Características clínicas, diagnóstico, resultados e análise do microbioma pulmonar da aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com pneumonia adquirida na comunidade

ABSTRATO

Fundo

A aspergilose pulmonar invasiva (IPA) permanece subestimada em pacientes com pneumonia adquirida na comunidade (PAC). Este estudo tem como objetivo descrever as características clínicas e os resultados da IPA em pacientes com PAC, avaliar o desempenho diagnóstico do sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS) para IPA e analisar o microbioma pulmonar por meio de dados de mNGS.

Recentemente, a nova epidemia de pneumonia por coronavírus atraiu atenção generalizada em todo o mundo. Muitas pessoas começaram a prestar atenção se sua imunidade é forte o suficiente porque a imunidade é a primeira linha de defesa do corpo contra doenças. Neste artigo, exploramos a relação entre pneumonia e imunidade.

A pneumonia é uma infecção respiratória grave e uma doença inflamatória causada por várias causas. Vírus como resfriado comum, gripe e o novo coronavírus podem causar pneumonia. O foco dessa doença é que causa danos irreversíveis ao sistema respiratório, podendo levar à insuficiência respiratória.

No entanto, se sua imunidade for adequada, seu corpo estará mais bem equipado para combater vírus e bactérias. Isso se deve principalmente aos glóbulos brancos - uma das células imunológicas mais importantes do corpo. Os glóbulos brancos podem reconhecer patógenos invasores e atacá-los diretamente, e também podem secretar anticorpos para se defender contra a invasão de patógenos.

Além dos glóbulos brancos, alguns outros componentes importantes do sistema imunológico incluem linfócitos e fagocitose. Os linfócitos ativam o sistema imunológico reconhecendo patógenos estranhos, enquanto a fagocitose ocorre quando certos tipos de glóbulos brancos engolem e decompõem patógenos, como bactérias invasoras.

Portanto, manter o sistema imunológico saudável é uma maneira eficaz de prevenir infecções respiratórias como a pneumonia. Você pode melhorar sua imunidade comendo alimentos ricos em vitaminas, proteínas e antioxidantes, como peixes de profundidade, nozes, feijões, morangos, mirtilos e muito mais. Além disso, manter uma boa saúde também é muito importante, incluindo não fumar, praticar mais exercícios, manter um bom sono e reduzir o estresse.

Resumindo, para evitar infecções respiratórias como a pneumonia, é fundamental manter uma boa imunidade. Precisamos melhorar a imunidade do corpo por meio de uma dieta saudável, exercícios adequados e hábitos de sono. Planeje razoavelmente seu estilo de vida para que seu corpo tenha um melhor mecanismo de defesa e fique longe de doenças como a pneumonia. Desse ponto de vista, precisamos melhorar nossa imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade, porque as cinzas da carne contêm uma variedade de componentes biologicamente ativos, como polissacarídeos, dois cogumelos, Huang Li, etc. Esses componentes podem estimular o sistema imunológico Vários tipos de células no sistema aumentam sua atividade imunológica.

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Métodos

Este estudo de coorte retrospectivo incluiu pacientes com PAC de 22 de abril de 2019 a 30 de setembro de 2021. Dados clínicos e microbiológicos foram analisados. O desempenho diagnóstico do mNGS foi comparado com métodos de detecção tradicionais. O microbioma pulmonar detectado por mNGS foi caracterizado e sua associação com características clínicas foi avaliada.

Resultados principais

A IPA foi diagnosticada em 26 (23,4%) dos 111 pacientes com PAC. Os pacientes com IPA apresentaram imunidade deprimida, maior mortalidade hospitalar (30,8 por cento vs 11,8 por cento) e mortalidade na unidade de terapia intensiva (42,1 por cento vs 17,5 por cento) em comparação com pacientes sem IPA. O teste de antígeno galactomanano (GM) teve a maior sensibilidade (57,7 por cento) na detecção de Aspergillus spp, seguido por mNGS (42,3 por cento), cultura (30,8 por cento) e esfregaço (7,7 por cento). As canecas, a cultura e o esfregaço tiveram 100 por cento de especificidade, enquanto o teste GM teve 92,9 por cento de especificidade. A estrutura microbiana do IPA diferiu significativamente dos pacientes não IPA (p<0.001; Wilcoxon test). Nineteen different species were significantly correlated with clinical outcomes and laboratory biomarkers, particularly for Streptococcus salivarius, Prevotella timonensis, and Human betaherpesvirus 5.

Conclusões

Nossos resultados revelam que pacientes com infecção por Aspergillus tendem a ter uma maior taxa de mortalidade precoce. A NGS pode ser sugerida como complemento aos exames microbiológicos de rotina no diagnóstico de pacientes com risco de infecção por Aspergillus. A microbiota pulmonar está associada a condições inflamatórias, imunes e metabólicas da IPA e, portanto, influencia os resultados clínicos.

INTRODUÇÃO

A aspergilose pulmonar invasiva (IPA) é uma importante causa de morbidade e mortalidade, afetando tipicamente hospedeiros imunocomprometidos, como pacientes com infecção por HIV, bem como pacientes recebendo terapia com corticosteróides, receptores de transplante ou câncer hematológico.1 Numerosos casos de diagnóstico incorreto ou falha no diagnóstico e apenas diagnosticado post mortem devido à falta de recursos médicos e novos fatores de risco são subestimados.2 O diagnóstico clínico de IPA compreende fatores do hospedeiro, características clínicas e evidências micológicas.3 Problemas decorrentes da inacessibilidade de amostras de tecido, baixa sensibilidade da cultura, baixa aplicabilidade de fatores tradicionais do hospedeiro e ausência de achados clínicos e radiológicos típicos levam a diagnósticos atrasados ​​e perdidos em pacientes com IPA.4 As diretrizes de prática clínica publicadas recentemente pela American Thoracic Society para o diagnóstico de infecção fúngica destacam os testes diagnósticos independentes de cultura, com fortes recomendações dadas para a detecção de DNA de Aspergillus no líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) por PCR.5.

Na última década, o desenvolvimento de métodos moleculares para quantificação e sequenciamento de DNA patogênico facilitou muito a detecção de vários microrganismos. O sequenciamento metagenômico de próxima geração (NGS) tem sido amplamente aplicado ao diagnóstico de doenças infecciosas em ambientes clínicos, especialmente com patógenos específicos ou não identificados ou mistos em uma abordagem não direcionada.6 Por exemplo, combinar mNGS com métodos convencionais de detecção pode aumentar a taxa de detecção do complexo Mycobacterium tuberculosis7 e facilitar a detecção de patógenos mistos em pacientes com pneumonia grave adquirida na comunidade (PAC) imunocomprometidos.8 Até o momento, o desempenho diagnóstico do NGS para a detecção de infecção por Aspergilose pulmonar não foi claro.

Recentemente, variações na composição e diversidade dos microbiomas pulmonares foram descritas em várias doenças respiratórias, fornecendo novas perspectivas para diagnósticos precisos. Pacientes com tuberculose confirmada bacteriologicamente exibiram um aumento considerável de espécies bacterianas em comparação com pacientes com tuberculose negativa.9 O desequilíbrio da comunidade pulmonar impulsionado pelo enriquecimento com o patógeno potencial está correlacionado com resultados em pacientes intubados/ventilados mecanicamente.10 Hérivaux et al descobriram pacientes com IPA exibiu uma abundância diferencial de táxons bacterianos específicos.11

Com as novas técnicas de diagnóstico disponíveis, é possível avaliar as características clínicas e o microbioma pulmonar da IPA a partir de uma nova perspectiva para uma compreensão abrangente da doença. Este estudo foi desenhado para descrever as características clínicas e os resultados da IPA em pacientes com PAC, avaliar o desempenho diagnóstico do mNGS para IPA e revelar a relação entre as características clínicas e o microbioma pulmonar na IPA.

MÉTODOS

Desenho do estudo e participantes

Este foi um estudo de coorte retrospectivo que consistiu em pacientes hospitalizados (maiores ou iguais a 18 anos de idade) diagnosticados como PAC no Primeiro Hospital Afiliado da Chongqing Medical University entre 22 de abril de 2019 e 30 de setembro de 2021. Os pacientes incluídos neste estudo devem atender os seguintes critérios inclusivos: (1) diagnosticado com PAC atendendo às diretrizes IDSA/ATS de 200712, (2) submetido a lavagem broncoalveolar, (3) sem exposição a antibióticos nas últimas 2 semanas antes da coleta da amostra e (4) com teste de galactomanana (GM), esfregaço, cultura e BALF mNGS resultados de BALF. Casos com IPA provável requerem a presença de pelo menos um fator do hospedeiro, uma manifestação clínica e evidência micológica em LBA, de acordo com os critérios de 2019 da Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Grupo de Estudos de Câncer/Micoses (EORTIC/MSG).3 Neste estudo, uma modificação nos critérios de diagnóstico foi a adição de NGS como um dos métodos de teste micológico, incluindo teste de GM, esfregaço e cultura. Os casos sem IPA provável incluíram pacientes sem evidências clínicas ou radiológicas ou presença de Aspergillus spp no ​​LBA. Todos os pacientes inscritos foram acompanhados por telefone para indagar sobre a sobrevida ou data do óbito.

Coleta de dados e testes microbiológicos

As informações clínicas foram extraídas dos prontuários eletrônicos usando um formulário de coleta de dados padronizado, que incluiu informações demográficas, dados clínicos, achados laboratoriais, TC de tórax, tratamentos antifúngicos e resultados. Todos os dados foram revisados ​​por dois investigadores independentemente para verificar a precisão dos dados. A 7-escala ordinal de categorias13 foi modificada com base no desenho do estudo, que consistia em categorias mutuamente exclusivas como segue: categoria 7, morte; categoria 6, exigindo ventilação invasiva e suporte de órgão adicional (por exemplo, terapia renal substitutiva contínua ou oxigenação por membrana extracorpórea); categoria 5, necessitando de ventilação mecânica invasiva; categoria 4, necessitando de ventilação não invasiva ou oxigênio de alto fluxo; categoria 3, necessitando de oxigênio suplementar por máscara ou sonda nasal; categoria 2, hospitalizado, sem oxigênio; categoria 1, dispensado. A melhora no estado clínico foi definida como um declínio de 2 categorias avaliadas pela 7-escala ordinal de nível em pontos de tempo fixos (dias 1, 7, 14, 21 e 28).
O teste de antígeno GM no soro e GM em BALF é geralmente realizado em todos os pacientes inscritos. Um resultado foi considerado positivo quando os valores do índice óptico foram maiores ou iguais a 1.0 em soro ou maior ou igual a 1.0 em BALF ou maior ou igual a 0 0,7 no soro e Maior ou igual a 0,8 no BALF. Os espécimes de BALF foram submetidos a mNGS, esfregaço por microscopia e cultura fúngica comum.

Sequenciamento de próxima geração de metagenômica

Um 1,5–3mL de BALF foi coletado de cada paciente de acordo com os procedimentos padrão.14 Um tubo de microcentrífuga de 1,5mL contendo 0.6mL de amostra BALF, enzima e 1g de 0.5mm grânulos de vidro foi agitado por um misturador de vórtice e uma amostra de 0,3mL foi separada em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL e o DNA foi extraído usando o kit TIANamp Micro DNA (DP316, Tiangen Biotech) seguindo o manual do fabricante.15 As bibliotecas de DNA foram construídas através do DNA fragmentação, reparo final, ligação do adaptador e amplificação por PCR. Em seguida, as bibliotecas com qualidade confirmada foram sequenciadas pela plataforma Illumina NextSeq 550 com leituras únicas de 75bp (Illumina, San Diego, Califórnia, EUA).16

O controle interno, denominado Unique Molecular Spiked-in (UMSI), foi adicionado à amostra antes da extração do DNA. A sequência de UMSI variou em diferentes amostras. Cada execução do ensaio NGS incluiu um controle negativo externo que foi executado em paralelo com amostras clínicas. Durante a análise, a contaminação entre as amostras poderia ser encontrada se a sequência UMSI fosse a mesma ou se as leituras de alguns patógenos no controle externo fossem muito altas.

Dados de sequenciamento de alta qualidade foram gerados pela remoção de leituras de baixa qualidade, seguidas por subtração computacional de sequências de hospedeiro humano mapeadas para o genoma humano de referência (hg19) usando o alinhamento Burrows-Wheeler.17 Os dados restantes pela remoção de leituras de baixa complexidade foram classificados alinhando simultaneamente a quatro bancos de dados de genoma microbiano (bactérias, fungos, vírus e parasitas), que foram baixados do National Center for Biotechnology Information (ftp://ftp.ncbi. nlm.nih.gov/genomes/). A interpretação dos meus resultados pode ser vista em métodos suplementares online.

Envolvimento do paciente e do público

Os pacientes e o público não estiveram envolvidos na concepção e condução deste estudo, escolha das medidas de resultado ou recrutamento. Os resultados deste estudo não serão divulgados para as comunidades participantes e vinculadas.

análise estatística

As variáveis ​​contínuas foram expressas como mediana (IQR) e comparadas com o teste U de Mann-Whitney. As variáveis ​​categóricas foram expressas como números ( percentuais ) e comparadas pelo teste χ2 ou teste exato de Fisher. As tabelas de contingência 2 × 2 foram estabelecidas para determinar sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN). Um bilateral menor que 0.05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas foram feitas usando o IBM SPSS Statistics, V.23.0, a menos que indicado de outra forma.

As leituras de alta qualidade foram primeiro mapeadas para o genoma de referência humano (hg19) e, em seguida, as leituras não humanas foram alinhadas a quatro bancos de dados de genoma microbiano (bactérias, fungos, vírus e parasitas). Depois de remover o microbiano de fundo que apareceu nos controles negativos (tabela suplementar online 1), a reestimativa bayesiana da abundância foi usada para estimar a abundância relativa das espécies (tabela suplementar online 2). O índice de diversidade alfa para cada amostra foi calculado com base nos índices de Shannon e Simpson, e a diversidade beta foi calculada com base na distância UniFrac ponderada e na distância Bray-Curtis. Os valores de p para análise alfa e beta foram calculados usando o teste de Wilcoxon rank-sum. O tamanho do efeito da análise discriminante linear (LDA) foi usado para encontrar espécies significativamente diferentes entre os grupos, com limiares de log10 LDA Score maior ou igual a 2 e valor de p menor ou igual a 0,05. A correlação entre a microbiota representativa e os dados clínicos foi avaliada por Spearman.

RESULTADOS

Recrutamento de pacientes e características clínicas

Um total de 123 pacientes com 128 espécimes BALF foram revisados ​​e 111 pacientes foram incluídos neste estudo.

Vinte e seis pacientes foram diagnosticados com provável IPA (denominado IPA) e 85 controles sem IPA (denominado controle) (figura 1). As comparações das características demográficas e clínicas entre o grupo IPA e o grupo controle foram resumidas na Tabela 1. A população do estudo tinha idade mediana de 60 (IQR, 53–73) anos, e 66,7 por cento eram homens. No geral, 33 pacientes (29,7 por cento) tinham história de tabagismo. Vinte e dois pacientes (19,8%) apresentavam doença pulmonar obstrutiva crônica. Quinze pacientes (13,5 por cento) receberam corticosteróides e 36 pacientes (32,4 por cento) foram considerados imunocomprometidos (tabela suplementar online 3). Pacientes com IPA provável tiveram uma taxa significativamente maior de fatores de risco conhecidos para aspergilose do que aqueles sem IPA, incluindo tratamento com corticosteroides por mais de 28 dias (38,5 por cento vs 5,9 por cento, p=0.000) e imunocomprometidos status (53,8 por cento vs 25,9 por cento, p=0.008). Não foram encontradas diferenças significativas na pontuação da avaliação sequencial de falência de órgãos e confusão, ureia, frequência respiratória, pressão arterial e pontuação de 65 anos de idade dos pacientes entre os dois grupos na admissão.

Achados microbiológicos, tomográficos e laboratoriais

Isolados de Aspergillus fumigatus foram obtidos em 6 de 26 (23,1 por cento) casos prováveis ​​de IPA, seguidos por Aspergillus flavus em 3 de 26 (11,5 por cento) e Aspergillus ustus em 1 de 26 (3,8 por cento) (tabela 2). O espessamento da parede brônquica foi mostrado com mais frequência na TC de tórax no IPA (44,0 percent vs 12,8 percent , p=0.000) (tabela 2). Os pacientes com IPA têm níveis significativamente mais baixos de contagem total de linfócitos (774,1 vs 1088,9, p=0.009) e subpopulação de linfócitos, incluindo CD3 mais contagem de linfócitos T (553,0 vs 782,6, p=0.016), contagem de linfócitos CD4 mais T (287,9 vs 409,5, p=0.031) e contagem de linfócitos CD4- CD8- T (25,9 vs 45,0, p=0,007 ) do que pacientes de controle (tabela suplementar online 4), indicando a função imune comprometida de pacientes com IPA.

Comparação do desempenho do diagnóstico

Para comparar o desempenho diagnóstico de BALF mNGS e testes convencionais para distinguir casos com IPA provável de casos sem IPA provável, os resultados foram mostrados na Figura 2. O teste GM (57,7 por cento) teve a maior sensibilidade na detecção de Aspergillus spp, seguido por mNGS (42,3 por cento ), cultura (30,8 por cento ) e esfregaço (7,7 por cento ). Comparado com o esfregaço, mNGS teve uma sensibilidade significativamente maior 42,3 por cento vs 7,7 por cento, p=0.{{30}}1). O mNGS, cultura e esfregaço tiveram especificidade de 100 por cento, enquanto o teste GM teve especificidade de 92,9 por cento, com uma diferença significativa entre mNGS (ou cultura ou esfregaço) e o teste GM (p{ {18}}.029). O VPP de mNGS, cultura e esfregaço para identificar Aspergillus spp foi de 100 por cento, enquanto o teste GM foi de 71,4 por cento. O VPN classificou como teste GM (87,8 por cento ), mNGS (85,0 por cento ), cultura (82,5 por cento ) e esfregaço (78,0 por cento ), sem diferença significativa entre esses métodos. Analisamos diferenças na sensibilidade/especificidade/PPV/NPV de GM no soro versus BALF, usando um índice de GM de fluido BAL maior ou igual a 1,0 ou índice de GM no soro maior ou igual a 1,0 como positivo, de acordo com 2019 EORTIC /MSG. Foi significativamente maior em sensibilidade, mas menor na especificidade do GM BALF do que do soro GM (57,7 por cento vs 26,9 por cento, p=0,048, 92,9 por cento vs 100 por cento, 0,029, respectivamente), o que foi mostrado em tabela suplementar online 5. Não houve diferenças no VPP e VPN.

Os resultados clínicos

Não houve diferenças significativas na mortalidade de 28-dias, 60-dias e 90-dias entre os dois grupos (tabela 3). Mortalidade hospitalar (30,8 por cento vs 11,8 por cento, p=0,021) e taxas de mortalidade na unidade de terapia intensiva (UTI) (42,1 por cento vs 17,5 por cento, p=0,029) foram significativamente maiores no grupo IPA do que no grupo controle. A distribuição dos pacientes que se enquadram em cada categoria da 7-escala de categoria mostrou uma diferença estatística entre os dois grupos no dia 28 (p=00,017); no entanto, a significância com o teste estatístico não foi alcançada na 7-escala ordinal da categoria nos dias 1, 7 e 14 (figura 3). Múltiplos medicamentos antifúngicos foram administrados para 23,1 por cento dos pacientes com IPA provável, em comparação com 5,9 por cento dos pacientes sem IPA provável (p=00,01). A proporção de pacientes que receberam voriconazol foi notavelmente maior em casos com IPA provável (53,9 por cento vs 8,2 por cento, p=0.000). Não houve diferença significativa no uso de anfotericina B e caspofungina entre os dois grupos (tabela 3).

Análise do microbioma pulmonar

Para comparar a composição geral e a diversidade da assinatura microbiana pulmonar em pacientes com IPA e o controle, analisamos amostras de BALF coletadas de 109 pacientes com PAC, incluindo 24 casos (2 pacientes ausentes devido à perda de dados mNGS) diagnosticados com IPA provável (denominado IPA) e 85 casos sem IPA provável (controle nomeado). Avaliamos a diversidade das comunidades pulmonares usando o índice de diversidade de Shannon e Simpson. Houve uma diminuição na diversidade nos índices de diversidade de Shannon e Simpson em pacientes com IPA em comparação com pacientes sem IPA, apesar das diferenças significativas (figura 4A, B). Usando a métrica ponderada UniFrac e a métrica Bray-Curtis, observamos que a diversidade de pacientes com API diferia significativamente dos pacientes sem API (p<0.001; Wilcoxon test), suggesting that lung community structure of patients diagnosed with probable IPA differed substantially from those without probable IPA (figure 4C, D). Based on the average relative abundance, we plotted the top 10 phyla, genera, and species among 2 groups. 

Na coorte geral, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Ascomycota foram os filos mais abundantes, enquanto Prevotella, Streptococcus, Acinetobacter e Pneumocystis foram os gêneros mais comuns (figura 5A, B). A abundância relativa dos 10 primeiros em espécies classificadas como Pneumocystis jirovecii, Acinetobacter baumannii, Lautropia mirabilis, Streptococcus oralis, Corynebacterium striatum, Human betaherpesvirus 5, Rothia mucilaginosa, Staphylococcus aureus, Prevotella melanogenic, Nocardia Farcinica, com apenas H. betaherpesvirus 5 foi o significativamente diferentes entre os dois grupos (figura 5C). Com foco nas espécies diferenciais no IPA em comparação com seus controles, encontramos 21 espécies com LDA Score maior ou igual a 2 e p<0.05, which H. betaherpesvirus 5, A. fumigatus, Aspergillus niger, Citrobacter braakii, Bacillus thermoamylovorans, Helcococcus kunzite, Lactobacillus delbrueckii, Burkholderia dolosa, Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Riemerella anatipestifer, Corynebacterium halotolerant, and Lactobacillus plantarum were significantly abundant in the cases diagnosed with probable IPA, and Streptococcus salivarius, Citrobacter freundii, Paraburkholderia fungorum, Dolosigranulum program, Prevotella timonensis, Sphingobium yanoikuyae, Serratia marcescens, and Corynebacterium oculi were enriched in cases without probable IPA (figure 5D, online supplemental figure 1).

Para investigar mais a fundo a correlação entre os dados clínicos e a microbiota pulmonar de IPA, realizamos o teste de correlação baseado em classificação de Spearman nas 21 espécies significativamente diferentes com resultados clínicos e achados laboratoriais (figura 6A). Observamos que 19 espécies diferentes foram significativamente correlacionadas com 7 resultados clínicos e 22 biomarcadores laboratoriais, particularmente S. salivarius, P. Sinensis e H. betaherpesvirus 5. S. salivarius foi principalmente correlacionado positivamente com oito biomarcadores laboratoriais, incluindo glóbulos vermelhos, total linfócitos, linfócitos T, células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos, linfócitos B, potássio sérico e albumina, e negativamente relativos a aspartato aminotransferase, bilirrubina direta e dímero D. Considerando que S. salivarius foi principalmente associado negativamente com 11 desfechos clínicos, incluindo mortalidade na UTI, duração da internação na UTI, mortalidade hospitalar, mortalidade no dia 28 e tempo para a independência de oxigênio suplementar em 28 dias, e positivamente correlacionado com a duração da internação hospitalar mortalidade no dia 28, dias sem ventilação em 28 dias e tempo para melhora do estado clínico. Semelhante a S. salivarius, P. timonensis foi primariamente positivo em relação a seis biomarcadores de laboratório, incluindo linfócitos totais, linfócitos T, células T auxiliares, células T CD4− CD8−, linfócitos B e potássio sérico, e correlacionado negativamente com procalcitonina.

Da mesma forma, P. timonensis foi principalmente associado negativamente com a duração da internação na UTI e mortalidade hospitalar, mas positivamente com dias sem ventilação em 28 dias. Ao contrário de S. salivarius e P. Sinensis, o H. betaherpesvirus 5 foi associado negativamente a seis biomarcadores laboratoriais, incluindo linfócitos totais, linfócitos T, células T auxiliares, células T CD4 mais CD8 mais, linfócitos B e potássio sérico, e parente positivo com nitrogênio ureico no sangue. Enquanto isso, o H. betaherpesvirus 5 foi principalmente correlacionado negativamente com a duração da internação na UTI e o tempo para a independência de oxigênio suplementar em 28 dias. Essas observações sugerem que a disbiose das comunidades microbianas no pulmão está associada às condições fisiopatológicas do paciente e, portanto, pode influenciar os resultados clínicos.

Para investigar melhor o impacto clínico de 21 espécies significativamente diferentes, fizemos a análise de sobrevivência traçando a curva de probabilidade cumulativa. Conforme mostrado nas Figuras 6B e C, a detecção de A. fumigatus e H. betaherpesvirus 5 foi significativamente preditiva de piores resultados na UTI (p=0.045, 0.032) . Enquanto na Figura 6D, E, descobrimos que a detecção de S. salivarius e P. timonensis foi extremamente significativamente preditiva de melhores resultados na UTI (p=0.0031, 0,0054). Assim, concluímos que na microbiota pulmonar da PAC, os resultados da UTI podem ser previstos pela composição da comunidade, especificamente A. fumigatus, H. betaherpesvirus 5, S. salivarius e P. Sinensis.

DISCUSSÃO

Neste estudo de coorte retrospectivo, examinamos as características clínicas da API. Curiosamente, observamos que os pacientes categorizados como tendo provável infecção por Aspergillus tiveram mortalidade hospitalar significativamente maior (30,8 por cento) e mortalidade na UTI (42,1 por cento) em comparação com o controle. A mortalidade no dia 28, embora não estatisticamente significativa, foi numericamente maior em pacientes com IPA do que no controle. Esses dados sugerem que pacientes com infecção por Aspergillus tendem a ter uma taxa de mortalidade precoce mais alta. Um estudo anterior relatou uma estimativa de 45% de mortalidade na UTI e 26% de mortalidade hospitalar18 Entre a aspergilose traqueobrônquica invasiva, uma entidade rara de IPA, as taxas de mortalidade de 30-dias e 90-dias chegaram a 90%. 19 Loughlin et al relataram que a mortalidade na UTI em pacientes com provável infecção por Aspergillus não foi significativamente maior do que aqueles sem infecção por Aspergillus,4 possivelmente devido ao estado crítico geral na coorte de pacientes com pneumonia associada à ventilação mecânica na UTI. Neste estudo, a condição geral dos pacientes inscritos com PAC era relativamente leve, o que pode ser notavelmente agravado pela infecção por Aspergillus e potencialmente fatal.

Cornillet et al sugeriram que as características clínicas inespecíficas e as dificuldades diagnósticas dos pacientes com IPA, particularmente quando os pacientes sem neutropenia, levam facilmente a um manejo abaixo do ideal e ao início tardio do tratamento, resultando em alta mortalidade e morbidade.20 Dadas as taxas de mortalidade devastadoras de pacientes com IPA, oportuna e o diagnóstico preciso é destacado e necessário com urgência para o tratamento antifúngico eficaz para diminuir a taxa de morbidade e mortalidade. Na última década, a detecção de GM tem sido amplamente utilizada no diagnóstico de IPA.21 No entanto, o teste de GM para amostras de soro tem sensibilidade limitada no diagnóstico de IPA em hospedeiros não neutropênicos.22 Em vez disso, a detecção de GM em amostras de fluido BAL de pacientes em risco de IPA tem excelente precisão diagnóstica,23 24 porque o GM é liberado mais cedo e em concentrações mais altas no fluido BAL em comparação com o soro.25 Recentemente, mNGS tem desempenhado um papel cada vez mais importante no diagnóstico de doenças fúngicas. Ding et al demonstraram que a sensibilidade do mNGS foi significativamente maior do que a cultura na detecção de Candida albicans. 9 Neste estudo, o LBA foi coletado diretamente do trato respiratório inferior, o que evitou a contaminação da microbiota oral. Aspergillus em BALF foram detectados por mNGS, cultura, esfregaço e teste de GM. Os resultados mostraram que NGS teve especificidade comparável e PPV para cultura na detecção de Aspergillus. Embora a sensibilidade do mNGS tenha sido menor do que o teste de GM, o mNGS mostrou mais sensibilidade do que o esfregaço e mais especificidade do que os testes de soro e BALF GM. Esses resultados indicaram que o mNGS atua como um teste não baseado em cultura útil para a detecção de Aspergillus, sugerindo um complemento aos testes microbiológicos de rotina no diagnóstico de pacientes com risco de API.

Nosso estudo descobriu que os pacientes com PAC com Aspergillus eram mais propensos a serem co-infectados com infecção bacteriana ou (e) viral devido ao estado imunocomprometido e ao tratamento com corticosteroides. Relatou-se que pacientes com influenza que estavam imunocomprometidos tinham uma incidência de IPA de até 32 por cento , enquanto que, no grupo de casos de influenza não imunocomprometidos, a incidência foi de 14 por cento .18 Com o surgimento da pandemia de COVID-19 e uso de corticosteróides em pacientes com COVID{5}} grave,26 COVID-19-aspergilose pulmonar associada (CAPA) foi relatada em vários relatos de casos.27–29 Em uma meta-análise, a incidência e mortalidade de CAPA na UTI foram estimados em 10,2 por cento e 54,9 por cento, respectivamente.30

Devido às vastas leituras microbianas nos dados do mNGS que podem ser usadas para analisar assinaturas microbianas em várias doenças, nosso estudo tentou explorar a diferença na estrutura e composição do microbioma entre pacientes com IPA e pacientes com PAC não IPA analisando os dados do mNGS. Nosso presente estudo compreendeu a microbiota pulmonar de 24 pacientes com IPA e 85 pacientes com PAC sem IPA. A relação entre diferentes microbiota e dados clínicos para todos os 109 pacientes com PAC foi investigada. Para a diversidade alfa, não houve diferenças significativas no índice de Shannon e no índice de Simpson da microbiota em pacientes IPA e não IPA CAP, demonstrando que a diversidade dentro da amostra de comunidades foi semelhante entre pacientes IPA e não IPA.

Para diversidade beta, nossos resultados mostraram uma diferença dramática na distância UniFrac ponderada (p=2.1×10−6) e distância Bray-Curtis (p=0.033) entre IPA e não IPA Pacientes com PAC, indicando um efeito potencial de Aspergillus spp na estrutura da microbiota pulmonar em pacientes diagnosticados com IPA. Estudos semelhantes mostraram diferenças significativas na diversidade beta da microbiota entre IPA e controles.11 Isso pode ocorrer porque os agentes causadores nos controles eram complexos, que podem ser quaisquer patógenos de PAC (como bactérias, vírus, fungos, parasitas e até mesmo patógenos atípicos), exceto Aspergillus. Assim, a heterogeneidade microbiana do pulmão no controle foi maior do que IPA. Enquanto isso, esses estudos demonstraram que Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes foram os filos mais abundantes na coorte IPA.11 No entanto, além das bactérias, nosso estudo descobriu que a abundância relativa de Ascomycota também foi alta no nível do filo, por a metagenômica pode colher quase todo o ácido nuclear da microbiota, incluindo bactérias, fungos, vírus e parasitas.

As espécies significativamente diferentes, particularmente S. salivarius, P. Sinensis e H. betaherpesvirus 5 foram fortemente relacionadas aos dados clínicos. S. salivarius e P. timonensis foram positivamente relacionados a biomarcadores laboratoriais, como linfócitos T, e negativamente relacionados a desfechos clínicos, como mortalidade hospitalar. Considerando que, o H. betaherpesvirus 5 foi negativamente relacionado a biomarcadores laboratoriais, como linfócitos T, e positivamente relacionado a desfechos clínicos, como mortalidade hospitalar. Estudos anteriores demonstraram que S. salivarius é uma bactéria probiótica que pode inibir a adesão pneumocócica às células epiteliais da faringe.31 Além disso, outro estudo provou que isolados de S. salivarius tinham uma capacidade superior de inibir o crescimento de Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. 32 Todos esses estudos coincidiram com nosso estudo de que S. salivarius foi positivamente correlacionado com o melhor resultado clínico dos pacientes.

O possível mecanismo de S. salivarius correlacionado positivamente com o melhor resultado dos pacientes pode ser que eles podem inibir o crescimento do patógeno potencial e ativar o sistema imunológico do hospedeiro. Para P. Sinensis, um estudo anterior mostrou que P. timonensis poderia induzir drasticamente a expressão de mucinas associadas à membrana no modelo tridimensional de células epiteliais endometriais e formar o biofilme na superfície epitelial, que por sua vez influencia a adesão de outras bactérias ,33 O motivo da correlação positiva com a melhor evolução clínica dos pacientes pode ser a resistência à colonização do P. Sinensis no pulmão e a ativação do sistema imune do hospedeiro. Em ambientes clínicos, o H. betaherpesvirus 5 pode criar infecções latentes ao longo da vida em pessoas saudáveis. No entanto, uma vez imunocomprometido, o H. betaherpesvirus 5 pode ser reativado, por exemplo, em receptores de transplante de órgãos sólidos e pacientes HIV positivos. .

Nosso estudo tem várias limitações. Primeiro, o estudo retrospectivo foi projetado para analisar os dados coletados e foi limitado a um tamanho de amostra relativamente pequeno, o que poderia predispor a introduzir viés de informações incompletas. Em segundo lugar, este foi o estudo de observação. Embora tenhamos encontrado algumas correlações interessantes entre a microbiota pulmonar e os dados clínicos, a relação causal precisa ser resolvida por um estudo prospectivo de coorte ou experimento de mecanismo, como um experimento animal, que será o próximo passo de nosso estudo. Caso contrário, o estudo identificou pacientes com provável infecção por Aspergillus estritamente com base nos novos critérios de diagnóstico EORTIC/MSG 2019, de modo que alguns casos não puderam satisfazer os critérios para um provável diagnóstico de IPA devido à ausência de fatores clássicos do hospedeiro.

Contribuintes

Estudo de conceito e design: YL, ZA e HX. Aquisição de dados: ZA, ML, HL e MD. Análise e interpretação dos dados: ZA e HX. Redação do manuscrito: ZA, HX e YL. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: HX, ZA e YL. Análise estatística: ZA, HL e HX. Suporte administrativo, técnico ou material: HX, HL e YL. Todos os autores contribuíram com o artigo e aprovaram a versão submetida.

Financiamento

Projeto de pesquisa científica médica de Chongqing (projeto conjunto da Comissão de Saúde de Chongqing e do Bureau de Ciência e Tecnologia (2022GDRC010)).

Interesses competitivos

Nenhum declarado.

Envolvimento do paciente e do público

Os pacientes e/ou o público não estiveram envolvidos na concepção, condução, relatórios ou planos de divulgação desta pesquisa.

Consentimento do paciente para publicação

Não aplicável.

Aprovação ética

Este estudo envolve participantes humanos. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Hospital (número aprovado 2021-301). Os participantes deram consentimento informado para participar do estudo antes de participar.

Proveniência e revisão por pares

Não comissionado; revisado por pares externamente.

Declaração de disponibilidade de dados

Todos os dados relevantes para o estudo são incluídos no artigo ou carregados como informações suplementares online.

material suplementar

Este conteúdo foi fornecido pelo(s) autor(es). Ele não foi aprovado pelo BMJ Publishing Group Limited (BMJ) e pode não ter sido revisado por pares. Quaisquer opiniões ou recomendações discutidas são exclusivamente do(s) autor(es) e não são endossadas pelo BMJ. O BMJ se isenta de qualquer obrigação e responsabilidade decorrente de qualquer confiança depositada no conteúdo. Onde o conteúdo inclui qualquer material traduzido, o BMJ não garante a precisão e confiabilidade das traduções (incluindo, entre outros, regulamentos locais, diretrizes clínicas, terminologia, nomes de medicamentos e dosagens de medicamentos) e não é responsável por qualquer erro e/ ou omissões decorrentes de tradução e adaptação ou de outra forma.

Acesso livre

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