Extrato de Cistanche Deserticola aumenta a formação óssea em osteoblastos--Parte I
Mar 15, 2022
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Abstrato
Objetivos Investigamos o efeito deCistanchedeserticolaMãe (CD) emossoformaçãopor osteoblastos cultivados. Métodos O ensaio de formação de nódulo mineralizado foi usado para examinar os efeitos in vitro de CD(Cistanchedeserticola)sobreossoformação. Fosfatase alcalina (ALP), proteínas morfogenéticas ósseas (BMP)-2 e expressão de mRNA de osteopontina (OPN) foram analisadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. O mecanismo de ação do CD(Cistanchedeserticola)extrato foi investigado usando Western blotting. O efeito anti-osteoporótico in vivo da DC(Cistanchedeserticola)extrato foi avaliado em camundongos ovariectomizados.
Principais conclusões
CD(Cistanchedeserticola)extrato não teve efeito sobre a proliferação, migração ou cicatrização de feridas de osteoblastos cultivados, mas aumentou ALP, BMP-2, e OPN mRNA e mineralização óssea. Proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) ou inibidores do fator nuclear (NF)-kB reduziram a CD(Cistanchedeserticola)induzido por extratoformação ósseae expressão ALP, BMP-2 e OPN. No entanto, CD(Cistanchedeserticola)extrato não afetou a osteoclastogênese. Além disso, CD(Cistanchedeserticola)extrato preveniu a perda óssea induzida pela ovariectomia in vivo.
Conclusões
CD(Cistanchedeserticola)pode ser uma novelaformação ósseaagente para o tratamento da osteoporose.
Palavras-chaveformação óssea; Cistanchedeserticola; erva chinesa; osteoblastos
Cistanche deserticolaé bom paraformação óssea
Introdução
O osso é um tecido complexo composto por vários tipos de células que passam por um processo contínuo de renovação e reparo denominado 'remodelação óssea'. Os dois principais tipos de células responsáveis pela remodelação óssea são os osteoclastos, que reabsorvem o osso, e os osteoblastos, que formam um novo osso. A remodelação óssea é regulada por vários hormônios sistêmicos (por exemplo, hormônio da paratireoide, 1, 25-diidroxivitamina D3, hormônios sexuais e calcitonina) e fatores locais (por exemplo, óxido nítrico, prostaglandinas, fatores de crescimento e citocinas).[1] A osteoporose ocorre quando a reabsorção e a formação do osso são descoordenadas e o excesso de degradação óssea excede a construção óssea.[2] Os tratamentos atuais para osteoporose incluem bifosfonatos, calcitonina e estrogênio, que são inibidores da reabsorção óssea que mantêm a massa óssea inibindo a atividade dos osteoclastos.[3] No entanto, o efeito desses medicamentos no aumento ou recuperação da massa óssea é relativamente pequeno, certamente não mais do que 2% ao ano.[3] Há, portanto, a necessidade de agentes de construção óssea, como a teriparatida, que estimulem novasossoformaçãoe corrigir a alteração na microarquitetura trabecular que é característica da osteoporose estabelecida.[4,5]ossoformaçãoé principalmente uma função do osteoblasto, agentes que agem aumentando a proliferação de células da linhagem osteoblástica ou induzindo a diferenciação dos osteoblastos podem aumentar a formação óssea.[5,6]
Embora os mecanismos da osteoporose permaneçam obscuros, eles provavelmente estão relacionados à diminuição da disponibilidade ou aos efeitos de fatores de crescimento ósseo, como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs).[7] As BMPs, que são estruturalmente relacionadas à superfamília do fator de crescimento transformante-b, foram originalmente identificadas por sua capacidade de induzir infecções ectópicas.osso formaçãoem roedores.[8] As BMPs desempenham um papel importante naossoformaçãoe diferenciação de células ósseas estimulando a atividade da fosfatase alcalina (ALP), bem como a síntese de proteoglicanos, colágeno e osteopontina (OPN).[9] Um estudo recente encontrou uma ligação entre osteoporose e polimorfismos específicos nos genes BMP-2, ALP e OPN, sugerindo que eles estão associados ao desenvolvimento da osteoporose.[10]
CistanchedeserticolaMãe (Orobanchaceae; abreviado como CD)(Cistanchedeserticola)é uma erva nativa da China e é amplamente utilizada na medicina tradicional como agente terapêutico devido às suas propriedades sedativas, analgésicas e imunoestimuladoras.[11] Estudos farmacológicos modernos mostraram que a DC(Cistanchedeserticola)extratos podem estimular a imunidade,[12] eliminar radicais livres[13] e aumentar a atividade da superóxido dismutase.[14] Os agentes anti-inflamatórios e antioxidantes têm o potencial de tratar a osteoporose, aumentando aosso formaçãoe/ou suprimir a reabsorção óssea.[15,16] No entanto, o efeito da DC(Cistanchedeserticola)sobre a função das células ósseas ainda não foi determinada. Aqui, informamos que o CD(Cistanchedeserticola)extrato não afetou a proliferação, migração ou atividade de cicatrização de feridas de osteoblastos cultivados, mas aumentou a expressão de ALP, BMP-2 e OPN e mineralização óssea. Além disso, mostramos que as vias de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e do fator nuclear (NF)-kB podem estar envolvidas no aumento mediado por CD na expressão gênica e na mineralização óssea. Em contrapartida, o CD(Cistanchedeserticola)extrato não suprimiu a osteoclastogênese in vitro. Notavelmente, o tratamento de camundongos com CD(Cistanchedeserticola)extrato preveniu a perda óssea induzida por ovariectomia in vivo. Nossos dados, portanto, sugerem que o CD(Cistanchedeserticola)pode ser usado para estimularossoformaçãopara o tratamento da osteoporose.
Cistanche deserticolaaumentar a imunidade
Materiais e métodos
Extrato e materiais de Cistanche deserticola
CD(Cistanchedeserticola)O extrato foi adquirido da Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extração e isolamento de CD(Cistanchedeserticola)foram seguidos conforme descrito anteriormente (com base em dados espectrais, eles identificaram a composição química, incluindo beta-sitosterol, daucosterol, ácido succínico, triacontanol, acteosídeo, betaína e polissacarídeo).[17] Anticorpos policlonais de coelho específicos para quinases p-extracelulares reguladas por sinal (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminais quinases (JNK), JNK, p-p65 e p65 foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, EUA). O kit de osteocalcina ELISA foi adquirido da Biosource Technology (Nivelles, Bélgica). Os telopeptídeos C-terminais do kit ELISA de colágeno tipo I foram obtidos da Cross Laps (Herlev, Dinamarca). O mutante negativo dominante p38 foi fornecido pelo Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, EUA). O mutante negativo dominante JNK foi fornecido pelo Dr. M. Karin (Universidade da Califórnia, San Diego, EUA). O mutante negativo dominante ERK2 foi fornecido pelo Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, EUA).
Cultura de células
A linha celular de osteoblastos de murino MC3T3-E1 foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, EUA). As células foram cultivadas em 95 por cento de ar, 5 por cento de CO2 com a-MEM que foi suplementado com 20 mm de HEPES e 10 por cento de soro fetal de vitela inativado pelo calor, 2 mm de glutamina, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 mg /ml).
Medição da formação de nódulos mineralizados
A formação de nódulos mineralizados foi avaliada conforme descrito.[18] Resumidamente, os osteoblastos foram cultivados em meio contendo vitamina C (50 mg/ml) e b-glicerofosfato (10 mm) por duas semanas, e o meio foi trocado a cada três dias. Após incubação com CD(Cistanchedeserticola)durante 12 dias, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com Tris 20 mm contendo 0,15 m de NaCl (pH 7,4), fixadas em etanol 75 por cento (v/v) gelado por 30 min, e ar- seco. A deposição de cálcio foi determinada usando coloração com vermelho S de alizarina. Resumidamente, as células e a matriz fixadas em etanol foram coradas por 1 h com 40 mm de vermelho de alizarina-S (pH 4,2) e enxaguadas extensivamente com água. A coloração ligada foi eluída com cloreto de cetilpiridínio a 10 por cento (p/v) e o vermelho-S de alizarina nas amostras foi quantificado medindo a absorvência a 550 nm e comparado com uma curva padrão. Um mol de vermelho-S de alizarina liga-se seletivamente a aproximadamente dois mols de cálcio.
Cistanche deserticolaé bom paraformação óssea
Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de osteoblastos usando um kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). A transcrição reversa foi realizada usando 2 mg de RNA total e um primer oligo(dT).[19,20] A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizada usando TaqMan® One-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA). O cDNA total foi adicionado (100 ng por 25-ml de reação) com primers específicos de sequência e sondas Taqman®. Todos os primers e sondas do gene alvo foram adquiridos comercialmente, incluindo b-actina como controle interno (Applied Biosystems). Os ensaios de qPCR foram realizados em triplicado em um sistema de detecção de sequência StepOnePlus (Applied Biosystems). As condições de ciclagem foram 10-min de ativação da polimerase a 95 graus seguido de 40 ciclos de 95 graus por 15 s e 60 graus por 60 s. O limiar foi estabelecido acima do fundo de controle não modelo e dentro da fase linear da amplificação do gene alvo para calcular o número do ciclo no qual o transcrito foi detectado (denominado CT).
Análise de Western Blot
Os lisados celulares foram preparados conforme descrito anteriormente.[21,22] As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinil Immobilon (Millipore, Billerica, EUA). Os blots foram bloqueados com 4% de albumina de soro bovino por 1 h em temperatura ambiente e, em seguida, sondados com anticorpos anti-humanos de coelho contra p-65, ou p-p65 (1: 1000) por 1 h em temperatura ambiente. Após três lavagens, os blots foram incubados com anticorpo secundário de burro anti-coelho conjugado com peroxidase (1: 1000) por 1 h à temperatura ambiente. Os blots foram visualizados por quimioluminescência aprimorada usando filme X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, EUA).
Osteoporose induzida por ovariectomia
Camundongos ICR fêmeas, quatro semanas de idade, 22~28 g, foram usados para este estudo. Os camundongos foram ovariectomizados bilateralmente sob anestesia com tricloroacetaldeído (100 mg/kg) e os camundongos controle foram operados simuladamente (Sham) para comparação. A densidade mineral óssea e o conteúdo mineral ósseo foram medidos após a administração oral de várias concentrações de CD(Cistanchedeserticola)extrair a cada dois dias durante quatro semanas. A densidade mineral óssea corporal total e o conteúdo mineral ósseo foram determinados por um absorciômetro de raios-X de dupla energia (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, EUA) usando um modo para pequenos indivíduos conforme descrito anteriormente.[18, 23] Todos os protocolos obedeceram às diretrizes institucionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da China Medical University.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando Prism 4.01software. (GraphPad Software Inc., San Diego, EUA). Os valores dados são SEM média. A análise estatística entre duas amostras foi realizada por meio do teste t de Student. As comparações estatísticas de mais de dois grupos foram realizadas usando uma análise de variância de uma via com o teste posthoc de Bonferroni. Em todos os casos, P < 0,05="" foi="" considerado="">
Cistanche deserticolaé bom paraformação óssea
Resultados
Cistanche deserticolaextrato aumenta a mineralização óssea pelos osteoblastos Adição do CD(Cistanchedeserticola)extrato por 24 ou 48 h não afetou a proliferação de células osteoblastos MC3T3-E1 de camundongo em um ensaio MTT (dados não mostrados). Como a diferenciação de osteoblastos é um processo complexo que envolve proliferação e migração celular, também testamos a capacidade migratória das células MC3T3-E1 após tratamento com CD(Cistanchedeserticola)extrair. Usando Transwell e ensaios de cicatrização de feridas, descobrimos que o CD(Cistanchedeserticola)extrato não afetou a migração de osteoblastos (dados não mostrados). A formação de nódulos mineralizados é um dos marcadores da maturação dos osteoblastos. A coloração com vermelho de alizarina S mostrou que nódulos mineralizados se formaram quando os osteoblastos foram cultivados por duas semanas em meio contendo vitamina C (50 ug/ml) e -glicerofosfato (10 mm), de maneira concentração-dependente pela adição de CD(Cistanchedeserticola)(Figura 1a). Portanto, CD(Cistanchedeserticola)extrair a formação de nódulos ósseos induzida por osteoblastos cultivados, mas não a sua proliferação ou migração. Também examinamos o papel do CD(Cistanchedeserticola)extrato na osteoclastogênese induzida por RANKL, mas não encontrou nenhum efeito (dados não mostrados).
Extrato de Cistanche deserticola aumenta a fosfatase alcalina, proteína morfogenética óssea-2 e expressão de osteopontina em osteoblastos cultivados
Osteoblastos diferenciados exibem atividade ALP elevada, que se correlaciona com altos níveis de expressão enzimática.[18] Descobrimos que o tratamento com CD(Cistanchedeserticola)extrato por 72 h aumentou significativamente a atividade de ALP de osteoblastos (Figura 1b). Dado o papel crucial de BMP-2, ALP e OPN na diferenciação de osteoblastos, testamos se CD(Cistanchedeserticola)O extrato exerce seu efeito na diferenciação de osteoblastos regulando a expressão de BMP-2, ALP e OPN. Tratamento de células com CD(Cistanchedeserticola)extrai a expressão aumentada de mRNA de ALP, BMP-2 e OPN de maneira dependente da concentração (Figura 1c), demonstrando que CD(Cistanchedeserticola)extrair a diferenciação induzida de osteoblastos pela regulação positiva da expressão de ALP, BMP-2 e OPN.
Extrato de Cistanche deserticola aumenta a formação de nódulos ósseos através da via da proteína quinase ativada por mitógeno
Foi relatado que a MAPK desempenha um papel importante naossoformação[24,25] então examinamos em seguida se essa via de sinalização está envolvida na DC(Cistanchedeserticola)mineralização óssea induzida por extrato. Pré-tratamento de células com inibidor de ERK U0126, inibidor de p38 SB203580 ou inibidor de JNK SP600125 CD reduzido(Cistanchedeserticola)mineralização óssea aumentada por extrato (Figuras 2a, 3a e 4a). Além disso, os inibidores também bloquearam o CD(Cistanchedeserticola)ALP induzida por extrato, BMP-2 e expressão de OPN (Figuras 2b–4c). Transfecção de células com CD reduzido mutante ERK2, p38 ou JNK(Cistanchedeserticola)extrato-aumento na expressão de ALP, BMP-2 e OPN mRNA (Figuras 2c, 3c e 4c). Em seguida, examinamos diretamente a ativação de ERK, p38 e JNK após CD(Cistanchedeserticola)extrair tratamento. Incubação de células com CD(Cistanchedeserticola)extrair a fosforilação de ERK, p38 e JNK induzida (Figuras 2d, 3d e 4d). Portanto, ERK, p38 e JNK mediam o aumentoossoformaçãoinduzida por CD(Cistanchedeserticola)tratamento de osteoblastos.
Extrato de Cistanche deserticola aumenta a formação de nódulos ósseos através da via do fator nuclear-kB
Como mencionado anteriormente, a ativação de NF-kB é necessária paraossoformação.[26,27] Em seguida, tratamos osteoblastos com os inibidores de NF-kB pirrolidina ditiocarbamato (PDTC) e N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) foram adquiridos de Calbiochem (Darmstadt, Alemanha) para determinar se a ativação de NF-kB é envolvido em CD(Cistanchedeserticola)mineralização óssea induzida por extrato. A Figura 5a mostra que o pré-tratamento de osteoblastos com PDTC ou TPCK inibiu CD(Cistanchedeserticola)a formação de nódulos ósseos induzida por extrato e também reduziu o aumento na expressão de ALP, BMP-2 e OPN (Figura 5b e 5c). A fosforilação da subunidade p65 de NF-kB é um indicador de ativação de NF-kB;[28] consistente com isso, descobrimos que CD(Cistanchedeserticola)extrato aumentou a fosforilação de p65 nos osteoblastos (Figura 5d). Esses resultados indicaram que a ativação de NF-kB é importante para a expressão de ALP, BMP-2 e OPN induzida por extrato de CD e formação de nódulo ósseo.
Figura 4 Envolvimento de quinases N-terminais c-Jun (JNK) emCistanchedeserticola(CD) mineralização óssea induzida por extrato em osteoblastos. (a) As células foram plaqueadas em 24-placas de poços e cultivadas em meio contendo vitamina C (50 mg/ml) e b-glicerofosfato (10 mM) por duas semanas. As células foram tratadas concomitantemente com CD(Cistanchedeserticola)extracto (26 mg/ml) mais SP600125 (3 mM). A formação do nódulo mineralizado foi avaliada por coloração com vermelho-S de alizarina (n=5). (b, c) As células foram pré-tratadas com SP600125 por 30 min ou transfectadas com mutante JNK ou 24 h seguido de estimulação com extrato de CD e atividade de fosfatase alcalina (ALP) e ALP, proteína morfogenética óssea (BMP)-2 e A expressão de mRNA de osteopontina (OPN) foi medida pelo kit ALP e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. (d) As células foram tratadas com extrato de CD por intervalos de tempo indicados e a expressão de p-JNK foi examinada por Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)grupo tratado com extrato.
Inibição da perda óssea pelo extrato de Cistanche deserticola em camundongos ovariectomizados
Para examinar o efeito do CD(Cistanchedeserticola)extrato na perda óssea, a osteoporose foi induzida em camundongos fêmeas por ovariectomia. Como esperado, camundongos ovariectomizados apresentaram diminuição da densidade mineral óssea total do corpo e conteúdo mineral ósseo (Figura 6a e 6b). Tratamento com CD(Cistanchedeserticola)extrato por quatro semanas inibiu a perda de densidade mineral óssea e conteúdo mineral ósseo de uma maneira dependente da dose (Figura 6a e 6b). As concentrações sanguíneas de ALP podem refletir a atividade osteoblástica.[29] Conforme mostrado na Figura 6c, CD(Cistanchedeserticola)extrato inibiu a diminuição da atividade sérica de ALP induzida pela ovariectomia. Além disso, CD(Cistanchedeserticola)extrato também aumentou o nível de osteocalcina, um marcador deossoformação, e reduziu o nível de telopeptídeos C-terminais de colágeno tipo I, um marcador de reabsorção óssea (Figura 6d e 6e). Esses achados, portanto, apoiam a potência e a eficácia do CD(Cistanchedeserticola)extrato na prevenção da perda óssea in vivo.
Figura 6 A inibição da ovariectomia induziu a diminuição da densidade mineral óssea e do conteúdo mineral ósseo porCistanchedeserticola(CD) extrato. Camundongos ICR fêmeas foram submetidos a uma operação simulada ou foram ovariectomizados. Camundongos ovariectomizados foram tratados com as concentrações indicadas de CD(Cistanchedeserticola)extrato por alimentação oral. Densidade mineral óssea corporal total (a), conteúdo mineral ósseo (b), atividade de fosfatase alcalina sérica (ALP) (c), osteocalcina sérica (d) e telopeptídeos C-terminais séricos de colágeno tipo I (e), foram determinados quatro semanas após a cirurgia. Os dados são apresentados como média SE, n=8–10 camundongos/grupo. *P <0.05, comparado="" com="" sham;="" #p="">< 0,05,="" comparado="" ao="" grupo="">
DISCUSSÃO
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A partir de: 'Cistanchedeserticolaextrair aumentaossoformaçãoem osteoblastos' porTe Mao Liae outros
---© 2012 Os Autores. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Revista de Farmácia e Farmacologia, 64, págs. 897–907
