Clonagem, identificação funcional e análise de expressão da chalcona sintase de Cistanche Tubulosa

Resumo: Objetivo

Para estudar a função dechalcona sintase de Cistanche tubulosae o padrão de expressão do gene CtCHS em flores brancas, vermelhas e roxas.

MétodosO gene CtCHS foi clonado por RT-PCR e realizada análise bioinformática. O plasmídeo pET-28a-CtCHS foi transferido para Escherichia coli para induzir a expressão proteica por IPTG. A proteína recombinante CtCHS foi incubada com os substratos p-coumaroil CoA e malonil CoA, e os produtos foram detectados por HPLC e MS. O plasmídeo pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS foi transferido para o protoplasto de Arabidopsis thaliana para observar a localização subcelular da proteína CtCHS. O padrão de expressão do gene CtCHS nas flores de C. tubulosa com três cores foi detectado por qRT-PCR.

ResultadosUm gene CtCHS foi clonado. O comprimento do quadro de leitura aberto (ORF) foi de 1173 pb, codificando 390 aminoácidos, e o peso molecular da proteína foi 42 8000.

EXTRATO DE CISTANCHE ORGÂNICO COM 30% EQUINACOSÍDEO E 12% ACTEOSÍDEO

CtCHS continha os resíduos catalíticos Cys164, His303, Asn336, que foram conservados em chalcona sintase. A proteína CtCHS foi expressa em E. coli e purificada para obtenção da proteína recombinante. A proteína CtCHS poderia catalisar p-cumaroil CoA e malonil CoA para produzir naringenina chalcona. A proteína CtCHS estava localizada principalmente no citoplasma. O gene CtCHS foi altamente expresso em flores roxas e vermelhas, e os níveis de expressão relativa foram 8,44 e 3,21 vezes maiores que em flores brancas, respectivamente.

Conclusão Um gene CtCHS foi clonado da flor de C. tubulosa e a proteína foi expressa. A proteína CtCHS tem função de chalcona sintase, e a expressão do gene CtCHS é maior em flores mais escuras, indicando que o gene CtCHS pode regular a cor da flor de C. tubulosa, o que estabelece uma base para futuras pesquisas sobre o mecanismo de regulação da cor da flor de C. . tubulosa.

Palavras-chave: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcona sintase; análise de atividade enzimática; localização subcelular; análise de expressão

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT é a planta do gênero Pyreal, que é naturalmente distribuída no sul de Xinjiang [1] na área Hetian de Xinjiang [2]. As flores de cachimbo têm alto valor medicinal. Seus caules de carne são uma das fontes da versão 2020 de "Farmacopeia Chinesa". [3] A pesquisa sobre as flores de cachimbo e os caules de carne de cordonus aumentou, mas há relativamente poucas pesquisas biológicas sobre suas flores. O período de floração das flores de cachimbo é de abril a maio [4], principalmente Existem três cores de branco , vermelho e roxo As flores tubulares são ricas em cores, mas seu mecanismo de regulação da cor das flores não foi relatado ao tipo, conteúdo, conteúdo e distribuição da estrutura do tecido das pétalas, pigmento e regulação de fatores ambientais. e fatores genéticos [5]. O pigmento nas flores das plantas inclui principalmente três categorias: flavonóides, caroteno e beterraba. Cor, a mais ampla gama de cores [7]. como as três variedades de Paeonia Lactiflora Pall.

Aparece como branco, e a cor principal da cor contém a cor do vermelho e a bela competência faz com que as flores se apresentem como vermelho-púrpura [8]. A cor floral é uma característica importante de muitas plantas ornamentais e também é o principal fator que atrai os insetos rosa [9]. Estudos demonstraram que é transmitido. A maior frequência de visitas de insetos é a planta cistanche roxa profunda [10]. Para a pesquisa biológica sobre a pesquisa genética sintética de cistanóides nas flores do cistanosaurus da flor tubular, é propício para esclarecer o mecanismo de controle da coloração do cordão da flor tubular, fornecendo base teórica para melhorar a cor da tecnologia de engenharia genética, promovendo suas cores mais ricas, aumentando a visualização, expandindo o escopo das aplicações.

A via biossintética deflavonóidescomeça com ovia fenilpropanóide. A fenilalanina é primeiro convertida em ácido cinâmico sob a ação da fenilalanina amonialiase (PAL), e o ácido cinâmico é 4-hidroxilado pelo ácido cinâmico. A enzima (ácido cinâmico-4-hidroxilase, C4H) e 4-cumarato coenzima A ligase (4-cumarato coenzima A ligase, 4CL) catalisam a reação para gerar 4-cumaroil-CoA [11]. Uma molécula de 4-cumaroil-CoA e três moléculas de malonil-CoA são catalisadas pela chalcona sintase (CHS) para gerar naringenina chalcona, que temcompostos flavonóides.O esqueleto básico da chalcona isomerase, flavanona -3- hidroxilase, diidroflavonol 4- redutase, etc. gera uma variedade de flavonóides, como isoflavonas, flavonóis, antocianinas, etc. Como uma enzima chave na via biossintética dos flavonóides, o CHS regula o conteúdo de flavonóides nas plantas e também desempenha um papel importante na regulação da cor das flores das plantas [13]. Por exemplo, o silenciamento gênico pós-transcricional de Gentiana scabra Bunge CHS pode inibir a biossíntese de antocianinas e causar branqueamento específico dos lóbulos da corola [14]. Silenciamento do gene CHS de Actinidia eriantha Benth. O CHS reduz o teor de antocianinas nas pétalas e faz com que a cor das pétalas vermelhas fique mais clara [15]. Portanto, neste estudo, um gene CtCHS foi clonado de flores de Cistanche deserticola, e análise de bioinformática, expressão e purificação procariótica, análise de atividade enzimática, análise de localização subcelular e análise de expressão em três cores de flores foram realizadas para explorar a função de CtCHS A proteína e o padrão de expressão do gene CtCHS foram usados ​​para explorar preliminarmente a relação entre CtCHS e a cor da flor Cistanche deserticola, o que lançou as bases para o estudo do mecanismo regulatório da cor da flor Cistanche deserticola.

1 Materiais e instrumentos

1.1 Materiais

Flores de Cistanche tuberosa foram coletadas no condado de Yutian, província de Hotan, Xinjiang em maio de 2018. O princípio aleatório foi seguido durante a amostragem, e flores de Cistanche tuberosa com bom estado fisiológico e altura de planta consistente foram selecionadas. Três cepas de Cistanche deserticola com três cores de flores brancas, vermelhas e roxas foram colhidas e identificadas como Cistanche tubulosa (Schenk) Wight pelo professor Tu Pengfei da Escola de Farmácia da Universidade de Pequim. Eles foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido, armazenados em gelo seco e transportados para Pequim. Células quimicamente competentes de E. coli DH5 foram adquiridas à Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., e células quimicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) foram adquiridas à Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP O vetor foi adquirido do Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. O malonil-CoA foi adquirido da Sigma Company, 4-cumaroil-CoA, naringenina -chalcona foi adquirida da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., e a naringenina foi adquirida da Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumentos

Espectrofotômetro Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, EUA); instrumento de PCR gradiente (Eppendorf Company, Alemanha); Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência CFX 96, gerador de imagens em gel UVP, instrumento de eletroforese em gel, instrumento de eletroforese de proteínas (BioRad Company, EUA); EnSpire

Leitor de microplacas (PerkinElmer Company, EUA); incubadora de temperatura constante (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscilador de temperatura total de grande capacidade DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Um oscilador de temperatura constante em banho-maria (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Bancada de trabalho ultralimpa AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); esterilizador a vapor de alta pressão (TOMY Company, Japão); instrumento de água pura Milli Q (Millipore, Estados Unidos); LC-20Um cromatógrafo de fase líquida de alta eficiência (Shimadzu Company, Japão); espectrometria de massa de alta resolução UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, EUA); Microscópio confocal a laser FV1200 (Olympus Company, Japão).

2 métodos experimentais

2.1 Extração de RNA e síntese de cDNA. Flores de Cistanche deserticola foram moídas em nitrogênio líquido e posteriormente submetidas ao ensaio de extração de RNA.

O RNA total foi extraído usando um kit (Norgen, Cat 17200), a concentração e a qualidade do RNA foram detectadas pelo NanoDrop 2000C, e amostras de RNA com proporção A260/A280 entre 1,8 e 2,1 foram selecionadas para síntese de transcrição reversa de cDNA. A transcriptase reversa M-MLV (Promega, M170B) foi usada para transcrever reversamente o RNA total qualificado em cDNA. As operações experimentais foram realizadas de acordo com as instruções.

2.2 Clonagem do gene CtCHS

Com base nos dados do transcriptoma da flor Cistanche deserticola do nosso grupo de pesquisa [16], um CtCHS com um quadro de leitura aberto completo foi selecionado e o software SnapGene foi usado para projetar primers específicos com base na sequência do gene (Tabela 1). A amplificação por PCR foi realizada utilizando cDNA de flor de Cistanche deserticola como modelo. O sistema de amplificação foi 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, primers upstream e downstream (10 μmol/L) 2 μL cada, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA Polimerase 1 μL, ddH2O 17 μL. As condições de reação foram: pré-desnaturação a 95 graus por 3 min; 25 ciclos de desnaturação a 95 graus por 15 s, recozimento a 55 graus por 15 s e extensão a 72 graus por 1 min; e extensão da reação a 72 graus por 5 min. O produto de PCR foi detectado por eletroforese em gel de agarose a 1%, e o kit de purificação de DNA (Novizan, Cat DC301-01) foi usado para recuperação de gel, e então o DNA recuperado foi purificado por um kit de clonagem rápida (Novizan, Cat C601-01). O fragmento de DNA foi ligado ao vetor pCE2 TA/Blunt-Zero, transformado em células competentes de Escherichia coli DH5, e após cultura durante a noite a 37 graus, cepas de clone único foram selecionadas e enviadas à empresa para sequenciamento.

Tabela 1 Sequências de primers

2.3 Análise bioinformática

Use o software online ProtParam para analisar propriedades físicas e químicas de proteínas; usar a ferramenta online Prot Scale para analisar a hidrofilicidade/hidrofobicidade das proteínas; usar a ferramenta online SOPMA para prever a estrutura secundária da proteína; usar o software de análise on-line SWISS-MODEL para prever a estrutura terciária da proteína; use o software online TMHMM Preveja a estrutura transmembrana da proteína; usar o software DNAMAN para comparar a homologia de CtCHS com as sequências de aminoácidos CHS de outras espécies; usar o software MEGA-X para construir uma árvore filogenética, usando junção de vizinhos (NJ) e correção de Poisson. A distância evolutiva é calculada usando o método Bootstrap, e o número de repetições de Bootstrap é 1000 vezes.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS foi usado para detecção adicional. As condições da fase líquida foram coluna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura da coluna 40 grau, naringenina , chalcona e naringenina. O volume de carga da substância de controle é de 4 μL e o volume de carga do produto da reação enzimática é de 7 μL. Água (A)-acetonitrila (B) é usada como fase móvel. O gradiente de eluição é: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 minutos. , 30%~60%B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 minutos, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. A vazão volumétrica é de 0,3 mL/min. As condições de espectrometria de massa são fonte de íons de eletropulverização, nitrogênio como gás de arraste, pressão do gás de bainha 3,5 MPa, pressão do gás auxiliar 1,0 MPa, pressão de pulverização 3500 V, temperatura capilar 350 graus, temperatura de aquecimento do gás auxiliar 200 graus, modos de íons positivos e negativos, varredura faixa de íons m/z é 100-1500, a resolução completa do MS é 35 000, a resolução dd-MS2 é 17 500, (N)

CE/escalonado definido como 35, 60.

2.6 Localização subcelular da proteína CtCHS

Com base na sequência CtCHS e no princípio da clonagem contínua, foram desenhados iniciadores com locais de corte enzimático Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ, e os fragmentos alvo correspondentes foram amplificados por PCR. O plasmídeo pCAMBIA1300-35S-GFP foi digerido com endonucleases de restrição Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ, e o fragmento alvo e o vetor foram conectados através do kit de clonagem contínua (Novizan, Cat C115-01) e depois transferidos em células competentes de E. coli DH5. , selecione cepas de clone único para sequenciamento e extraia plasmídeos das cepas corretas. Os plasmídeos pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS e pCAMBIA 1300-35S-GFP foram transformados em protoplastos de Arabidopsis thaliana usando PEG4000 e cultivados sob luz fraca por 8 a 10 h. A localização subcelular da proteína CtCHS foi observada sob microscópio confocal a laser.

2.7 Análise do padrão de expressão CtCHS

Com base na sequência CtCHS, o DNAMAN foi utilizado para projetar iniciadores quantitativos de fluorescência em tempo real, com F-box como gene de referência interno. As sequências de primers são mostradas na Tabela 1. A expressão relativa de CtCHS em flores de Cistanche deserticola de diferentes cores foi detectada por PCR quantitativo de fluorescência em tempo real. Use TransStart Green qPCR SuperMix (full gold, AQ101-02) para medir com o método de corante fluorescente SYBR Green, sistema de reação: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, primers upstream e downstream (10

μmol/L) {{0}},2 μL cada, modelo de cDNA 0,5 μL, água livre de nucleotidase 4,1 μL, um método de duas etapas foi usado para a reação, e o procedimento de reação foi baseado no método de Dong Xianjuan et al. [18]. Cada amostra continha 3 réplicas biológicas e o experimento foi repetido três vezes. Os dados experimentais foram analisados ​​usando Excel para 2

A expressão relativa de CtCHS foi calculada usando o método −ΔΔCt, e o GraphPad Prism 8 foi usado para realizar análises de significância e desenhar histogramas.