A curcumina alivia a senescência das células-tronco mesenquimais da medula óssea canina durante a expansão in vitro Parte 2

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2.5. Autofagia Inovoloes em exercer o efeito protetor de Cur em cBMSC Senescence

Para explorar o efeito da autofagia induzida por Cur na senescência de cBMSC, o nível de autofagia foi modulado através do emprego de RAP(200 nM) ou 3-MA(5 mM).3-MA exerce uma ação inibitória significativa na atividade autofágica, manifestada pela regulação negativa significativa da expressão de mRNA da cadeia leve 3 da proteína 1 associada ao microtúbulo 3(LC3), gene relacionado à autofagia (ATG)7, ATG12 e unc51-like quinase ativadora de autofagia{ {14}}(ULK1); a razão de expressão da cadeia leve 3 da proteína 1 associada a microtúbulos diminuída Ⅱ/I (LC3-I/I); e o aumento da expressão de p62 em relação ao grupo controle (Figura 5A, B). Assim, em comparação com o grupo Cur, uma diminuição na atividade autofágica foi observada no grupo 3-MA mais Cur (Figura 5A, B). Em contraste, um aumento na atividade autofágica foi observado no grupo RAP, como evidenciado pela expressão de mRNA suprarregulada de LC3, ATG12 e ATG7; o aumento da conversão de LC3-I para LC3-II; e a degradação de p62 (Figura 5A, B).

Primeiramente, a atividade autofágica foi investigada sistematicamente. A formação de vacúolos autofágicos (também denominados autofagossomos) foi avaliada por observação morfológica, e os resultados indicaram que havia mais vacúolos autofágicos e pontos LC3 no grupo Cur e grupo RAP em comparação com o grupo controle, enquanto um número reduzido de vacúolos autofágicos e menos pontos LC3 foram observados nos grupos 3-MA e 3-MA mais Cur (Figura 5C, E). Além disso, a coloração de LysoTracker indicou que a acidificação lisossomal foi aumentada por RAP e Cur em cBMSCs e diminuída em os grupos 3-MA e 3-MA mais Cur (Figura 5D). Os resultados mostram que Cur e RAP exercem um efeito positivo semelhante na ativação da autofagia e que a atividade autofágica é suprimida por 3-MA.tamanho do pênis cistanche,No entanto, os efeitos de inibição de 3-MA na autofagia podem ser parcialmente resgatados pelo emprego de Cur.

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Para confirmar se a autofagia participa da regulação da senescência CB MSc, examinamos ainda os fenótipos associados à senescência após promover ou suprimir a autofagia por meio de tratamento farmacológico. Os resultados mostraram que um número reduzido de células SA- -gal-positivas estava presente nos grupos Cur e RAP, enquanto um número aumentado de células SA- -gal-positivas foi observado nos grupos {{5} }Grupo MA comparado com o grupo controle. Vale ressaltar que o número de células SA- -gal-positivas foi significativamente aumentado no grupo 3-MA mais Cur em comparação com o grupo Cur (Figura). Os resultados de uma análise de RT-qPCR indicaram que o tratamento com RAP e Cur aumentou o nível de expressão de SOX-2 e Nanog e diminuiu o nível de expressão de IL-6, TNF-a, p21 e p16 em comparação com o grupo controle. No entanto, a inibição da autofagia por 3-MA regulou positivamente a expressão de p16, p21, TNF- e IL-6(Figura 6C-E). Além disso, em comparação com o grupo controle, a eficiência de formação de colônias de cBMSCs foi aumentada nos grupos Cur e RAP, enquanto o número e o tamanho de UFC-F foram significativamente diminuídos no grupo 3-MA. Além disso, foi demonstrado que o efeito aprimorado do Cur no número de formação de colônias de cBMSCs pode ser abolido através do pré-condicionamento com 3-MA (Figura 6B).pó de cistacheEsta evidência indica que RAP e Cur podem melhorar a senescência de cBMSC, enquanto 3-MA agrava a senescência de cBMSC e atenua os efeitos benéficos exercidos por Cur.

Em conjunto, esses resultados sugerem que a inibição da autofagia com 3-MA acelera a senescência de cBMSCs, enquanto a ativação da autofagia com Cur e RAP alivia a senescência de cBMSCs (Figura 6F). Notavelmente, os efeitos protetores exercidos por Cur foram atenuados pelo pré-tratamento com 3-MA (Figura 6F), sugerindo que a autofagia induzida por Cur é um mecanismo molecular potencial para melhorar a senescência de cBMSC.

3. Discussão

Os organismos reparam continuamente os tecidos lesados ​​e retardam os processos relacionados à senescência devido às características distintamente funcionais das MSCs que residem extensivamente em vários tecidos e órgãos [15]. Infelizmente, a idade e a doença são fatores-chave para a senescência de MSC in vivo, e as diferenças internas e externas nos ambientes celulares aceleram a senescência de MSC em cultura in vitro, ambos os quais afetam negativamente sua capacidade de imunossupressão, diferenciação e migração, reduzindo a eficácia do autocontrole. -reparação e transplante em MSCs [7,14,49-51].extrato de salsa cistacheOja e colegas indicaram que as BMSCs humanas cessaram a proliferação na quinta à nona passagem de culturas de grau clínico e exibiram fenótipos típicos de senescência, como uma morfologia hipertrófica e plana, a ativação de inibidores da quinase do ciclo celular p16 e p21, uma taxa de proliferação diminuída , e atividade aprimorada de SA- -gal [52]. Evidentemente, a expansão in vitro inevitavelmente gera o aparecimento prematuro de senescência em MSCs, que são consideradas um importante sistema modelo para pesquisa de envelhecimento celular in vitro [42, A4, A5]. Nosso presente estudo descobriu que as cBMSCs antes da 3ª passagem exibiam uma morfologia uniforme, mas foram observadas uma série de mudanças em termos de morfologia celular, fisiologia e expressão gênica após a 6ª passagem (Figuras 2 e 7), consistente com senescência prematura .

Cistanche pode anti-envelhecimento

Uma quantidade crescente de evidências indica que a estimulação farmacológica é uma abordagem promissora para resgatar MSCs da senescência [53,54]. Com isso em mente, vários compostos naturais e sintéticos têm sido investigados extensivamente para determinar seu potencial anti-inflamatório, antioxidante e anti-senescência in vivo e in vitro [15,55]. Como um composto fenólico de ocorrência natural, o Cur despertou grande atenção devido aos seus efeitos benéficos na biologia das MSC [36,37,56,57]. No entanto, os efeitos complexos da exposição ao Cur em MSCs devem ser cuidadosamente considerados antes da implementação de diferentes pesquisas biomédicas. Yang e colegas relataram que altas concentrações de Cur (50 e 100 uM) podem induzir efeitos tóxicos agudos em BMSCs humanas in vitro, enquanto a exposição contínua (7 d) a 10 uM de Cur inibe a proliferação de BMSCs humanas e induz a apoptose celular [58]. Curiosamente, outro estudo indicou que o tratamento com Cur(<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Recentemente, as atividades biológicas do Cur têm sido amplamente relatadas em vários modelos in vitro ou in vivo, principalmente no que diz respeito à modulação das características biológicas das CTMs. A atividade antienvelhecimento do Cur tem sido discutida com frequência, e descobriu-se que o Cur exibe efeitos benéficos no envelhecimento e doenças relacionadas à idade nos níveis do organismo e celular. No entanto, o mecanismo subjacente à sua regulação é complicado devido às diferentes doses e formas de Cur, bem como ao mecanismo do envelhecimento [19]. Como um importante mecanismo intracelular de degradação de moléculas e renovação de organelas, a autofagia desempenha um papel importante na proteção de MSCs contra condições de estresse e na manutenção da homeostase celular. A modulação da autofagia é considerada uma nova estratégia para a melhoria das funções das MSC [59]. De acordo com dados coletados de estudos substanciais, a promoção ou supressão da autofagia por Cur em vários modelos celulares exerce efeitos citoprotetores satisfatórios [38-40].haste de cistacheNossos dados mostraram que o aumento da atividade autofágica foi observado após a exposição ao Cur, conforme identificado pela regulação positiva de genes relacionados à autofagia (LC3, ULK1, Atg7 e Atg12), geração de LC3-II, aumento no número de vacúolos autofágicos e organelas vesiculares ácidas, e uma diminuição significativa no nível da proteína p62 (Figura 4). Além disso, o lisossomo é considerado uma organela indispensável para a autofagia, enquanto a desregulação do pH lisossomal e a alteração da atividade vacuolar H+-ATPase (v-ATPase) foram observadas no processo de senescência das CTM, promovendo acidificação lisossomal e autofagia e contribuindo para retardar a senescência de MSC [60]. Yan e colegas indicaram que Cur pode ativar a função lisossômica de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) e induzir autofagia, que serve como um sinal crucial de sobrevivência [38]. Da mesma forma, observamos que o tratamento com Cur aumenta a acidificação lisossomal em cBMSCs (Figura 4), sugerindo que o Cur pode estar envolvido na ativação da função do lisossomo, que é indispensável para aumentar a atividade autofágica.

A autofagia é predominantemente um mecanismo citoprotetor, e uma quantidade crescente de evidências indica que as propriedades antienvelhecimento de compostos naturais e sintéticos estão correlacionadas com a modulação da autofagia [29,54,61,62]. No entanto, os efeitos da modulação da autofagia na senescência das MSC e os mecanismos correspondentes ainda não foram totalmente avaliados e explorados. Relatos iniciais indicaram que a autofagia é um mecanismo predominantemente citoprotetor e que um aumento do nível de autofagia pode retardar a senescência celular, reduzindo o acúmulo de metabólitos tóxicos e restaurando a função das organelas [63]. Curiosamente, investigações recentes também mostraram que o aumento do número de vacúolos autofágicos e proteínas relacionadas à autofagia (LC3-II, ATG7 e ATG12) foram observados durante a senescência de MSC, enquanto a inibição da autofagia com bafilomicina A1 e {{11 }}MA mostrou reduzir a porcentagem de células SA- -gal-positivas e a expressão de p16 e p21 [35]. Para elucidar ainda mais a relação entre a autofagia induzida por Cur e seus efeitos na senescência de cBMSC, a autofagia foi modulada por pré-tratamento com rapamicina ou 3-MA. Obviamente, a atividade autofágica foi atenuada por 3-MA, enquanto RAP e Cur (1 uM) mostraram aumentar significativamente a autofagia (Figura 5). Consistente com relatórios anteriores [5], nossos achados também demonstram que a inibição da autofagia por 3-MA acelerou a senescência celular em cBMSCs. Efeitos quase consistentes na ativação da autofagia foram exercidos por Cur(1uMand RAP enquanto efeitos citoprotetores análogos em Assim, quando a autofagia foi inibida por 3-MA, os efeitos protetores exercidos por Cur diminuíram (Figura ), sugerindo que a autofagia induzida por Cur é um mecanismo molecular potencial para melhorar a senescência de cBMSC (Figura 7).

Sob condições fisiológicas, a autofagia ocorre em nível basal em todas as células eucarióticas para manter a homeostase celular. No entanto, várias condições de estresse podem levar à autofagia anormal, que influencia o destino das células, a menos que a autofagia seja restaurada a um nível ideal [41,44,64]. Nossa evidência confirmou que a autofagia induzida por Cur exibe efeitos benéficos na regulação da senescência de cBMSC. Nesse cenário, diversos estímulos produtores de estresse e configurações extracelulares devem ser cuidadosamente considerados antes do tratamento com Cur, e seria interessante investigar se a autofagia induzida por Cur pode melhorar seletivamente a função das MSCs em uma dose e duração predeterminadas. Além disso, um sistema de entrega de curcumina baseado em nanotecnologia exibiu melhores níveis de solubilidade e biodisponibilidade na fase aquosa [65,66]; pode ser uma ferramenta promissora para retardar e neutralizar a senescência de MSC. A resposta para a questão de saber se a autofagia é o principal mecanismo subjacente no atraso da senescência das MSC ainda requer mais detalhes que serão fornecidos por pesquisas futuras.

4. Materiais e Métodos

4.1. Animais

Amostras de medula óssea foram coletadas de 6 cadelas rurais chinesas adultas saudáveis ​​(12-meses de idade). Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade da Universidade Agrícola de Sichuan (aprovação nº2020-0608) e conduzidos de acordo com os padrões éticos das leis de proteção animal da República Popular da China.

4.2. Preparação da solução de curcumina

Cur(HPLC maior ou igual a 98 por cento, número CAS:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Pequim, China) foi dissolvido em DMSO para uma concentração de estoque de 20 mmol/ EU. filtrado através de uma membrana de filtro microporoso orgânico de 0,22 μm e armazenado a -80 grau. Diferentes soluções de Cur foram preparadas em um meio para estudo in vitro.

4.3. Cultura e Expansão Celular

As cBMSCs foram obtidas da medula óssea. As células foram cultivadas em um meio completo consistindo de meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glicose (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, EUA), 10 por cento de soro fetal bovino (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Pequim, China ) e 1% de penicilina/estreptomicina. Em uma confluência de 80-90 por cento, as células aderentes foram liberadas com solução de digestão de tripsina (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China) e expandidas em uma proporção de 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Curie de Crescimento Celular

Para determinar a capacidade proliferativa de cBMSCs nas passagens (P)3,6 e 9, as células foram semeadas em três 48-placas de poços (2500 células/poço). Após 48 h de incubação, as células foram liberadas com solução de digestão de tripsina e contadas com um hemocitômetro. O procedimento de contagem de células foi repetido a cada 48 horas e mantido por 14 dias.

4.5. Detecção de Imunofenótipo de cBMSCs por Citometria de Fluxo

Na 3ª passagem, as cBMSCs foram lavadas com PBS e tripsinizadas. As células (3 × 105 células/mL) foram ressuspensas no tampão de coloração e as suspensões de células (100 μL) foram incubadas com anticorpos monoclonais marcados com fluorescência FITC, PE ou APC contra os antígenos de superfície CD45, CD34 e ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) e CD31, CD90 e CD105 marcados não fluorescentes (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Pequim, China) por 15 min a 4 graus. As células foram lavadas com PBS e incubadas com IgG anti-coelho de cabra conjugado com FITC durante 15 min a 4 graus. Os antígenos de superfície foram detectados por citometria de fluxo (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). A análise dos dados foi realizada com o software CytExpert.

4.6. Ensaio de Diferenciação In Vitro

cBMSCs foram plaqueados a uma densidade de 5×104 células/mL em 6-placas de poços. Em 70-80 por cento de confluência, o meio completo foi substituído por um meio de indução de diferenciação osteogênica ou adipogênica e trocado a cada 3 dias (Cvagen, Suzhou, China). A deposição de cálcio foi detectada pela coloração com vermelho de alizarina S (Solarbio, Pequim, China) após 3 semanas de indução osteogênica e o acúmulo de gotículas lipídicas foi observado usando coloração com óleo vermelho O (Solarbio, Pequim, China) após 2 semanas de indução adipogênica.

4.7. Efeito da Cura na Viabilidade Celular

A viabilidade celular de cBMSCs foi determinada usando o kit CCK-8(Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China).Cistanche tubulosa benefícios e efeitos colateraiscBMSCs foram pré-cultivadas em uma 96-placa de poço por 24 h. cBMSCs foram tratadas com Cur em diferentes concentrações (0.1, 0.5, 1, 5 e 1{ {14}} umol/L) por 12h, 24h, 48h e 72h. As células foram tratadas com 0,1 por cento de DMSO, que foi usado como controle. Waltham, MA, EUA). A viabilidade celular relativa foi calculada de acordo com as instruções do fabricante.

4.8. Ensaio de Formação de Colônias

A eficiência de autorrenovação de cBMSCs foi detectada usando um ensaio de unidade formadora de colônia-fibroblasto （CFU-F）. cBMSCs foram semeados （3 × 10² células/poço） em 6-placas de poço. Após duas semanas de cultura, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento durante 30 min e observadas ao microscópio invertido (LX73, Olympus Corporation, Tóquio, Japão) após coloração com violeta de cristal a 1 por cento durante 10 min. Para o UFC-F, mais de 50 células foram contadas. A eficiência de UFC-F foi calculada da seguinte forma:

Eficiência de UFC-F=número de UFC-F/número de sementes (300 células)[68].

4.9. Ensaio de coloração de beta-galactosidase

A atividade da -galactosidase associada à senescência (SA- -gal) em cBMSCs foi estimada usando o kit de coloração SA- -gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante . Após a coloração, as células foram examinadas ao microscópio invertido. As células coradas positivamente foram contadas para avaliar a senescência celular.

4.10. PCR quantitativo em tempo real de transcrição reversa (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído dos pellets de células usando o método do reagente Trizol. O cDNA foi sintetizado usando o kit de reagentes PrimeScriptTM RT com o gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japão). Os primers de PCR (Tabela 2) além de GAPDH em referência a estudos anteriores [67] foram projetados usando o software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base em sequências de cDNA. A qPCR foi realizada usando TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japão) no CFX96 Touch Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). As condições de reação foram as seguintes: 95 graus por 3{16}} s e depois 39 ciclos de 95 graus por 5s e 60 graus por 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada a partir de 95 graus por 10s, depois variando de 65 a 95 graus, aumentando 0,5 graus a cada ciclo. O GAPDH foi usado como controle interno para normalizar todos os dados e a expressão relativa foi calculada pelo método comparativo do Cycle Threshold (Ct).

4.11. Rastreamento da UI Lusossomal LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China) foi usado para rastrear lisossomos, que podem exibir uma intensidade de fluorescência aumentada após a acidificação lisossomal. Semeamos cBMSCs em 12-placas de poços e as tratamos com Cur por 24 h, depois as células foram tratadas com Lyso-Tracker (60 nM) e Hoechst 33.342 (2 ug/mL) por 20 min. A fluorescência foi observada usando um microscópio de fluorescência invertido após lavagem com PBS.

4.12. Imunofluorescência

As cBMSCs (2×104 células/lâmina) foram semeadas em lâminas e fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min. Após co-incubação com 0,5 por cento de Triton X-100 por 5 min (Solarbio, Pequim, China), os cortes foram imersos na solução de bloqueio por 30 min. O líquido fechado foi removido e as células foram incubadas com anticorpos anti-LC3B (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA) durante a noite a 4 graus, depois incubadas com anticorpos secundários conjugados com fluorocromo (Abcam, Cambridge, MA, EUA) por 50 min a 37 graus C. Finalmente, as células foram contrastadas com DAPI (Beyotime Biotechnology, Xangai, China) e monitoradas sob um microscópio confocal.

4.13. Análise de Western Blotting

As amostras de células foram lisadas com o tecido e lisado celular (Solarbio, Pequim, China) contendo inibidor de protease após lavagem com PBS gelado. Os lisados ​​celulares contendo 15 ug de proteína por amostra foram carregados em géis de sódio-dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PA) (Solarbio, Pequim, China) e separados por eletroforese. Após a transferência das proteínas para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF), esta foi bloqueada de forma não específica com 5% de leite em pó desnatado (Solarbio, Pequim, China) por 1 hora em temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite com os anticorpos primários anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-p62/SQSTM1(1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, EUA ) e anti- -actina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) a 4 graus , e os blots foram lavados com TBST(Solarbio, Beijing, China) antes de incubar com anticorpo secundário (1 :2000, Abcam, Cambridge, MA, EUA) em 37 graus por 1 h. Posteriormente, as membranas foram desenvolvidas por exposição a reagentes de quimioluminescência (Millipore, Billerica, MA, EUA) e visualizadas com ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon-5200, Xangai, China). A densidade de banda foi quantificada usando o software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) para cada grupo e normalizada com -actina.

4.14. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

O pellet celular foi digerido e coletado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, depois fixado com glutaraldeído a 2,5 por cento (Solarbio, Pequim, China) por 2 h à temperatura ambiente. As amostras foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1 por cento por 1 h após a lavagem com PBS, em seguida, aumentamos a desidratação de maneira gradual em soluções de acetona e as incorporamos em resina epóxi 812 (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Bejing, China). Subsequentemente, seções de 50 nm foram obtidas do ultramicrótomo (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Alemanha). Os cortes foram corados com acetato de uranila (Zhongjingkevi, Pequim, China) por 10-15 min e citrato de chumbo (Zhongjingkei, Pequim, China) por 2 min. Todos os espécimes foram visualizados em um TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tóquio, Japão).

4.15. Análise estatística

Os resultados foram obtidos a partir de três experimentos independentes e todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). Os valores estatísticos foram analisados ​​usando o IBM SPSs Statistics 25 e ilustrados usando GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por meio de uma análise de variância unidirecional (ANOVA) e o teste t de Student. valores p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Conclusões

Nossas descobertas lançam luz sobre a relação entre Cur, senescência de cBMSC e autofagia. Os dados do nosso estudo sugerem que o Cur pode aliviar o estado de senescência das cBMSCs enquanto ativa a autofagia e promove a acidificação lisossomal. Além disso, outras evidências demonstraram que a autofagia induzida por Cur é um mecanismo potencial para melhorar a senescência de cBMSC. Cur pode ser um promissor ativador e conservador para melhorar a função das MSCs. Em nossa opinião, os efeitos positivos do Cur no envelhecimento não podem ser negligenciados. Estudos futuros devem se concentrar no efeito da regulação do Cur no destino das MSCs para aumentar o potencial terapêutico das MSCs em várias doenças, como danos nos tecidos e doenças degenerativas e inflamatórias.

Este artigo é extraído de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms