de frações citosólicas por centrifugação a 12,000 rpm a 4 ◦C por 15 min, e as frações nucleares foram extraídas de pellets usando um tampão contendo 10 mM de Tris, 50 mM de KCl, 100 mM de NaCl e inibidores de protease, incubados em gelo por 30 min, e depois centrifugado a 13,000× g por 30 min a 4 ◦C para obter frações nucleares.

3.9. Western Blotting

As amostras de lisado foram fervidas por 10 min em tampão de carregamento de gel (125 mM Tris-HCl, 4 por cento de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10 por cento de 2-mercaptoetanol e 0,2 por cento de bromofenol azul; pH 6,8) na proporção de volume de 1:1. Os equivalentes de proteínas totais para cada amostra foram separados por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) usando géis de acrilamida conforme o procedimento descrito por Laemmli [36] e transferidos para membranas de PVDF a 80 V por 2 h usando o sistema de transferência úmida. As membranas foram imediatamente colocadas em um tampão de bloqueio (5 por cento de leite desnatado) em 10 mM de Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl e 0,1 por cento de Tween-20. Os blots foram bloqueados para evitar a ligação não específica a 25 ◦C por 2 h. Subsequentemente, as membranas foram incubadas com um anticorpo primário específico a 4 ◦C durante a noite, seguido de incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano a 25 ◦C por 1 h . A marcação de anticorpos foi detectada por quimioluminescência aumentada de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação de proteínas foi realizada usando o Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea). Marcadores de proteína pré-corados foram usados ​​para a determinação do peso molecular.

3.10. Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM Os dados foram analisados ​​por análise de variância unidirecional (ANOVA) para as diferenças entre os tratamentos seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni. Um valor de p < 0,05="" foi="" considerado="" estatisticamente="">

4. Conclusões

Em resumo, os achados do presente estudo demonstraram que o BHCP tem um efeito clareador da pele através da inibição da tirosinase, que é uma enzima chave para a biossíntese de melanina em melanócitos B16F10 induzidos por -MSH. Além disso, o BHCP diminuiu a expressão dos níveis de proteína MMP em fibroblastos induzidos por UV, o que se espera que tenha um efeito anti-rugas. Mais pesquisas são necessárias para confirmar os efeitos clareadores e antirrugas do BHCP por meio de estudos clínicos e em animais. Por fim, identificou-se que o BHCP possui efeitos clareadores e antirrugas, indicando seu potencial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças associadas à hiperpigmentação e rugas.

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