Polissacarídeo Cistanche Deserticola inibe a perda óssea induzida por OVX em camundongos e osteoclastogênese induzida por RANKL

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ABSTRATO

A osteoporose é uma doença óssea grave que afeta o envelhecimento da população. Cistanche deserticola (CD), um alimento tônico e medicinal amplamente utilizado na China, provou fornecer tratamento eficaz para a osteoporose. O polissacarídeo Cistanche deserticola (CDP), extraído do CD, possui diversas propriedades farmacológicas, mas seu papel naosteoclásticoformação e função, bem como a osteoporose, permanece desconhecida. O objetivo deste estudo foi extrair e purificar CDP para explorar ainda mais seu potencial mecanismo de ação na osteoporose. Os resultados mostraram que o tratamento com CDP preveniu a osteoporose induzida por OVX e melhorou a perda óssea ao reprimir a atividade e a função dos osteoclastos. Além disso, o tratamento com CDP inibiu significativamente a osteoclastogênese induzida por RANKL, a reabsorção óssea e a expressão gênica específica dos osteoclastos. Mecanicamente, o CDP inibiu a ativação das vias de sinalização de NF-κB e MAPKs induzidas por RANKL e, consequentemente, afetou a ativação de NFATc1 a jusante. Os achados deste estudo sugerem que a CDP é uma droga potencialmente segura para o tratamento da osteoporose.(10 benefícios que o Cistanche pode proporcionar)

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Introdução

A osteoporose – uma doença caracterizada por diminuição da massa óssea, microestrutura anormal do tecido ósseo, aumento da fragilidade óssea e fratura (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli e Ginaldi, 2006) – afeta atualmente mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo e apresenta um carga socioeconômica na sociedade moderna (Strom et al., 2011). O tratamento clínico da osteoporose concentra-se principalmente na reposição hormonal,bifosfonatoou terapia com denosumabe. Esses métodos são eficazes, mas apresentam efeitos colaterais de longo prazo, como o risco potencial de câncer de mama e fraturas atípicas do fêmur (Black, Bauer, Schwartz, Cummings e Rosen, 2012; Rachner, Khosla e Hof Bauer, 2011). Portanto, há uma necessidade urgente de explorar drogas que possam não apenas inibir a osteoporose, mas também apresentar menos efeitos colaterais indesejáveis. Cistanche deserticola (CD), um alimento tônico e medicinal amplamente utilizado na China, conhecido como "ginseng do deserto", é o caule suculento seco com folha de escama de C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) e possui diversas e atividades farmacológicas eficazes, como regulação imunológica,anti-oxidação, e propriedades anti-osteoporose (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Estudos anteriores sobre as substâncias ativas da DC no tratamento da osteoporose se concentraram principalmente nos glicosídeos feniletanoides (Li, Jiang e Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao e Ma, 2017). No entanto, o CD também contém outros componentes eficazes, como iridóides, lignanas, polissacarídeos (Wang, Zhang, & Xie, 2012). A aplicação clínica da medicina tradicional chinesa (MTC) é principalmente a decocção da água. Os polissacarídeos são componentes solúveis em água e provavelmente são os principais componentes farmacodinâmicos da MTC. Polissacarídeos extraídos da MTC foram amplamente relatados como tendo um efeito anti-osteoporose e alguns efeitos colaterais indesejáveis, que têm sido geralmente usados ​​em clínicas (por exemplo, polissacarídeos extraídos deEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai e Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang e Yan, 2018) e Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Portanto, hipotetizamos quePolissacarídeo Cistanche Deserticola(CDP) extraído do CD pode ser uma droga potencialmente segura para o tratamento da osteoporose. Normalmente, a reabsorção óssea e a formação óssea mantêm um equilíbrio dinâmico durante a remodelação óssea em coordenação com vários tipos de células, incluindo osteoclastos,osteoblastos, células de revestimento ósseo e osteócitos (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Uma quebra nesse equilíbrio pode resultar em uma variedade de doenças metabólicas ósseas, como osteoporose (Zhu et al., 2018) e osteosclerose (Ihde et al., 2011). Os osteoclastos, como células diferenciadas finais derivadas da linhagem mononuclear/macrófaga, são as únicas células com função de reabsorção óssea (Teitelbaum, 20{{106}}0). Existem duas citocinas chave que participam da diferenciação e maturação dos osteoclastos (Koga et al., 2004): fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e ligante do receptor ativador do fator nuclear κB (NF-κB) (RANKL). O M-CSF medeia a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas em progenitores de osteoclastos e promove a diferenciação de osteoclastos pela regulação positiva da expressão do receptor RANK (Takayanagi, 2007). A ligação de RANKL e RANK na superfície celular dos osteoclastos resulta no seguinte: (1) recrutamento de moléculas adaptadoras de sinalização, como o fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6); (2) ativação de múltiplos alvos a jusante, incluindo NF-κB e proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs); e (3) regulação positiva dos níveis de expressão do fator nuclear de células T ativadas, citoplasmática 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). A ativação dessas vias de sinalização regula diretamente a expressão de genes de osteoclastos, incluindo fosfatase ácida 5 (Acp5) [codificação de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAcP)], metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) e catepsina K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Portanto, a inibição das vias de sinalização relacionadas à diferenciação de osteoclastos induzida por RANKL é um método terapêutico potencial para a osteoporose. Neste estudo, nosso objetivo foi determinar os efeitos do tratamento com CDP no modelo de camundongo com osteoporose induzida por ovariectomização (OVX) in vivo e na atividade osteoclástica induzida por RANKL in vitro, com foco na expressão de genes específicos de osteoclastos e na ativação de NFATc1 e as vias de sinalização de NF-κB e MAPKs. Nossas descobertas podem fornecer novos insights sobre o potencial da CDP como uma droga segura e eficaz para o tratamento da osteoporose. 2. Materiais e métodos 2.1. O CD de produtos químicos e coleta de amostras (nº 180801) foi adquirido da Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) e identificado pelo Professor Haibo Huang da Escola de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, Guangzhou, China . Os comprimidos de valerato de estradiol foram adquiridos à Bayer (Leverkusen, North-Rhine Westphalia, Alemanha). O meio essencial mínimo alfa modificado (-MEM) e o soro fetal bovino (FBS) foram obtidos da Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Penicilina/estreptomicina e o kit de coloração TRAcP foram adquiridos da Solarbio (Pequim, China). M-CSF de camundongo recombinante e RANKL de camundongo recombinante foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). As placas revestidas com hidroxiapatite foram adquiridas da Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, EUA). Os anticorpos primários para NFATc1 e CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK e P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, EUA); e -actina (CWBIO, Pequim, China) também foi obtida. Os demais reagentes utilizados neste estudo eram de grau analítico, e a água foi purificada pelo sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). 2.2. Extração de CDP O CD foi moído até um pó fino e misturado com éter de petróleo três vezes para derrotá-lo. O resíduo sólido foi recolhido por filtração e depois seco à temperatura ambiente. Os polissacarídeos foram extraídos das amostras pré-tratadas três vezes com água por 2 h, concentrados, precipitados pela adição de etanol anidro a uma concentração final de 80 por cento (v/v) e armazenados a 4 ◦C por 24 h. Os precipitados foram coletados por centrifugação a 3000 rpm por 20 min, dissolvidos em água destilada e purificados (remoção de proteínas livres) pelo método Sevag (Zhao et al., 2019). Os polissacarídeos recuperados foram dialisados, secos e armazenados até uso posterior. Além disso, os resultados da composição química mostraram que os teores totais de açúcar, ácido urônico, sulfato e proteína do CDP foram 67,63 ± 0,98 por cento, 21,05 ± 0,49 por cento, 1,90 ± 0,24 por cento e 8,81 ± 0,36 por cento. A composição de monossacarídeos e a análise infravermelha de transformada de Fourier de CDP foram mostradas nas Fig. 1 e 2 complementares. 2.3. Modelo de camundongo com osteoporose induzida por OVX Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou (aprovado SYXK 2019-0202). Trinta 6-camundongos C57BL/6 fêmeas de semanas de idade foram fornecidos pelo Experiment Animal Center da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou. Após aclimatação por 1 semana, um grupo de camundongos foi submetido a uma operação simulada (grupo Sham), enquanto os demais camundongos foram submetidos a uma operação de ovariectomia (grupo OVX). Após a cirurgia, os camundongos foram autorizados a se recuperar por 1-semanas. Em seguida, os camundongos modelados com sucesso foram divididos aleatoriamente em 5 grupos, com 6 camundongos por grupo: (1) grupo Sham: tratado com água destilada, (2) grupo OVX: tratado com água destilada, (3) grupo OVX mais E2 (E2) : tratado com 0,13 mg/kg de comprimidos de valerato de estradiol, (4) grupo OVX mais CDP dose baixa (CDP-L): tratado com 300 mg/kg de CDP, (5) grupo OVX mais CDP dose alta (CDP H): tratado com 600 mg/kg de CDP. Água destilada, E2 ou CDP foi administrada por gavagem uma vez ao dia. Todos os camundongos foram sacrificados após o período de tratamento 12- semana (Fig. 1A). Os úteros foram coletados e pesados, e as tíbias esquerdas foram coletadas para exames posteriores. Amostras de sangue total foram coletadas e centrifugadas a 5000 rpm por 15 min a 4 ◦C. Os sobrenadantes séricos foram aspirados e armazenados a -80 ◦C até análise posterior. 2.4. Análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) e histomorfometria óssea As tíbias esquerdas foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento por 48 horas e posteriormente colocadas em tubos de centrífuga contendo soro fisiológico. As amostras fixas foram escaneadas com o instrumento Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Bélgica) usando as seguintes configurações: voltagem, 80 kV; corrente da fonte, 100 μA; Al, filtro de 0,5 mm; tamanho do pixel, 9,76 μm; e passo de rotação, 0,6◦. Vários parâmetros do osso trabecular, incluindo densidade mineral óssea (DMO), fração de volume ósseo (BV/TV), superfície óssea por volume total (BS/TV), número trabecular (Tb. N) e espaçamento trabecular (Tb.Sp ) foram medidos usando o software CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). As imagens tridimensionais foram geradas usando o software CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Após a análise de micro-CT, as tíbias esquerdas foram descalcificadas em solução de EDTA a 14 por cento e incluídas em parafina para seccionamento. As amostras foram cortadas em seções de 5 µm usando um micrótomo antes dos experimentos de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e TRAcP. Os cortes corados foram examinados e documentados usando microscópio Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tóquio, Japão). 2.5. Análise do soro As concentrações de cálcio (Ca) e fósforo (P) foram determinadas de acordo com as instruções do kit elaborado pelo Instituto de Bioengenharia Nanjing Jiancheng (Nanjing, China). Os níveis de TRAcP-5b e RANKL no soro foram analisados ​​usando o kit TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, China) e o kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China), respectivamente.

O CD de produtos químicos e coleta de amostras (nº 180801) foi adquirido da Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) e identificado pelo Professor Haibo Huang da School of Ciências Farmacêuticas, Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, Guangzhou, China. Os comprimidos de valerato de estradiol foram adquiridos à Bayer (Leverkusen, North-Rhine Westphalia, Alemanha). O meio essencial mínimo alfa modificado (-MEM) e o soro fetal bovino (FBS) foram obtidos da Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Penicilina/estreptomicina e o kit de coloração TRAcP foram adquiridos da Solarbio (Pequim, China). M-CSF de camundongo recombinante e RANKL de camundongo recombinante foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). As placas revestidas com hidroxiapatite foram adquiridas da Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, EUA). Os anticorpos primários para NFATc1 e CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK e P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, EUA); e -actina (CWBIO, Pequim, China) também foi obtida. Os demais reagentes utilizados neste estudo eram de grau analítico, e a água foi purificada pelo sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). 2.2. Extração de CDP O CD foi moído até um pó fino e misturado com éter de petróleo três vezes para derrotá-lo. O resíduo sólido foi recolhido por filtração e depois seco à temperatura ambiente. Os polissacarídeos foram extraídos das amostras pré-tratadas três vezes com água por 2 h, concentrados, precipitados pela adição de etanol anidro a uma concentração final de 80 por cento (v/v), e armazenados a 4 ◦C por 24h. Os precipitados foram coletados por centrifugação a 3000 rpm por 20 min, dissolvidos em água destilada e purificados (remoção de proteínas livres) usando o método Sevag (Zhao et al., 2019). Os polissacarídeos recuperados foram dialisados, secos e armazenados até uso posterior. Além disso, os resultados da composição química mostraram que os teores totais de açúcar, ácido urônico, sulfato e proteína do CDP foram 67,63 ± 0,98 por cento, 21,05 ± 0,49 por cento, 1,90 ± 0,24 por cento e 8,81 ± 0,36 por cento. A composição de monossacarídeos e a análise infravermelha de transformada de Fourier de CDP foram mostradas nas Fig. 1 e 2 complementares. 2.3. Modelo de camundongo com osteoporose induzida por OVX Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou (aprovado SYXK 2019-0202). Trinta 6-camundongos C57BL/6 fêmeas de semanas de idade foram fornecidos pelo Experiment Animal Center da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou. Após aclimatação por 1 semana, um grupo de camundongos foi submetido a uma operação simulada (grupo Sham), enquanto os demais camundongos foram submetidos a uma operação de ovariectomia (grupo OVX). Após a cirurgia, os camundongos foram autorizados a se recuperar por 1-semana. Em seguida, os camundongos modelados com sucesso foram divididos aleatoriamente em 5 grupos, com 6 camundongos por grupo: (1) grupo Sham: tratado com água destilada, (2) grupo OVX: tratado com água destilada, (3) grupo OVX mais E2 (E2) : tratado com 0,13 mg/kg de comprimidos de valerato de estradiol, (4) grupo OVX mais CDP dose baixa (CDP-L): tratado com 300 mg/kg de CDP, (5) grupo OVX mais CDP dose alta (CDP H): tratado com 600 mg/kg de CDP. Água destilada, E2 ou CDP foi administrada por gavagem uma vez ao dia. Todos os camundongos foram sacrificados após o período de tratamento de 12- semanas (Fig. 1A). Os úteros foram coletados e pesados, e as tíbias esquerdas foram coletadas para exames posteriores. Amostras de sangue total foram coletadas e centrifugadas a 5000 rpm por 15 min a 4 ◦C. Os sobrenadantes séricos foram aspirados e armazenados a -80 ◦C até análise posterior. 2.4. Análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) e histomorfometria óssea As tíbias esquerdas foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento por 48 horas e posteriormente colocadas em tubos de centrífuga contendo soro fisiológico. As amostras fixas foram escaneadas com o instrumento Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Bélgica) usando as seguintes configurações: voltagem, 80 kV; corrente da fonte, 100 μA; Al, filtro de 0,5 mm; tamanho do pixel, 9,76 μm; e passo de rotação, 0,6◦. Vários parâmetros do osso trabecular, incluindo densidade mineral óssea (BMD), fração de volume ósseo (BV/TV), superfície óssea por volume total (BS/TV), número trabecular (Tb. N) e espaçamento trabecular (Tb. Sp ) foram medidos usando o software CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). As imagens tridimensionais foram geradas usando o software CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Após a análise de micro-CT, as tíbias esquerdas foram descalcificadas em solução de EDTA a 14 por cento e incluídas em parafina para seccionamento. As amostras foram cortadas em seções de 5 µm usando um micrótomo antes dos experimentos de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e TRAcP. Os cortes corados foram examinados e documentados usando microscópio Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tóquio, Japão). 2.5. Análise sérica As concentrações de cálcio (Ca) e fósforo (P) foram determinadas de acordo com as instruções do kit elaborado pelo Nanjing

Instituto de Bioengenharia Jiancheng (Nanjing, China). Os níveis de TRAcP{{0}}b e RANKL no soro foram analisados ​​usando o kit TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, China) e o kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China) , respectivamente. 2.6. Ensaio de osteoclastogênese in vitro BMMs foram isolados da tíbia e fêmur de camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-semanas de idade. As células isoladas foram cultivadas em meio -MEM contendo 25 ng/mL de M-CSF, 10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina/estreptomicina. Ao atingir a confluência, as BMMs (1 × 104 células/poço) foram semeadas em 96-placas de poço e tratadas com CDP na presença de 50 ng/mL RANKL. O meio e CDP foram substituídos a cada 2 dias. Após 7 dias, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento e coradas para a presença de vestígios. O número de osteoclastos, definidos como células TRAcP positivas com três ou mais núcleos, foi contado e documentado usando um microscópio de luz. 2.7. Ensaio de proliferação celular Os BMMs (1 × 104 células/poço) foram semeados em uma placa de 96-poço e incubados durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com diferentes concentrações de CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 µg/mL) por 48 h. A confluência celular foi detectada e analisada usando o IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, EUA), um sistema de imagem dinâmica de células vivas em tempo real e de longo prazo. 2.8. Ensaio de reabsorção de hidroxiapatita As BMMs (1 × 104 células/poço) foram semeadas em uma placa revestida com hidroxiapatita, tratadas com CDP nas concentrações indicadas (0, 5 e 10 µg/mL), e cultivadas em -MEM completo contendo 25 ng/ mL de M-CSF e 50 ng/mL de RANKL. Após 7 dias, as células foram lavadas com uma solução de lixívia a 10 por cento para remover os componentes celulares. As imagens das áreas de reabsorção de hidroxiapatita foram capturadas usando IncuCyte ZOOM® e analisadas usando o software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Isolamento de RNA e análise de PCR quantitativa de transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR) Os BMMs (1 × 105 células/poço) foram semeados em uma placa de 6-poço e estimulados com RANKL e M-CSF na presença de CDP em diferentes concentrações (0, 5 e 10 µg/mL) por 5 dias. O RNA total foi isolado das células ou tecido ósseo de camundongos usando reagente TRIzol (Sigma Aldrich). O DNA complementar foi sintetizado a partir de 2 µg de RNA total usando um kit de transcriptase reversa (TransGen Biotech, Pequim, China). As reações de RT-qPCR foram preparadas usando PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) e detectadas pelo sistema ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA). Os parâmetros de ciclagem para PCR foram definidos da seguinte forma: 95 ◦C por 5 min, seguido por 40 ciclos de 95 ◦C por 15 se 60 ◦C por 30 s. Os primers específicos utilizados são mostrados na Tabela 1, e a quantidade de cada gene alvo foi normalizada para GAPDH (controle interno).

2.10. Análise de Western blot Os BMMs (5 × 105 células/poço) foram semeados em uma placa de 6-poço. Para experimentos de curta duração, as células foram pré-incubadas com as diferentes concentrações de CDP (0, 5 e 10 µg/mL) por 1 h e depois tratadas com 5{{ 58}} ng/mL RANKL por 30 min. Por um longo período de tempo, as células foram estimuladas com 50 ng/mL de RANKL nos dias 3, 5 e 7 na presença de CDP (0, 5 e 10 µg/mL). As proteínas totais foram extraídas usando o tampão de lise RIPA (CWBIO). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE a 10 por cento e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado à temperatura ambiente por 2 h, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ◦C e, em seguida, com os anticorpos secundários correspondentes por 1,5 h. As membranas foram desenvolvidas usando reagentes ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, EUA), e as imagens foram obtidas usando Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Xangai, China). 2.11. Detecção de translocação de NFATc1 usando teste de imunofluorescência As BMMs foram semeadas em 12-lamelas de poços, estimuladas com RANKL e M-CSF e tratadas com 10 µg/mL de CDP por 5 dias. As células foram fixadas com 4 por cento de paraformaldeído por 15 min, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,1 por cento de Triton X-100 por 10 min. As células foram misturadas com 10 por cento de soro de cabra (CWBIO) e incubadas por 2 h. Subsequentemente, as células foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ◦C e depois com o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, EUA) no escuro por 1 h. As lamínulas foram lavadas com PBS, montadas em Prolong Gold Antifade Reagent com 4', 6-diamidino-2-fenil in-dol (DAPI) (Solar), e inspecionadas usando Zeiss LSM 800 com microscópio confocal Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). 2.12. Análise estatística Todos os dados experimentais foram analisados ​​usando o software estatístico SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA). Os dados para estudos em animais e células são expressos como média ± SEM e média ± SD, respectivamente. Os resultados estão usando análise de variância unidirecional ou teste t de Student. Valores de p < 0,05="" foram="" considerados="" estatisticamente="" significantes.="" 3.="" resultados="" 3.1.="" cdp="" previne="" a="" perda="" óssea="" induzida="" por="" ovx="" in="" vivo="" usamos="" um="" modelo="" de="" camundongo="" com="" osteoporose="" induzida="" por="" ovx="" para="" investigar="" os="" efeitos="" do="" tratamento="" com="" cdp="" na="" osteoporose="" in="" vivo.="" comparado="" com="" o="" grupo="" sham,="" o="" peso="" corporal="" dos="" camundongos="" ovx="" aumentou="" significativamente="" enquanto="" o="" índice="" uterino="" diminuiu,="" indicando="" que="" o="" modelo="" de="" osteoporose="" foi="" construído="" com="" sucesso="" (fig.="" 1b="" e="" d).="" a="" análise="" micro-ct="" das="" tíbias="" no="" grupo="" ovx="" mostrou="" uma="" extensa="" perda="" óssea.="" comparado="" com="" o="" grupo="" ovx,="" o="" número="" de="" trabéculas="" ósseas="" aumentou="" no="" grupo="" cdp-l,="" enquanto="" o="" aumento="" nos="" grupos="" cdp-h="" e="" e2="" foi="" mais="" significativo,="" e="" as="" trabéculas="" nos="" dois="" últimos="" grupos="" tornaram-se="" mais="" grossas="" e="" o="" gap="" tornou-se="" menor.="" fig.="" 1c).="" a="" análise="" quantitativa="" confirmou="" que="" vários="" parâmetros="" histomorfométricos="" ósseos,="" incluindo="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" e="" tb.="" n="" teve="" valores="" significativamente="" aumentados,="" enquanto="" tb.="" sp="" apresentou="" valores="" diminuídos="" no="" grupo="" cdp-h="" (fig.="" 1e="" e="" f).="" seu="" exame="" patológico="" usando="" coloração="" h&e="" revelou="" que="" o="" número="" de="" trabéculas="" ósseas="" nos="" grupos="" cdp-h="" e="" e2="" foi="" significativamente="" maior="" do="" que="" no="" grupo="" ovx,="" enquanto="" não="" houve="" melhora="" significativa="" no="" grupo="" cdp-l="" (fig.="" 1g).="" além="" disso,="" a="" coloração="" tracp="" mostrou="" que="" o="" número="" de="" osteoclastos="" aumentou="" acentuadamente="" no="" grupo="" ovx,="" mas="" diminuiu="" nos="" grupos="" cdp-h="" e="" e2="" (fig.="" 1h).="" os="" grupos="" cdp-l,="" cdp-h="" e="" e2="" inibiram="" o="" aumento="" do="" teor="" de="" p="" induzido="" por="" ovx,="" mas="" aumentaram="" o="" teor="" de="" ca="" no="" soro="" sanguíneo.="" os="" marcadores="" de="" absorção="" óssea,="" rankl="" e="" tracp-5b="" apresentaram="" tendência="" decrescente="" no="">

o grupo sem diferença estatística, enquanto foram significativamente diminuídos no grupo CDP-H (fig. 1I). Além disso, examinamos o efeito da CDP na expressão de genes marcadores de osteoclastos nos tecidos ósseos por RT-qPCR. Os níveis de mRNA de NFATc1, Acp5, Mmp9 e CTSK no grupo OVX foram significativamente maiores do que os do grupo Sham. Os grupos CDP-H mostraram diminuição do nível de mRNA de NFATc1, Acp5 e CTSK em 1.74-, 1.70- e 2.00-vezes, em comparação com o grupo OVX. (Fig. 1J). 3.2. CDP suprime osteoclastogênese induzida por RANKL in vitro Nós monitoramos a proliferação celular de BMMs tratados com CDP usando um analisador de imagem de células vivas dinâmicas de longo prazo em tempo real. Em comparação com o grupo controle, a confluência celular nos grupos tratados com CDP não mudou em uma dose<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 µg/mL CDP mostrou tamanho e número significativamente reduzidos (Fig. 2B e C). Esses resultados mostraram que a CDP inibiu efetivamente a osteoclastogênese induzida por RANKL esperada sem afetar a viabilidade celular. 3.3. CDP inibe a atividade de reabsorção osteoclástica induzida por RANKL e a expressão gênica específica de osteoclastos Determinamos ainda os efeitos do tratamento com CDP na atividade de reabsorção óssea de osteoclastos usando placas revestidas com hidroxiapatita. A reabsorção óssea é a principal função e padrão para medir a atividade e a capacidade dos osteoclastos (Novack & Faccio, 2011). Os resultados mostraram que a CDP pode reduzir significativamente a área de reabsorção óssea dos osteoclastos de maneira dose-dependente, indicando que a CDP inibiu a atividade de reabsorção óssea induzida por RANKL (Fig. 3A e B). Em particular, a área de reabsorção óssea osteoclástica diminuiu para aproximadamente 6,3% após o tratamento com 10 µg/mL de CDP. Para entender melhor o impedimento da CDP na osteoclastogênese, medimos os níveis de transcrição de genes relacionados aos osteoclastos. Sem tratamento com CDP, a indução com RANKL promoveu a expressão dos genes NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 e Mmp9. Pelo contrário, a aplicação concomitante de CDP e RANKL diminuiu significativamente esses cinco genes (Fig. 3C e D).

3.4. CDP inibe a ativação de NFATc1 induzida por RANKL A coloração TRAcP revelou que o tratamento com CDP reduziu significativamente o aumento esperado no número de osteoclastos maduros após estimulação de RANKL por 3-7 dias (Fig. 4A e B). Além disso, investigamos se o tratamento com CDP pode efetivamente prejudicar a diferenciação de osteoclastos inibindo a expressão de NFATc1. Os resultados mostraram que o NFATc1 foi altamente expresso após estimulação de RANKL por 5 dias, o que foi significativamente inibido após o tratamento com CDP (Fig. 4C e D). Além disso, o tratamento com CDP suprimiu os níveis de expressão de CTSK, uma proteína necessária para a formação e função normais dos osteoclastos (Bossard et al., 1996) (Fig. 4E e F). Selecionamos uma representação pontual da estimulação de RANKL por 5 dias para investigar ainda mais o efeito do tratamento com 10 µg/mL de CDP na translocação de NFATc1. Como esperado, o tratamento com CDP inibiu significativamente a translocação nuclear de NFATc1 induzida por RANKL (Fig. 4G e H).

Fig. 4. CDP suprime a ativação de NFATc1 induzida por RANKL. (A) Os BMMs foram semeados em uma placa de 6-poço e estimulados com RANKL e M-CSF na presença de CDP (0, 5 e 10 µg/mL) para os dias indicados. Imagens representativas mostrando células multinucleadas TRAcP-positivas. Ampliação, ×100. Barras de escala {{10}} μm. (B) Quantificação de células multinucleadas positivas para TRAcP (núcleos maiores ou iguais a 3). (CF) Análise de Western blot das expressões das proteínas NFATc1 e CTSK, em BMMs, estimuladas com M CSF e RANKL por 3-7 dias na presença de CDP. (G) Os BMMs foram tratados com 10 ug/mL de CDP e estimulados por M-CSF e RANKL por 5 dias, depois imunocorados com NFATc1 (verde) e DAPI (azul) e observados usando um microscópio confocal. Ampliação, ×200. Barras de escala=20 μm. (H) A intensidade de fluorescência foi analisada usando Image-Pro Plus. Os valores são expressos como médias ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" vs.="" grupo="" controle;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" vs.="" grupo="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" inibe="" a="" ativação="" induzida="" por="" rankl="" das="" vias="" de="" sinalização="" de="" nf-κb="" e="" mapks="" para="" elucidar="" os="" mecanismos="" envolvidos="" na="" inibição="" da="" diferenciação="" de="" osteoclastos="" induzida="" por="" cdp,="" examinamos="" o="" impacto="" do="" tratamento="" com="" cdp="" nas="" vias="" de="" nf-κb="" e="" mapks.="" os="" resultados="" revelaram="" que="" o="" tratamento="" com="" cdp="" teve="" efeitos="" supressores="" na="" degradação="" de="" iκb="" e="" na="" fosforilação="" de="" p65="" de="" maneira="" dose-dependente="" (fig.="" 5a="" e="" b).="" a="" fosforilação="" de="" três="" membros="" da="" família="" mapks,="" especificamente="" quinase="" regulada="" por="" sinal="" extracelular="" (erk),="" quinase="" n-terminal="" c-jun="" (jnk)="" e="" p38="" foram="" reguladas="">

Discussão

A osteoporose é uma doença óssea comum e degenerativa. Atualmente, existem muitos fármacos de síntese química usados ​​em tratamentos clínicos para osteoporose, como estrogênio e bisfosfonatos. No entanto, o uso a longo prazo desses medicamentos enfraquecerá gradualmente a eficácia clínica e até causará muitos efeitos colaterais graves, incluindo aumento do risco de câncer de ovário, mama e endométrio e osteonecrose da mandíbula (Beral, 2003 ; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). Enquanto neste estudo, selecionamos o CDP, um componente eficaz extraído do CD, como agente terapêutico e demonstramos que o CDP teve um efeito protetor contra a perda óssea em camundongos OVX e inibiu a formação e função de osteoclastos induzidos por RANKL. Enquanto isso, de acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa do "osso que governa o rim", a perda óssea é atribuída a deficiências renais. Como um alimento medicinal tonificante dos rins, o CD provou fornecer tratamento eficaz para a osteoporose (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li e Zhang, 2016). Assim, o CDP extraído desta erva natural é uma opção de droga melhor e mais segura. Atualmente, o modelo de camundongo OVX é um modelo clássico de perda óssea pós-menopausa em mulheres, investigando as causas da perda óssea e realizando intervenção (Wehrle et al., 2015). Assim, realizamos ooforectomia bilateral em camundongos fêmeas C57BL/6J para construir um modelo de osteoporose. Em estudos anteriores, as doses de CDP administradas aos animais foram de 50 a 200 mg/kg (dose baixa) e 1800 mg/kg (dose alta) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Aqui, a alta dose de CDP em camundongos foi de 600 mg/kg, que foi baseada na alta dosagem clínica de 30 g de CD em decocção; assim, é semelhante à prática clínica atual. Neste estudo, o tratamento com CDP inibiu significativamente o ganho de peso corporal induzido por OVX, que é um fenômeno comum observado em camundongos OVX (Davis et al., 2019). Ao usar a varredura de micro-TC e reconstrução 3D, descobrimos que a OVX levou a uma redução notável na DMO, BV/TV, BS/TV e Tb.N, e um aumento na Tb.Sp, enquanto o tratamento com CDP reverteu todas essas alterações . Em particular, em comparação com o medicamento positivo, o CDP pode melhorar significativamente a DMO de camundongos OVX, que é um importante marcador de qualidade óssea e usado para refletir o grau de osteoporose (Fuggle et al., 2019), indicando que o CDP tem uma vantagem sobre a droga positiva na melhora da DMO. Além disso, os resultados histológicos indicaram que o tratamento com CDP pode reduzir a quantidade aumentada de osteoclastos TRAcP-positivos induzidos por OVX. Esses resultados sugerem que a administração de CDP efetivamente mitigou a perda óssea na osteoporose induzida por OVX, possivelmente por inibir a formação de osteoclastos. Consistente com os resultados acima, descobrimos que o CDP inibiu a formação e função osteoclástica induzida por RANKL de forma dependente da dose, enquanto o CDP teve pouco efeito na proliferação de células precursoras de osteoclastos induzida por M-CSF em nossos experimentos in vitro. A ligação de RANKL e RANK pode levar ao recrutamento de TRAF6 e à ativação subsequente de várias vias de sinalização a jusante, como NF-κB e MAPKs (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). A via de sinalização do NF-κB desempenha um papel importante na regulação da diferenciação dos osteoclastos, e o silenciamento de genes que codificam proteínas-chave nessa via pode levar ao desenvolvimento ósseo anormal (Leibbrandt & Penninger, 2008). Está bem estabelecido que o NF-κB está presente no citoplasma de células não estimuladas em um complexo com IκB, mas entra rapidamente no núcleo após estimulação de RANKL (Boyle et al., 2003). O IκB liberado é então rapidamente degradado, enquanto o NF-κB ativa a transcrição de genes específicos, consequentemente promovendo a diferenciação, maturação e apoptose dos osteoclastos (Abdelmagid et al., 2015). Neste estudo, os resultados mostraram que o tratamento com CDP suprimiu a ativação induzida por RANKL da via de sinalização NF-κB, como demonstrado pela inibição da degradação de IκB e fosforilação de p65 de forma dose-dependente, o que pode envolver em seu efeito anti-osteoclastogênico . Além disso, a via de sinalização de MAPKs, incluindo ERK, JNK e p38, está intimamente envolvida na osteoclastogênese induzida por RANKL (Li et al., 2002). Além disso, os inibidores dominantes de p38 e JNK podem prevenir a osteoclastogênese induzida por RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), enquanto o ERK desempenha um papel significativo na sobrevivência dos osteoclastos (Miyazaki et al., 2000). Está bem estabelecido que RANKL ativa a via de sinalização de MAPKs aumentando a fosforilação de ERK, JNK e p38 (Mizukami et al., 2002). Em nosso estudo, demonstramos que o CDP suprimiu a fosforilação induzida por RANKL de proteínas-chave na via de sinalização de MAPKs. Em conjunto, esses resultados indicam que a inibição da ativação das vias de sinalização de NF-κB e MAPKs contribui para o efeito inibitório da CDP contra a osteoclastogênese. A ativação das vias de sinalização de NF-κB e MAPKs promove a expressão de vários fatores chave de transcrição, como o oncogene celular fos, proteína ativadora 1 e NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, um membro importante da família NFAT, está envolvido na diferenciação de osteoclastos terminais como um regulador transcricional mestre (Asagiri et al., 2005). Foi relatado que as células-tronco embrionárias deficientes em NFATc1- não podem se diferenciar em osteoclastos sob a estimulação de RANKL e a expressão ectópica de NFATc1 faz com que as células precursoras sofram diferenciação ignorando a sinalização de RANKL, o que sugere que NFATc1 tem um papel crítico na diferenciação de osteoclastos (Takayanagi et al., 2002). Os resultados do nosso estudo mostraram o efeito supressor da CDP na expressão de NFATc1 e sua proteína CTSK seguinte. Curiosamente, observamos que o nível de expressão proteica de NFATc1 primeiro aumentou e depois diminuiu, atingindo o nível mais alto no 5º dia após a estimulação do RANKL. Isso foi consistente com os resultados de Baek et al. (2014), que observaram a degradação de NFATc1 induzida por M-CSF durante a osteoclastogênese em estágio avançado através da ubiquitinação de NFATc1 induzida por Cbl de uma maneira Src quinase-dependente. Os resultados do ensaio de imunofluorescência apoiaram consistentemente o efeito inibitório da CDP na ativação da transcrição de NFATc1. Além disso, genes específicos de osteoclastos, incluindo CTSK, Acp5, Mmp9 e Atp6v0d2, são todos regulados por NFATc1 diretamente (Y. Kim et al., 2005), foram suprimidos por CDP. Esses achados ilustram que o NFATc1 é um alvo do efeito inibitório do CDP nas vias de sinalização de NF-κB e MAPKs.

Conclusão

Em resumo, extraímos e purificamos o polissacarídeo ativo do CD e demonstramos que o CDP exibiu um efeito protetor na osteoporose induzida por OVX e melhorou a perda óssea ao reprimir a atividade e a função dos osteoclastos. Além disso, o CDP pode inibir a diferenciação e função de osteoclastos induzida por RANKL, interferindo nas vias de sinalização de NF-κB e MAPKs e, consequentemente, afetando a ativação de NFATc1 a jusante. Em conclusão, nossos achados fornecem a base para a expansão e aplicação da CDP no tratamento da osteoporose.

Este artigo vem das listas de conteúdo disponíveis na página inicial da revista ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff