Polissacarídeos Cistanche Deserticola Aliviam o Declínio Cognitivo e Melhoram a Memória em Camundongos Modelo de Envelhecimento

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Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRATO

Evidências recentes sugerem que alterações no eixo microbiota-cérebro intestinal podem levar ao comprometimento cognitivo com o envelhecimento. No presente estudo, observamos que a administração prolongada de D-galactose a camundongos induziu declínio cognitivo, disbiose microbiana intestinal, inflamação periférica e estresse oxidativo. Neste modelo de declínio cognitivo relacionado à idade, os polissacarídeos Cistanche deserticola (CDPS) melhoraram a função cognitiva em camundongos tratados com D galactose, restaurando a homeostase microbiana intestinal, reduzindo assim o estresse oxidativo e a inflamação periférica. Os efeitos benéficos da CDPS nesses camundongos modelo de envelhecimento foram abolidos através da ablação da microbiota intestinal com antibióticos ou imunossupressão com ciclofosfamida. O perfil metabolômico sérico mostrou que os níveis de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, ácido úrico e prolina estavam todos alterados nos camundongos modelo de envelhecimento, mas foram restaurados pelo CDPS. Esses achados demonstraram que o CDPS melhora a função cognitiva em um modelo de envelhecimento induzido por D-galactose em camundongos, restaurando a homeostase do eixo cerebral da microbiota intestinal, o que aliviou um desequilíbrio de aminoácidos, inflamação periférica e estresse oxidativo. A CDPS mostra, assim, potencial terapêutico para pacientes com distúrbios de memória e aprendizagem, especialmente aqueles relacionados à disbiose microbiana intestinal.

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INTRODUÇÃO

A administração prolongada de D-galactose (D-gal) e sais de berílio induzem o envelhecimento em modelos animais experimentais e culturas de células primárias in vitro e é usado para identificar mecanismos subjacentes ao processo natural de envelhecimento [1-4]. Estudos anteriores mostram que o declínio cognitivo em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose está relacionado a níveis reduzidos de proteína de fator de crescimento nervoso (NGF) e aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) no cérebro, ambos os quais causam degeneração dos neurônios do hipocampo e reduzem neurogênese [3, 4]. Estudos recentes também mostraram que a composição e o número da microbiota intestinal humana mudam significativamente durante o processo de envelhecimento[5].

Cistanche deserticola é uma erva que cresce principalmente na região do deserto noroeste da China e é usada na medicina tradicional chinesa. É comumente conhecido como o "ginseng do deserto". Os extratos de Cistanche deserticola contêm vários compostos farmacologicamente ativos, incluindo glicosídeos feniletanoides, iridóides, lignose, oligossacarídeos, polissacarídeos e aminoácidos; esses compostos estão associados a propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, anti-senescentes, neuroprotetoras e imunomoduladoras [6, 7]. Por exemplo, polissacarídeos extraídos de Cistanche deserticola têm sido usados ​​na medicina tradicional chinesa para tratar o câncer colorretal [8]. Uma ampla gama de polissacarídeos fracamente tóxicos com bioatividades úteis foi isolada de vários organismos, como polissacarídeo Chuanqiong, polissacarídeo Ganoderma lucidum e polissacarídeo Lycium barbarum [9-11]. CDA 0.05 é um galactoglucano isolado de Cistanche deserticola que promove o crescimento de várias bactérias intestinais benéficas, incluindo várias espécies de Bacteroides e Lactobacillus [12].

Os mecanismos subjacentes do processo de envelhecimento normal também estão implicados em várias doenças humanas, como distúrbios neurodegenerativos, aterosclerose coronariana, diabetes tipo 2 (DM2) e hipertensão [13, 14]. Estudos recentes mostraram que as alterações na flora intestinal desempenham um papel significativo no envelhecimento humano [15]. Vários estudos mostraram que a administração prolongada de D-galactose em camundongos e ratos experimentais imita o processo normal de envelhecimento e é um modelo útil para estudar os fenótipos relacionados ao envelhecimento, como o declínio da cognição [16]. Além disso, camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose mostram mudanças na composição da microbiota intestinal [17]. Portanto, levantamos a hipótese de que mudanças na composição da microbiota intestinal podem causar declínio cognitivo nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D galactose e investigamos se os polissacarídeos Cistanche deserticola (CDPS) podem aliviar o declínio cognitivo restaurando a disbiose da microbiota intestinal.

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RESULTADOS

Camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose demonstram declínio cognitivo e disbiose microbiana intestinal

Analisamos o desempenho comportamental de camundongos do tipo selvagem (WT) e aqueles tratados com 150 mg de D-gal por Kg de peso corporal por 2 meses (modelo ou Mod) usando novos testes de reconhecimento de objetos e labirinto aquático de Morris (MWM). Os valores de índice preferencial no novo teste de reconhecimento de objeto foram significativamente reduzidos nos camundongos do grupo Mod em comparação com os camundongos do grupo WT (Figura 1A, 1B). Os resultados do teste MWM mostraram que o tempo de latência de escape após o sexto dia foi significativamente aumentado no grupo Mod em comparação com o grupo WT (Figura 1C, 1D). Além disso, as travessias da plataforma alvo e os tempos de natação dentro do quadrante alvo foram significativamente reduzidos no grupo Mod em comparação com o grupo WT (Figura 1E, 1F). Esses resultados demonstraram um declínio significativo nas habilidades de aprendizado e memória dos camundongos modelo de envelhecimento induzido por Legal.

Em seguida, analisamos as diferenças na abundância e composição dos filos, gêneros e espécies microbianas intestinais nas amostras fecais dos grupos Mod e WT de camundongos usando dados de sequenciamento de RNA ribossômico 16S (rRNA) de amostras fecais. A flora intestinal predominante nos camundongos do grupo WT e Mod foram Firmicutes e Bacteroides. No entanto, a abundância de Bacteroides foi significativamente reduzida e a abundância de Firmicutes foi significativamente aumentada no grupo Mod em comparação com o grupo WT (Figura 2A). Em seguida, realizamos análise discriminante linear (LDA) para determinar os escores do tamanho do efeito LDA (LEfSe) seguido por testes de Kruskal-Wallis e Wilcoxon para avaliar a abundância relativa de diferentes taxa nos camundongos do grupo WT e Mod. Os resultados do LDA são mostrados na Figura 2B. Além disso, construímos cladogramas mostrando o enriquecimento diferencial de vários gêneros e espécies pertencentes aos filos Bacteriodes e Firmicutes nos grupos WT e modelo (Figura 2C). No geral, nossos resultados demonstraram capacidade cognitiva prejudicada e disbiose microbiana intestinal nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose.

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O tratamento com CDPS melhora a capacidade cognitiva em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal

Analisamos se o tratamento com CDPS alivia o declínio cognitivo em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal. Durante os 2 meses da administração, o peso corporal foi medido em dias alternados. Os pesos corporais dos grupos modelo e CDPS de camundongos foram semelhantes (Figura 3A). Realizar experimentos comportamentais após a última dose. Os resultados do novo reconhecimento de objetos e do teste de labirinto aquático de Morris mostraram que a memória de curto prazo foi significativamente maior nos grupos de camundongos CDPS em comparação com o grupo modelo de camundongos; memória de longo prazo no grupo CDPS de camundongos foi maior, mas estatisticamente insignificante em comparação com o grupo modelo de camundongos (Figura 3B, 3C). Isso sugeriu que o tratamento com CDPS revogou a perda de memória de reconhecimento de objetos de curto prazo em camundongos tratados com D-gal.

O aprendizado espacial e a memória desses camundongos foram avaliados pelo teste do labirinto aquático de Morris, e os resultados mostraram que os tempos de latência de escape do grupo de camundongos CDPS foram comparáveis ​​aos do grupo de camundongos WT e significativamente menores do que os camundongos do grupo Mod (Figura 3D) . Além disso, os tempos de latência de escape foram significativamente menores no sexto dia pós-administração de CDPS em comparação com o grupo modelo (Figura 3E). O tempo de natação no quadrante alvo foi significativamente maior nos grupos CH e CM em comparação ao grupo modelo. O grupo CL é maior que o grupo modelo, mas não tem significância estatística (Figura 3F). Além disso, o número de travessias de plataforma foi significativamente maior nos grupos CM e CL em comparação com o grupo modelo. No entanto, o grupo CH é maior que o grupo modelo e não possui significância estatística (Figura 3G). Esses resultados demonstraram que o tratamento com CDPS melhorou o aprendizado espacial e a memória nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal.

Figura 1. A administração prolongada de D-galactose induz o aprendizado e o comprometimento da memória em camundongos.

Figura 2. A administração prolongada de D-galactose induz a disbiose microbiana intestinal em camundongos.

O tratamento com CDPS restaura a homeostase da composição da microbiota intestinal em camundongos modelo de envelhecimento com D-galactose

Monossacarídeos e polissacarídeos são os nutrientes essenciais necessários para o crescimento de bactérias [18-21]. Também é relatado que o CDPS regula a composição da microbiota intestinal [22]. Portanto, analisamos se os tratamentos com CDPS aliviaram a disbiose microbiana intestinal nos camundongos do grupo modelo, avaliando dados de sequenciamento de rRNA 16S de amostras de fezes dos grupos de camundongos WT, modelo e CDPS.

Primeiro, calculamos os índices de diversidade alfa para avaliar a riqueza geral da microbiota fecal e a diferença estrutural entre esses grupos. Analisamos índices de diversidade alfa ( -diversidade) como espécies observadas, valores de Shannon, Chao 1, ACE e Simpson para determinar mudanças na composição de várias espécies bacterianas nas amostras de fezes de diferentes grupos murinos. Os índices de diversidade (espécies observadas, índices de Shannon, Chao 1, ACE e Simpson) foram maiores nos grupos de camundongos WT e CDPS em comparação com o grupo modelo, mas a significância estatística foi observada apenas para os valores do índice Chao 1 entre os CM grupo e grupo Mod. Indicou que a administração com CDPS aumenta a riqueza do microbioma (Figura 4A-4E). Em seguida, analisamos os índices de diversidade para identificar diferenças nas espécies microbianas intestinais entre os grupos de camundongos WT, modelo e CDPS usando Escala Multidimensional Não Métrica (NMDS), Análise de Coordenadas Principais (PCoA) e Análise de Componentes Principais (PCA) . A PCA mostrou variações na composição microbiana intestinal dos camundongos do grupo modelo durante o processo de envelhecimento, incluindo redução de dimensão e manutenção de padrões e tendências (Figura 4F). As diferenças na microbiota fecal entre os grupos WT, modelo e CDPS foram identificadas com base na PCoA das distâncias UniFrac não ponderadas para os genes 16S rRNA (Figura 4G). A análise de agrupamento mostrou diferenças significativas no NMDS entre o grupo modelo e os grupos WT e CDPS (Figura 4H).

Avaliamos os 10 principais filos da microbiota intestinal e descobrimos que a abundância dos filos Bacteroides foi significativamente maior nos grupos CH, CM e CL em comparação com o grupo modelo (Figura 4I). Isso sugeriu que o CDPS restaurou a homeostase da microbiota intestinal em camundongos tratados com D-gal. Os cladogramas mostraram enriquecimento diferencial de vários gêneros e espécies pertencentes aos filos Bacteriodes e Firmicutes nos grupos WT, modelo e CDPS (Figura 4J). Conforme mostrado nos mapas de calor, os tratamentos CDPS reduziram as abundâncias relativas de Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria não identificada, Fusobacteriia e Elusimicrobia não identificada e aumentaram as abundâncias relativas de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, não identificada_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae ,Erisipelotrichia e não identificada_Cianobactérias em comparação com o grupo modelo (Figura 4K). Esses resultados demonstraram que o tratamento com CDPS restaurou significativamente a homeostase da microbiota intestinal nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal.

Figura 3. O tratamento com CDPS melhora o aprendizado e a memória nos camundongos modelo de envelhecimento D-gal.

O tratamento com CDPS alivia a neurodegeneração nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal, reduzindo o estresse oxidativo

Em seguida, analisamos os efeitos do CDPS na inflamação analisando os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias (IL-2 e TNF-) e citocinas anti-inflamatórias (IL-4 e IL-10 ) em diferentes grupos de camundongos. Os níveis séricos de IL-2 e TNF- foram significativamente menores e os níveis séricos de IL-4 e IL-10 foram significativamente maiores nos grupos CH, CM e CL em comparação com o modelo grupo. Mostra-se que o CDPS tem efeitos anti-inflamatórios (Figura 5A-5D).

O estresse oxidativo é causado pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e é um dos principais fatores que promovem o envelhecimento [23]. Portanto, analisamos os efeitos do CDPS no estresse oxidativo no modelo de camundongos de envelhecimento induzido por D-gal, avaliando os níveis séricos da enzima antioxidante, SOD, e do produto da peroxidação lipídica, malondialdeído (MDA). Os níveis séricos de MDA foram significativamente maiores e os níveis séricos de SOD foram significativamente reduzidos no grupo Mod em comparação com o grupo WT, mas o tratamento com CDPS reverteu esses efeitos (Figura 5E, 5F). Esses resultados demonstraram que o estresse oxidativo foi elevado nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal, mas foi reduzido pelo tratamento com CDPS.

Além disso, avaliamos os níveis de estresse oxidativo nos tecidos cerebrais analisando os níveis do produto proteico oxidado avançado (AOPP), peroxidação lipídica direta (LPO) e MDA, bem como as atividades de enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase (GSH-Px ) e superóxido dismutase (SOD) nos homogeneizados de tecido cerebral. Os cérebros dos camundongos do grupo Mod mostraram atividades significativamente reduzidas de SOD e GSH-PX e níveis significativamente aumentados de AOPP, LPO e MDA em comparação com o grupo WT, mas esses efeitos foram revertidos no grupo CH, CM e CL (Figura 6A- 6E).

Além disso, realizamos coloração histológica de seções cerebrais com H&E e coloração Nissl para avaliar os efeitos protetores de CDPS nos cérebros de camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal. Os camundongos do grupo Mod mostraram uma redução significativa no número e volume neuronal, aumento da lacuna entre os neurônios, arranjo irregular dos neurônios e picnose nuclear na região CA1 do hipocampo em comparação com o grupo WT, mas essas alterações patológicas foram significativamente reduzidas pelos tratamentos com CDPS ( Figura 6F). Esses resultados demonstraram que os tratamentos com CDPS reduziram significativamente o estresse oxidativo e a patologia cerebral nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D gal.

Figura 4. O tratamento com CDPS restaura a composição microbiana intestinal em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose.

O tratamento com CDPS reduz a inflamação periférica e o estresse oxidativo, mantendo a homeostase microbiana intestinal em camundongos modelo induzidos por D-gal

Em seguida, analisamos se as alterações na composição da microbiota intestinal estavam associadas ao aumento da inflamação periférica e do estresse oxidativo durante o envelhecimento. Para isso, usamos um coquetel de antibiótico triplo (grupo ABX) ou ciclofosfamida (grupo Cy; veja também Materiais e métodos) para eliminar a microbiota intestinal ou induzir imunossupressão nos camundongos modelo de envelhecimento tratados com CDPS. O tratamento com antibióticos anulou os efeitos benéficos do tratamento com CDPS nos camundongos modelo de envelhecimento. Observamos aprendizado e memória prejudicados (Figura 7A) e alterações na composição da microbiota intestinal (Figura 7B, 7C) nos camundongos do grupo ABX em comparação com o grupo tratado com CDPS. Os resultados acima indicam que mesmo a administração de CDPS não pode aumentar a capacidade de aprendizado e memória dos camundongos após a alteração da flora intestinal. Além disso, observamos níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias no cérebro e no soro de camundongos do grupo ABX em comparação ao grupo CDPS (Figura 7D-7N). Os resultados do grupo ABX e do grupo CY mostraram que após a destruição da flora intestinal e da função imunológica, mesmo a administração de CDPS não conseguiu melhorar a capacidade de aprendizado e memória dos camundongos. Esses resultados sugeriram que o tratamento com CDPS diminuiu a inflamação periférica, o estresse oxidativo e o declínio cognitivo nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por Legal, prevenindo a disbiose intestinal.

Em seguida, usamos a droga imunossupressora, ciclofosfamida [24] para determinar o papel da inflamação nos efeitos benéficos da CDPS. Camundongos CDPS tratados com ciclofosfamida (grupo Cy) mostraram comprometimento da capacidade de aprendizado e memória, alterações na composição da microbiota intestinal e níveis aberrantes de citocinas pró e anti-inflamatórias no cérebro e no soro em comparação com os camundongos do tipo selvagem e do grupo CDPS. No entanto, não há significância comparada com o modelo e o grupo ABX. (Figura 7A-7N). Esses dados demonstram que alterações na composição da microbiota intestinal aumentam a inflamação periférica em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal.

Figura 5. O tratamento com CDPS modula os níveis circulantes de citocinas pró e anti-inflamatórias e fatores relacionados ao estresse oxidativo em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose.

CDPS previne o envelhecimento induzido por D-gal regulando o metabolismo de aminoácidos

O sistema imunológico do hospedeiro é influenciado por metabólitos gerados pela microbiota intestinal [25]. Os metabólitos fecais representam uma leitura funcional do metabolismo microbiano intestinal e da composição microbiana intestinal [26]. Além disso, metabólitos da microbiota intestinal entram na circulação sanguínea e afetam o metabolismo e a saúde do hospedeiro [26, 27]. Um total de 1058 metabólitos foram identificados em amostras de soro de camundongos FWT, Mod e CDPS. Em seguida, analisamos esses metabólitos usando BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e Human Metabolme Database (HMDB) e descobrimos que 65 metabólitos foram expressos diferencialmente no grupo Mod comparado ao grupo WT. Além disso, descobrimos que os níveis de 8 metabólitos (creatinina, valina, L-(-)-Metionina, o-Toluidina, N Etilanilina, ácido úrico, prolina e fenilalanina) diferiram significativamente entre os grupos WT, Mod e CDPS. A análise de enriquecimento da via desses 8 metabólitos usando o MetaboAnalyst [28, 29] mostrou que esses metabólitos estavam relacionados ao metabolismo da arginina, histidina, arginina, prolina e purina (Figura 8A, 8B). 7 metabólitos diferentes do grupo MOD e do grupo CDPS no grupo WT.

Em seguida, analisamos se as alterações no metabolismo de aminoácidos estavam relacionadas a alterações na composição da microbiota intestinal. Observamos que 7 metabólitos diferentes dos grupos WT, Mod e CDPS (creatinina, valina, L-(-)-Metionina, o-Toluidina, N-Etilanilina, ácido úrico e prolina) foram significativamente diminuídos no ABX, Cy, e Mod em comparação com os grupos WT e CDPS. Além disso, não há significância entre os grupos ABX e Cy (Figura 8C). Finalmente, a fim de explorar existe uma correlação entre o metabolismo diferencial e outras doenças relacionadas ao envelhecimento. Analisamos a correlação entre esses sete metabólitos diferencialmente expressos e doenças humanas usando o banco de dados MetaboAnalyst e descobrimos que esses metabólitos estavam associados à doença de Alzheimer (p=0.00173; Figura 8D, 8E). No geral, esses dados sugeriram que o CDPS protege contra o envelhecimento induzido por D-gal, regulando o metabolismo de aminoácidos.

Figura 6. O tratamento com CDPS reduz o estresse oxidativo nos cérebros de camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-galactose

DISCUSSÃO

Um declínio progressivo na função cognitiva é uma característica do envelhecimento. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com CDPS melhorou significativamente o aprendizado e a memória nos camundongos modelo de envelhecimento [30-33]. Neste estudo, demonstramos que o tratamento com CDPS melhorou a função cognitiva ao inibir a inflamação periférica e o estresse oxidativo por meio da restauração da homeostase microbiana intestinal nos camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal (Figura 9). Ratos Sprague-Dawley alimentados com polissacarídeos Cistanche mostraram aumento do crescimento de bactérias intestinais benéficas e maior diversidade microbiana intestinal [34]. CDA-0.05, um polissacarídeo neutro Cistanche, melhorou o crescimento do probiótico Lactobacilli [22]. Esses dados sugeriram que os polissacarídeos Cistanche melhoraram a homeostase das bactérias intestinais.

Neste estudo, demonstramos que o CDPS tem efeitos anti-inflamatórios e melhora a capacidade cognitiva dos camundongos modelo de envelhecimento, modulando a abundância de gêneros bacterianos intestinais, como Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. Portanto, os CDPs podem ser terapeuticamente benéficos para doenças relacionadas ao envelhecimento, remodelando a composição da microbiota intestinal [35,36]. Além disso, estudos anteriores mostraram que os níveis de citocinas inflamatórias no soro e no cólon estão associados à abundância relativa de gêneros bacterianos, como Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria [37, 38]. Além disso, a composição microbiana intestinal regula a função cerebral modulando os níveis circulantes de várias citocinas [39-43]. Nossos resultados mostraram que o tratamento com CDPS diminuiu a abundância relativa de Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria não identificada, Fusobacteriia e Elusimicrobia não identificada, e aumentou a abundância relativa de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, não identificada_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrosophaeria, Anaerolineae, Erisipelotriquia e _cianobactérias não identificadas.

Os metabólitos microbianos intestinais são liberados na corrente sanguínea e regulam a saúde e o metabolismo do hospedeiro [26, 27]. Os metabólitos microbianos intestinais podem ser estimados avaliando a composição do metabólito fecal, que muda com alterações na composição dos micróbios intestinais [44]. Estudos recentes mostraram que os níveis plasmáticos de citrulina, prolina, arginina, asparagina, fenilalanina e treonina estão associados a distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer [45, 46]. Nosso estudo mostrou que os níveis séricos de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N etilanilina, ácido úrico e prolina foram associados ao envelhecimento induzido por D-gal em camundongos.

Extrato de Cistanche: doença anti-Alzheimer

Os braços inatos e adaptativos do sistema imunológico desempenham um papel significativo na manutenção da homeostase microbiana do hospedeiro na superfície luminal intestinal [47]. A microbiota intestinal também desempenha um papel significativo na regulação do sistema nervoso central (SNC) e da imunidade, liberando citocinas e metabólitos na corrente sanguínea [48, 49]. As citocinas pró-inflamatórias desempenham um papel fundamental em várias doenças neurodegenerativas [50-52]. Por exemplo, a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e o glaucoma estão associados ao acúmulo extracelular de amiloide (A) e deposição intracelular de tau hiperfosforilada (p tau) e ferro nas células ganglionares da retina (RGC) [44]. Além disso, a inflamação desempenha um papel significativo na patogênese associada ao glaucoma [53]. A deficiência visual é um sintoma precoce da doença de Alzheimer (DA) e se manifesta antes do início do declínio cognitivo [54]. Nosso estudo demonstrou que o CDPS protege contra o declínio cognitivo e a inflamação periférica, mantendo a homeostase da microbiota intestinal.

Existem várias limitações para este estudo. Em primeiro lugar, a relação entre o metabolismo de aminoácidos e a composição da microbiota intestinal não é bem conhecida. Em segundo lugar, a composição e a estrutura molecular do CDPS não são conhecidas. Portanto, estudos futuros são necessários para explorar ainda mais o papel regulador do CDPS no alívio da DA através do eixo de sinalização cerebral da microbiota intestinal.

Em conclusão, nosso estudo demonstrou que o CDPS melhorou a capacidade cognitiva em camundongos modelo de envelhecimento induzido por D-gal, restaurando a homeostase da microbiota intestinal, restaurando assim o desequilíbrio de aminoácidos, inflamação periférica e estresse oxidativo. Esses achados sugerem que o CDPS é um potencial terapêutico para pacientes com distúrbios de aprendizagem e memória, especialmente aqueles associados à disbiose intestinal.

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação do CDPS

Cerca de 1.0 Kg de Cistanche deserticola limpo foi seco ao ar no forno a 40 graus C e pulverizado em pó bruto. O pó foi extraído em etanol quente por 3 h. O resíduo foi filtrado através de gaze para remover o filtrado e depois diluído com água (8X) e refluxado sequencialmente por 2 h, 1,5 h e 1 h a 90 graus C. Em cada ponto de tempo, a solução foi centrifugada para separar o sobrenadante e combinado com o filtrado castanho-avermelhado. Em seguida, o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, resfriado à temperatura ambiente, adicionado lentamente a 95 por cento de etanol (3X) e deixado em repouso a 4 graus C por 24 h. Em seguida, a solução foi centrifugada a 6000 r/min por 20 min a 4 graus C. O precipitado foi coletado após repetir a extração de água e precipitação com álcool três vezes. O precipitado foi reconstituído em água, desproteinizado, dialisado e liofilizado para obter o polissacarídeo Cistanche deserticola (CDPs) bruto. O teor de polissacarídeos foi superior a 90 por cento, conforme avaliado por espectrofotometria ultravioleta.

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Agrupamento de animais e tratamentos

Camundongos Kunming machos de oito semanas de idade (SCXK License No.2019-0010) foram adquiridos da SPF Biotechnology Co. Ltd (Pequim, China), alojados em uma sala com luz e temperatura controlada e alimentados com comida e água. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Inner Mongolia Medical University. Os experimentos foram realizados de acordo com o Guia do National Institutes of Health (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório.

Após 1 semana de adaptação ao novo ambiente, 120 camundongos foram divididos nos seguintes 7 grupos: (1) controle do tipo selvagem (WT); grupo modelo (150 mg/Kg/dia D-gal; Mod); (3) CH: D-gal mais 100 mg/kg de CDPS; (4) CM: D-gal mais 50 mg/kg de CDPS; (5) CL: D-gal mais 25 mg/kg de CDPS; (6) Grupo ABX: antibióticos mais D-gal mais 50 mg/Kg de CDPS; (7) Grupo Cy: ciclofosfamida mais D-gal mais 50mg/kg de CDPS.

Os camundongos dos grupos modelo, ABX, Cy e CDPS receberam injeções subcutâneas de 150 mg/kg de D-gal dissolvido em solução salina todos os dias por 2 meses. O grupo WT foi injetado por via subcutânea com igual volume de solução salina por 2 meses. Os camundongos do grupo CDPS também foram administrados diariamente com injeções intragástricas contendo 100 mg/kg, 50 mg/Kg ou 25 mg/Kg CDPS por 2 meses. Os camundongos do grupo ABX receberam água potável com 0,1 mg/mL de ampicilina e 0,5 mg/mL de estreptomicina por 2 meses, além de injeções de D-gal e CDPS. Antes da administração de D-gal, os camundongos receberam injeções contendo 0,1 mg/mL de ampicilina, 0,5 mg/mL de estreptomicina e 0,1 mg/mL de colistina por 7 dias no grupo ABX. Os camundongos do grupo Cy receberam injeções intraperitoneais de 20 mg/Kg de ciclofosfamida em dias alternados (qod) por 2 meses, além de injeções diárias de D-gal e CDPS.

Novo teste de reconhecimento de objetos

Realizar experimentos comportamentais após a última dose. O teste de reconhecimento de objetos envolveu etapas de familiarização, treinamento e teste. Durante a fase de familiarização, os camundongos foram habituados em uma câmara de teste vazia por 10 minutos por dois dias. Então, no terceiro dia (dia de treinamento), dois objetos de mesmo tamanho, forma e cor (A1 e A2) foram colocados em extremidades opostas da câmara. Cada rato recebeu 10 minutos para explorar os dois objetos semelhantes. Após 1-hora (no terceiro dia) e 24-hora (no quarto dia) de intervalos de treinamento para teste, um dos objetos semelhantes (A1 ou A2) foi substituído por um B ou C objeto que é diferente em tamanho, cor e forma no dia do teste. Durante a fase de teste, cada camundongo foi testado por 5 minutos e o índice preferencial foi calculado para determinar a memória do reconhecimento do novo objeto (B ou C) usando a seguinte fórmula: Índice preferencial=Tempo no objeto B ou C/ (Tempo no objeto B ou C mais Tempo no objeto A)×100 por cento .

Teste do labirinto aquático de Morris

O teste do labirinto aquático de Morris foi realizado em uma piscina redonda com 45 cm de profundidade e 90 cm de diâmetro. O protocolo descrito por Ruediger S, et al. (2011) [55] e Wood RA, et al. (2018) [56] foi empregado aqui. A profundidade da água na piscina era de 30 cm e a temperatura da água era de 20±1°C. A plataforma tinha 6 cm de diâmetro e 1 cm debaixo d'água. O tempo de treinamento e teste foi de 60 segundos cada. Para treinamento, realizamos quatro tentativas de 60 s cada com uma plataforma oculta todos os dias por cinco dias contínuos. Caso a plataforma não fosse descoberta pelos camundongos em 60 s, eles eram guiados até a plataforma e colocados na plataforma por 5 s. Durante a fase de teste, a latência para alcançar a plataforma oculta nas sessões de treinamento e teste de sondagem, o número de cruzamentos sobre a localização da plataforma removida e o tempo gasto no quadrante alvo (plataforma) foram registrados e analisados.

Ensaios ELISA

Os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias como IL-2(), IL-4, IL-10 e TNF- foram analisados ​​para cada grupo de camundongos usando kits ELISA adquiridos da Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. A atividade da enzima antioxidante, superóxido dismutase (SOD), e os níveis do produto de peroxidação lipídica, malondialdeído (MDA), no soro de cada grupo de camundongos foram analisados ​​por kits de ensaio adquiridos do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) . Os níveis de produtos de proteína de oxidação avançada (AOPP) nas amostras de hipocampo murino foram estimados usando um kit ELISA da Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante.

Estimativa do estresse oxidativo em cérebros murinos

Homogeneizamos 100 mg de tecido do hipocampo com 0,9 ml de solução salina gelada e o homogenato foi centrifugado a 12.000 rpm por 30 min a 4 graus C. O conteúdo de proteína no sobrenadante foi analisado usando o BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotecnologia, Xangai, China). Os níveis de peroxidação lipídica (LPO) e malondialdeído (MDA) e as atividades de GSH-Px e SOD nas amostras de hipocampo foram analisadas por colorimetria usando kits do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante.

Suplemento Cistanche: melhora a memória

Composição da microbiota intestinal

Amostras fecais foram coletadas de todos os camundongos e imediatamente armazenadas a -80 grau C. A região V3 mais V4 do gene 16S rRNA foi sequenciada usando Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Pequim, China) e analisada usando o QIIME plataforma aberta para determinar os perfis da microbiota intestinal.

Análise LC/MS de metabólitos séricos

As amostras de soro foram incubadas por 10 minutos com metanol pré-resfriado na proporção de 1:3 para precipitar as proteínas. As amostras foram centrifugadas a 12{14}}00r/min por 15 minutos a 4 graus C. Os sobrenadantes foram analisados ​​por cromatografia líquida de resolução rápida Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 e espectro de massa QExactive. As condições cromatográficas são mostradas na Tabela 1. Os analitos foram separados em uma coluna cromatográfica XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, EUA) usando 0,1 por cento de ácido fórmico e acetonitrila como fases móveis A e B , respectivamente. A taxa de fluxo foi ajustada para 0,4 ml/min, o volume de injeção foi de 5 µl e a temperatura da coluna foi ajustada para 25 graus C (Tabela 1). Os sinais do espectro de massa foram obtidos usando os modos de varredura de íons positivos e negativos. A voltagem de pulverização de íons e outros parâmetros específicos de MS são mostrados na Tabela 2.

Análise estatística

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 e p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">