Potencial Cosmecêutico de Extratos Derivados de Resíduos da Indústria Pesqueira: Resíduos de Sardinha e Armações de Bacalhau Parte 1

Abstrato: A indústria pesqueira gera grandes quantidades de resíduos (20–75 por cento (p/p) do peso total dos peixes capturados). A recuperação de compostos bioativos de resíduos e sua incorporação em cosméticos representa uma promissora oportunidade de mercado e pode contribuir para uma valorização sustentável do setor. Neste trabalho, extratos ricos em proteínas obtidos por tecnologias de alta pressão (CO2 supercrítico e água subcrítica) de resíduos de sardinha (Sardina pilchardus) e bacalhau (Gadus morhua) foram caracterizados quanto ao seu potencial cosmecêutico. As atividades antioxidante, anti-inflamatória e antibacteriana foram avaliadas por meio de ensaios químicos (ensaio ORAC), enzimáticos (inibição de elastase e tirosinase), suscetibilidade antimicrobiana (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Cutibacterium acnes) e ensaios celulares (em queratinócitos-HaCaT). . Os extratos de sardinha apresentaram a maior atividade antibacteriana, sendo que a seção obtida com temperaturas de extração mais altas (250 ◦C) e sem a etapa de desengorduramento apresentou os menores valores de concentração inibitória mínima (CIM) (1,17; 4,6; {{24} },59 mg/mL para K. pneumoniae, S. aureus e C. acnes, respectivamente). Amostras de bacalhau extraídas em temperaturas mais baixas (90 ◦C) foram os agentes anti-inflamatórios mais eficazes (uma concentração de 0,75 mg/mL reduziu os níveis de IL-8 e IL-6 em 58 por cento e 47 por cento, respectivamente , em relação ao controle positivo). Os teores de treonina, valina, leucina, arginina e proteína total nos extratos foram destacados para se correlacionar altamente com as bioatividades relatadas (R2 maior ou igual a 0,7). Esses resultados suportam a potencial aplicação de extratos de resíduos da indústria pesqueira em produtos cosmecêuticos com atividades bioativas.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave: valorização dos riachos de dejetos pesqueiros; atividade antioxidante; atividade antiinflamatória; actividade antimicrobiana; anti-envelhecimento; anti-hiperpigmentação; cosmecêuticos

1. Introdução

Com a busca constante por inovação, principalmente de princípios ativos, a indústria cosmética vem crescendo e tem demonstrado a intenção de substituir os componentes derivados do petróleo avançando em direção aos compostos naturais [1]. As propriedades antioxidantes dos ingredientes ativos naturais podem ajudar na prevenção de vários problemas de pele causados ​​pelo estresse oxidativo e envelhecimento [2,3]. O envelhecimento da pele pode ser induzido por fatores intrínsecos (como inflamação ou encurtamento dos telômeros) e extrínsecos (ambientais) [4]. O envelhecimento da pele leva à perda de colágeno maduro e alterações na matriz extracelular (MEC) que comprometem a função de barreira, resultando em aparência seca e suscetibilidade a agressores externos, aumentando o risco de desordens cutâneas [5]. Esse processo pode ser acelerado por várias enzimas, como elastase, metaloproteinases de matriz (MMPs) e hialuronidases que podem induzir a degradação da MEC [6], ou ainda pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO) que podem comprometer o funcionamento normal da célula [7]. Fatores ambientais, como a exposição à radiação ultravioleta, levam à geração de altas quantidades de ROS que induzem as mesmas respostas moleculares e celulares do envelhecimento intrínseco, mas com efeitos amplificados. É importante ressaltar que as ROS podem intensificar a atividade de enzimas relacionadas ao envelhecimento da pele ou aos processos de pigmentação da pele [8,9] e, portanto, a presença de antioxidantes n desempenha um papel importante no campo cosmético.

Em 2018, o consumo mundial de peixe foi estimado pela FAO em 20,5 kg por pita [10], o que leva a grandes quantidades de subprodutos, principalmente pele e ossos. Os resíduos gerados correspondem a 20-75 por cento (p/p) do peso total dos peixes capturados, levando potencialmente a problemas ambientais [11,12]. No entanto, esses resíduos ainda contêm uma quantidade significativa de lipídios, proteínas e minerais e devem ser adequadamente valorizados. Nos últimos anos, extratos de resíduos gerados pela indústria pesqueira têm demonstrado propriedades ativas como anti-hipertensivo, antioxidante, antimicrobiano, neuroprotetor, anti-hiperglicêmico, anti-envelhecimento e anti-inflamatório [13-19]. O bacalhau do Atlântico (Gadus rhea) e a sardinha (Sardina pilchardus) estão entre os peixes mais consumidos em Portugal e os extratos derivados dos seus resíduos têm demonstrado potencial nutracêutico promissor, como atividade antioxidante, antiproliferativa ou anti-inflamatória [11,20–22]. No entanto, como a exploração e valorização dos resíduos da indústria pesqueira ainda estão em estágio inicial, há muito espaço para explorar oportunidades para a indústria converter esses resíduos em bioprodutos de alto valor comercial, incluindo ingredientes cosméticos.

Em trabalhos anteriores, exploramos o uso de tecnologias de alta pressão (CO2 supercrítico e água subcrítica), para isolar frações bioativas de resíduos de sardinha e quadros de bacalhau com benefícios promissores para a saúde [11,22]. Para resíduos de sardinha, demonstramos que aplicando uma primeira etapa com carbono supercrítico (ScCO2) (para remover a fração lipídica) seguida de um processo de extração com água subcrítica (SW) foi possível obter hidrolisados ​​proteicos com alto potencial antioxidante e efeito antiproliferativo em células de câncer colorretal [22]. A extração/hidrólise de água subcrítica também foi aplicada para obter extratos enriquecidos com proteínas, peptídeos e aminoácidos de estruturas de bacalhau e mostramos que temperaturas de processamento mais baixas (90 ◦C) favorecem a extração de compostos com potencial anti-inflamatório em uma célula epitelial intestinal humana modelo [11]. A maioria das proteínas presentes nos extratos de estrutura de bacalhau são colágeno e fragmentos de colágeno. Outros compostos incluem pequenas quantidades de lipídios, cinzas e alguns açúcares. Os extratos de sardinha eram ricos em peptídeos e aminoácidos, e também estavam presentes lipídios, cinzas e açúcares. Uma vez que as proteínas e peptídeos derivados de peixes podem se tornar um recurso importante para as indústrias de cosméticos, o presente estudo visa avaliar ainda mais o potencial ativo desses extratos derivados de resíduos e subprodutos do processamento de peixes, causado pela avaliação de seu potencial cosmecêutico [23] . Para este propósito, uma série de ensaios químicos, enzimáticos e baseados em células foram aplicados para explorar os efeitos antioxidantes, antienvelhecimento, anti-hiperpigmentação, anti-inflamatórios e antimicrobianos das amostras extraídas. Estudos de correlação também foram realizados para identificar os principais constituintes bioativos com potencial cosmecêutico.

2. Materiais e métodos

2.1. Reagentes

3,4-dihidroxi-l-fenilalanina (L-DOPA), tirosinase de cogumelo, elastase pancreática suína (PPE) tipo III, N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (AAAPVN), Tris ({ {11}}amino- 2-hidroximetil-propano-1,3-diol), 2,20 -azobis (2-metilpropionamidina)dicloridrato (AAPH) e 20 ,70 -diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O caldo Mueller Hinton ajustado para cálcio (CAMHB) foi adquirido da BD (Sparks, MD, EUA). A infusão cérebro-coração (BHI) foi adquirida da Avantor (Radnor, PA, EUA). Os sachês AnaeroGen™ Compact foram adquiridos da Oxoid (Hampshire, Reino Unido). PrestoBlue™, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e penicilina-estreptomicina foram obtidos da Invitrogen (San Diego, CA, EUA). A linha celular de queratinócitos não tumorigênicos humanos imortalizados HaCaT foi obtida de Cell Line Service (Eppelheim, Alemanha). Os kits de desenvolvimento IL-8 e IL-6 Mini TMB ELISA humanos foram obtidos da Peprotech (Londres, Reino Unido). Todos os outros reagentes e solventes utilizados no presente estudo eram de grau analítico e adquiridos de fornecedores disponíveis.

2.2. Amostras

Os extratos utilizados neste trabalho foram os desenvolvidos em nossos estudos anteriores focados na otimização de processos [11,22]. Resumidamente, as armações de bacalhau foram fornecidas pela Pascoal e Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portugal) e consistiam em espinha dorsal de peixe e músculo aderido. Os desperdícios de sardinha, constituídos por cabeças, espinhos e vísceras, foram fornecidos pela Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugal). A composição aproximada das matérias-primas utilizadas foi apresentada em nossos trabalhos anteriores [11,22]. Proteína (47 por cento em peso) e cinzas (39 por cento em peso) foram os principais componentes das estruturas do bacalhau, com pequenas quantidades de lipídios e carboidratos (2 por cento em peso e 0,3 por cento em peso, respectivamente). O colágeno é a principal proteína na estrutura do bacalhau e, neste caso, representa ca. 65 por cento do conteúdo total de proteína dos resíduos originais. Em contrapartida, a sardinha é um peixe oleoso, pelo que os seus resíduos são muito mais ricos em lípidos do que os quadros do bacalhau. Os resíduos de sardinha apresentaram um teor de lipídios de 26% em peso e um teor de proteína de 52% em peso, sendo o restante cinzas (17% em peso) e carboidratos (3% em peso).

Os extratos de armações de bacalhau (Cf1, Cf2, Cf3 e Cf4) e resíduos de sardinha (S1, S2 e S3) selecionados para este trabalho foram obtidos por tecnologia de alta pressão em um aparelho de escala de laboratório conforme descrito anteriormente [11,22 ,24] usando as condições resumidas na Tabela 1. Resumidamente, 60 g de armações de bacalhau moído ou resíduo de sardinha (desengordurado ou não) foram carregados em um reator de alta pressão que foi colocado dentro de um forno. A bomba de água foi ligada na vazão desejada (ca. 10 mL/min) e a pressão foi ajustada para 100 bar. Assim que a pressão atingia esse valor, o forno elétrico era ligado e o experimento começava. Os diferentes extratos foram coletados por 30 minutos em diferentes temperaturas (90–250 ◦C). Os extratos S1 e S3 foram obtidos após um processo de desengorduramento dos resíduos de sardinha por ScCO2 antes da extração de SW. Experimentos de extração de água subcrítica foram duplicados. Para cada amostra extraída, 25 mL foram retirados em triplicata, liofilizados e pesados ​​para calcular o rendimento de extração correspondente. Dados analíticos — conteúdo de proteína — são expressos como média ± desvio padrão (SD) de triplicado. As informações sobre a caracterização desses extratos quanto ao teor de proteínas, perfil de aminoácidos, principais compostos minerais ou tóxicos e metais pesados ​​são descritas em nossos trabalhos anteriores [11,22].

As soluções estoque de Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 e S2 foram preparadas em Milli-Q H2O a uma concentração de 100 mg/mL. As outras amostras, S1 e S3, foram dissolvidas em DMSO (300 e 550 mg/mL, respectivamente) devido à sua menor solubilidade em água. As amostras foram congeladas e mantidas a -20 ◦C até o uso posterior. Para os ensaios celulares, as amostras foram previamente esterilizadas por calor (121 ◦C, 15 min) em autoclave (Tuttnauer 3870 el, Breda, Holanda).

2.3. Ensaio de capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC)

O ensaio ORAC foi realizado para avaliar a capacidade antioxidante das amostras frente aos radicais peroxil (ROO•), seguindo o método desenvolvido por Huang et al. [25], com alguns ajustes conforme relatado anteriormente [26]. Resumidamente, em uma microplaca 96-poço preta, 150 µL de fluoresceína dissódica (0,3 µM) foram adicionados a 25 µL de diluições de amostra e incubados por 10 min a 37 ◦C. Em seguida, a reação foi iniciada pela adição de 25 µL de 2,20 - Azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH, 153 mM) e fluorescência (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm) foi medido por 40 min a 37 ◦C em um leitor de microplacas de fluorescência FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EUA). Uma curva padrão foi preparada usando 5, 10, 20, 30 e 40 µM de (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- ácido carboxílico (Trolox )). Todas as soluções foram preparadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS), 75 mM, pH 7,4. Os resultados são expressos em micromoles de capacidade antioxidante equivalente Trolox por grama de extrato (µ mol TEAC/g extrato).

2.4. Ensaios Enzimáticos

2.4.1. Ensaio de inibição de elastase

Este ensaio foi baseado no trabalho de Wittenauer et al. [27] com algumas modificações conforme descrito anteriormente [6]. A atividade inibitória da elastase é determinada por um método espectrofotométrico usando elastase pancreática suína (PPE) e N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (AAAPVN) como enzima-substrato, monitorando a liberação de p-nitroanilina a 41{ {19}} nm. O PPE foi dissolvido em 100 mM Tris (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol)-HCl tampão (pH=8.0) até a concentração de 1 mg/mL e armazenados a 20 ◦C em alíquotas. No dia do ensaio, uma alíquota foi tomada e diluída no tampão até uma concentração de 0,03 U/mL, 10 µL foram carregados nos poços das placas de microtitulação juntamente com 100 µL do tampão Tris-HCl e 30 µL de cada amostra. Após 20 min de pré-incubação a 25 ◦C, a reação foi iniciada pela adição de 40 µL do substrato AAAPVN (0,55 mM). A absorbância foi medida por 20 min após a adição de AAAPVN em um leitor de microplacas espectrofotômetro BioTek Instruments EPOCH 2. Os cálculos foram feitos conforme descrito na Equação (1), onde A controle e Aamostra representam a absorbância a 410 nm na ausência ou presença da amostra, respectivamente. Como o DMSO foi usado para dissolver as amostras S1 e S3, esse solvente também foi testado e usado como controle para essas amostras. O potencial dos extratos para inibir a elastase foi avaliado com concentrações crescentes, para determinar relações dose-dependentes e estabelecer os valores de metade das concentrações inibitórias máximas (IC50), indicando a capacidade de cada amostra na inibição da atividade enzimática em uma extensão de 50 por cento.

Todos os resultados são expressos como valores médios de IC50 com os limites inferior e superior de um intervalo de confiança de 95%, obtidos de pelo menos três experimentos independentes.

2.4.2. Ensaio de Inibição da Tirosinase

O potencial inibitório da tirosinase dos extratos foi avaliado espectrofotometricamente usando tirosinase de cogumelo e L-DOPA como substrato [28]. A tirosinase converte L-DOPA em dopaquinona, que ciclizará sequencialmente para formar dopacromo. A formação do dopacromo pode ser observada pela medição da absorbância a 475 nm. O substrato foi adicionado à enzima na presença das diluições das amostras, até uma concentração final de 30 U/mL de tirosinase e 2,5 mM de L-DOPA. Como o DMSO foi usado para dissolver as amostras S1 e S3, esse solvente também foi testado e usado como controle para essas amostras. Após incubação a 37 ◦C por 30 min, a absorbância foi medida a 475 nm em um espectrofotômetro de microplacas BioTek Instruments EPOCH 2. Todos os reagentes foram preparados em tampão fosfato de sódio (SPB; 0,1 M, pH 6,8), preparado pela mistura de fosfato de sódio dibásico dihidratado e fosfato de sódio monobásico monohidratado, e os cálculos foram feitos conforme descrito na Equação (1). Todos os resultados são expressos como valores médios de IC50 com os limites inferior e superior de um intervalo de confiança de 95%, obtidos de pelo menos três experimentos independentes.

2.5. Teste de Suscetibilidade Antimicrobiana

Os microrganismos alvo selecionados para os ensaios de atividade antibacteriana foram as bactérias gram-negativas Klebsiella pneumoniae CECT 8453 e as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Cutibacterium acnes ATCC 6919T. Para K. pneumoniae CECT 8453 e S. aureus ATCC 6538, os ensaios foram realizados de acordo com o método de microdiluição em caldo das diretrizes CLSI M07-A10 conforme descrito anteriormente por Rodrigues et al. [29]. Em suma, as soluções estoque de extrato foram distribuídas em uma placa de microtitulação 96-de fundo redondo e 2-diluídas em série em caldo Mueller Hinton ajustado para cálcio (CAMHB; BD, Sparks, MD, EUA) para obter um faixa de concentração de soluções. O inóculo foi preparado usando o método de crescimento para obter uma suspensão homogênea em solução salina. O inóculo ajustado foi adicionalmente diluído em CAMHB para garantir que, após a inoculação, cada poço continha cerca de 5 × 104 UFC. As placas foram incubadas em condições aeróbicas a 37 ◦C por 16 a 20 h. Para C. acnes, os ensaios foram realizados conforme descrito anteriormente com o uso de caldo de infusão cérebro-coração (BHI) (Avantor, Radnor, PA, EUA) em vez de CAMHB e incubando as placas de microtitulação por 70–74 h a 37 ◦ C em frascos anaeróbicos contendo o sistema de geração de atmosfera AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, Reino Unido).

Para cada solução estoque analisada, um controle positivo (CAMHB ou BHI e inóculo diluído), um controle de esterilidade média (CAMHB ou BHI não inoculado) e um controle de esterilidade de extrato (solução estoque de extrato 2- vezes não inoculada em CAMHB ou BHI) foram executados em conformidade. Os valores de concentração inibitória mínima (MIC) foram a concentração mais baixa de uma amostra que inibiu visivelmente o crescimento microbiano após a incubação. Quando necessário, os valores de MIC foram confirmados usando o reagente de viabilidade celular PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA EUA) seguindo as orientações do fabricante. Um valor MIC adicional, designado MIC*, também foi estabelecido e definido como a concentração mais baixa de uma amostra na qual o crescimento bacteriano foi afetado visual e diferencialmente em comparação com o controle positivo. Os valores de concentração bactericida mínima (MBC) foram relatados como a concentração mais baixa de uma amostra levando a uma redução de pelo menos 99,9 por cento nas contagens de bactérias viáveis ​​em comparação com o inóculo inicial e para igual tempo de incubação. Os resultados foram expressos como uma mediana dos valores obtidos após três repetições biológicas. Como o DMSO foi usado para dissolver as amostras S1 e S3, esse solvente também foi testado para garantir que a concentração final usada não interferisse no microrganismo alvo, daí o ensaio.

2.6. Ensaios Baseados em Células

2.6.1. Cultura de células

A linhagem de células de queratinócitos humanos HaCaT (CLS, Alemanha) foi cultivada em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) padrão suplementado com 10 por cento (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1 por cento (v/v) de penicilina-estreptomicina. As células foram rotineiramente mantidas como monocamadas em frascos de cultura de 75 cm2 e incubadas a 37 ◦C com 5% de CO2 em atmosfera umidificada.

2.6.2. Citotoxicidade In Vitro

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados de acordo com trabalhos anteriores [6]. Resumidamente, as células HaCaT foram semeadas a uma densidade de 1,4 × 105 células/cm2 em placas de 96 poços. Após 3 dias, as células foram incubadas com diferentes concentrações de cada amostra (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, {{30} },78, 0,39; S1—3, 1,5, 0,75, 0,38, {{40}},19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5,5, 2,75, 1,38, 0,69, 0,34, 0,17, 0,09, 0,04 mg/mL) diluído em meio de cultura (meio DMEM contendo 0,5% de FBS). Poços contendo células incubadas apenas com meio de cultura suplementado com 0,5 por cento (v/v) de FBS foram usados ​​como controle. Controles de solvente com 50 por cento de água ou 1 por cento de DMSO em um meio de cultura também foram realizados para excluir a toxicidade do solvente. Após 24 h de incubação, a viabilidade celular foi avaliada com PrestoBlue® (5 por cento v/v em meio de cultura) por 2 h a 37 ◦C, 5 por cento de CO2, conforme instruções do fabricante. Depois disso, a fluorescência de cada poço foi medida (Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) em um leitor de microplacas de fluorescência FLx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular foi expressa como a porcentagem de células viáveis ​​em relação ao controle. Três experimentos independentes foram realizados em triplicata.

2.6.3. Atividade Antioxidante Celular

A atividade antioxidante celular foi avaliada seguindo métodos previamente descritos [6,30], com algumas modificações. Resumidamente, as células HaCaT foram semeadas a uma densidade de 1,4 × 105 células/cm2 em placas de 96 poços e a formação de ROS intracelulares foi monitorada usando 20,70 -diacetato de diclorofluoresceína ( DCFH-DA) como uma sonda fluorescente. 72 h após a semeadura, as células foram lavadas com PBS e incubadas com concentrações não tóxicas das amostras (0,1875 mg/mL; 0,375 mg/mL; 0,75 mg/mL) mais 25 µM DCFH-DA em PBS por 1 h. Posteriormente, as células foram lavadas novamente com PBS e incubadas com o indutor de estresse (600 µM AAPH em PBS) por 1 h. Em seguida, a fluorescência foi medida em um leitor de fluorescência de microplacas FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EUA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). Os resultados são expressos como porcentagem de ROS em relação ao controle não tratado (células tratadas com DCFH-DA e AAPH). Três experimentos independentes foram realizados em triplicata.

2.6.4. Avaliação da secreção de IL-6 e IL-8

Os experimentos foram realizados conforme descrito anteriormente [31], com várias modificações. Resumidamente, as células HaCaT foram semeadas a uma densidade de 1 × 105 células/cm2 em placas de 12 poços. Após 3 dias, as células foram estimuladas com 15 µg/mL de lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli e co-incubadas com três concentrações diferentes de cada extrato ({{10}}0,1875 mg/mL; {{ 14}},375 mg/mL; 0,75 mg/mL) diluído em meio de cultura (meio DMEM contendo 0,5 por cento de FBS). Células incubadas apenas com LPS e células incubadas apenas com meio de cultura foram usadas como controles positivos e negativos, respectivamente. Após 24 h, os sobrenadantes foram coletados, centrifugados por 10 min a 2.000 g e armazenados a -80 ◦C até análise posterior. Os níveis de IL-6 e IL-8 foram avaliados por ensaio imunoenzimático (ELISA), usando kits disponíveis comercialmente (PeproTech; Londres, Reino Unido), de acordo com as instruções do fabricante, com absorbância medida a 450 nm com correção de comprimento de onda definido em 620 nm em um espectrofotômetro de microplacas (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). Os resultados são expressos como porcentagem de IL-6 ou IL-8 em relação ao controle positivo (células estimuladas com LPS). Três experimentos independentes foram realizados em triplicata.

2.7. Análise estatística

Os resultados do ORAC e do ensaio baseado em células são expressos como o valor médio ± SD, obtido de pelo menos três experimentos independentes. Para os ensaios enzimáticos e de citotoxicidade, os valores de IC50 foram determinados a partir de curvas de dose-resposta por meio de gráficos de log10 usando GraphPad Prism 8.4.3. software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). Os resultados são apresentados como IC50 com um intervalo de confiança de 95 por cento. A análise estatística dos resultados foi realizada com o software anterior. Quando verificada variância homogênea e distribuição normal dos dados, os resultados foram analisados ​​pela análise de variância (ANOVA) one-way, seguida do teste de Tukey para comparações múltiplas. No caso de variâncias heterogêneas ou se os dados não foram distribuídos normalmente, um teste t de Student não pareado apropriado foi realizado para determinar se as médias eram significativamente diferentes. Um valor de p menor ou igual a 0,05 foi aceito como estatisticamente significativo em todos os casos. Os resultados dos testes de suscetibilidade antimicrobiana são expressos como o valor médio, obtido de pelo menos três experimentos independentes.

3 Resultados e discussão

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45,7 g/100 g) foram escolhidos. Os resultados referentes ao teor de proteína total de cada extrato são apresentados na Tabela 1.

3.1. Atividades antioxidantes, antienvelhecimento e anti-hiperpigmentação

O potencial efeito cosmecêutico dos extratos foi inicialmente rastreado usando ensaios químicos e enzimáticos para avaliar seus efeitos antioxidantes, antienvelhecimento e anti-hiperpigmentação. Para a capacidade antioxidante, o ensaio ORAC foi selecionado, pois mede a capacidade das amostras de eliminar ROS biologicamente relevantes, ou seja, radicais peroxil, que são considerados um dos principais indutores do envelhecimento da pele [2,32]. O efeito antienvelhecimento também foi avaliado através da inibição da elastase, uma vez que esta enzima é relatada como responsável pela degradação da elastina e outras proteínas da MEC [6]. Para o efeito anti-hiperpigmentação, foi utilizado o ensaio da tirosinase, para avaliar a capacidade das amostras de inibir a produção de melanina. A Tabela 2 resume os valores ORAC e IC50 de todos os extratos.

Nossos resultados mostram que os extratos de sardinha e bacalhau apresentaram atividade antioxidante e efeitos inibitórios sobre a atividade das enzimas elastase e tirosinase. Entre as amostras de sardinha, S1 apresentou o maior valor ORAC (1,94 ± 0,08 µmol TEAC/mg extrato), seguido por S3 e S2. Esses resultados são de uma avaliação antioxidante prévia por meio de um método alternativo (ensaio 2,2-difenil-1-picrilhidrazil-DPPH) onde o extrato S1 apresentou os menores valores de IC50 [22]. A maior capacidade de eliminação de radicais peroxil da amostra S1 pode ser derivada de peptídeos com diferentes sequências de aminoácidos presentes nos extratos, uma vez que as interações entre eles podem influenciar a capacidade de eliminação de radicais [33]. Além disso, compostos gerados em Maillard ou outras reações de termo-oxidação podem influenciar a atividade antioxidante das amostras [34]. Apesar do menor valor de ORAC, as amostras S2 e S3 foram as que apresentaram maior capacidade em inibir as atividades da tirosinase e da elastase, respectivamente.

Entre os extratos de bacalhau, o Cf4 demonstrou ter as maiores atividades antioxidantes e anti-hiperpigmentação. A análise SEC-GPC dos extratos mostrou que peptídeos de peso molecular decrescente foram obtidos ao aumentar a temperatura de extração até 250 ◦C [11]. A capacidade de inibição da elastase desta amostra está dentro do intervalo de valores encontrados para outros extratos de Cf, nomeadamente Cf1 e Cf3. No entanto, para as concentrações testadas, esses dois extratos não apresentaram atividade de inibição da tirosinase.

Na literatura, alguns relatos mostram que extratos de subprodutos marinhos apresentam relevante atividade antioxidante e inibição da tirosinase. Por exemplo, extratos derivados de subprodutos marinhos (Scophthalmus maximus) por hidrólise alcalina demonstraram atividade antioxidante acessada por diferentes ensaios químicos: 1,1-difenil-2- picrilhidrazil (DPPH) capacidade de eliminação de radicais ( 36,12 por cento sobre o controle), método ABTS (2,20 -azinobis-(3-etil-benzotiazolina-6-ácido sulfônico) (12,81 µg BHT/mL) e ensaio de branqueamento de crocina (8.{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35] Em outro estudo, a extração enzimática de água-viva salgada com alume (Lobonema smithii) mostrou produzir hidrolisados ​​com alta atividade antioxidante (IC{{20}}). 9 mg/mL para ensaios ABTS e DPPH) e potencial inibitório da tirosinase, com valores de IC50 variando entre 14,1 e 24,5 mg/mL [36], que estão na mesma ordem de grandeza dos obtidos neste trabalho Adicionalmente, extractos com valores antioxidantes semelhantes (valores ORAC – 0.4 a 3,5 µmol TEAC/mg extracto) foram obtidos a partir de outro tipo de resíduos da indústria alimentar, nomeadamente fluxos de resíduos da vinificação [6]. No entanto, estes extratos de resíduos da vinícola apresentaram capacidades inibitórias de tirosinase (IC50 de 4,0 a 0,14 mg extrato/mL) e elastase (IC50 de 3,4 a 0,1 mg extrato/mL) superiores às obtidas neste trabalho, provavelmente devido à presença de compostos fenólicos que são reconhecidas por terem várias bioatividades. É importante mencionar que em nosso estudo usamos a tirosinase de cogumelo para rastrear o efeito anti-hiperpigmentação dos extratos, pois essa enzima tem sido amplamente utilizada em ensaios de alto rendimento [37]. No entanto, uma vez que existem algumas controvérsias sobre a semelhança e homologia desta enzima com tirosinase mamífera/humana [38-40], estudos futuros envolvendo linhagens celulares de mamíferos devem ser considerados para avaliar o potencial efeito anti-hiperpigmentação de extratos de sardinha e bacalhau.

Para identificar quais compostos poderiam ser responsáveis ​​pela resposta bioativa dos extratos, foram realizados estudos de correlação entre os dados de bioatividade e a composição de aminoácidos dos extratos relatados anteriormente [11,22] (Tabela S1). Para a atividade antioxidante, as maiores correlações (R2 maior ou igual a 0,7) foram obtidas entre o valor ORAC e treonina total, valina livre, bem como leucina livre e total para todos os extratos. No caso das amostras de sardinha, uma alta correlação (R2 maior ou igual a 0.94) também foi obtida para o conteúdo de triptofano livre e total. Consequentemente, todos esses aminoácidos foram previamente relatados como tendo propriedades antioxidantes em vários sistemas modelo [41-43]. Para as atividades de inibição da elastase e da tirosinase, os maiores coeficientes de correlação (R2 maior ou igual a 0.8) foram obtidos para teor de proteína total e arginina livre, respectivamente, sugerindo que esses compostos podem ter um papel importante no potencial efeito anti-envelhecimento e anti-hiperpigmentação de extratos de fluxos de resíduos da indústria de peixe.

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