Caracterizado por um declínio nas funções fisiológicas em sistemas de órgãos individuais

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RESUMO

O chá preto é a bebida de chá mais consumida no mundo e tem sido consistentemente relatado como possuindo benefícios antienvelhecimento. No entanto, se as teaflavinas, um tipo de fitoquímicos característicos nos extratos de chá preto, estão envolvidas na regulação do envelhecimento e da vida útil dos consumidores permanece em grande parte desconhecida. Neste estudo, mostramos que as teaflavinas desempenham um papel benéfico na prevenção de vazamento intestinal e disbiose, retardando assim o envelhecimento em Drosophila. Mecanicamente, as teaflavinas regulam a montagem condensada de Imd para governar negativamente a superativação de sinais de Imd nos intestinos da mosca da fruta. Além disso, as teaflavinas previnem a colite induzida por DSS em camundongos, sugerindo que as teaflavinas desempenham um papel na modulação da integridade intestinal. No geral, nosso estudo revela um mecanismo molecular pelo qual as teaflavinas regulam a homeostase intestinal, provavelmente através do controle da coalescência de Imd.

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INTRODUÇÃO

O envelhecimento, caracterizado por um declínio nas funções fisiológicas em sistemas de órgãos individuais e um risco crescente de doença e morte, envolve o acúmulo de danos a moléculas, células e tecidos (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet al., 2017). A identificação de materiais funcionais ou químicos que previnem a deterioração biológica para retardar o processo de envelhecimento e prolongar a vida é, sem dúvida, fundamental (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al.,2017). Estudos anteriores relataram que o chá preto, o chá mais consumido no mundo, possui atividades significativas que retardam o envelhecimento (Cameron et al.,2008; Fei et al.,2017; Kumar e Rizvi, 2017; Naumovski et al.,2019 ; Peng et al., 2009; Xiao et al., 2020). A suplementação dietética com os extratos de chá preto estende eficientemente a vida útil de animais experimentais, como vermes (Feet al., 2017), moscas da fruta (Peng et al., 2009; Site al., 2011), camundongos (Site al., 2011). ; Xiao et al., 2020) e ratos (Kumar e Rizvi, 2017).

É bem conhecido que os extratos de chá preto contêm principalmente dois tipos de fitoquímicos, a saber, catequinas e teaflavinas (TFs) (Cameron et al.,2008; Kondo et al.,2019; Li et al.,2013), sendo este último são produzidos a partir de catequinas por polifenol oxidase endógena e peroxidase durante o processo de oxidação na produção de chá preto (Li et al., 2013). Uma série de estudos identificou o papel antienvelhecimento das catequinas, melhorando o estresse oxidativo e a inflamação associada à idade e reduzindo o dano tecidual (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Waaner et al., 2015). No entanto, os estudos funcionais sobre as contribuições dos FTs para o envelhecimento ficaram muito atrás dos das catequinas, porque é difícil extrair quantidades suficientes de FTs das folhas de chá preto para estudos médicos (Takemoto e Takemoto, 2018). Recentemente, vários métodos biossintéticos foram desenvolvidos para a produção em massa de TFs (Takemoto e Takemoto, 2018), tornando possível explorar os efeitos biológicos exatos dos TFs e os mecanismos reguladores subjacentes.

Recentemente, conjuntos crescentes de dados destacaram os papéis centrais dos intestinos no envelhecimento e na modulação da vida útil (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard e Weinkove, 2018; Rothenberg e Zhang, 2019; Salazar et al. ,2018). O epitélio intestinal, que atua como uma barreira seletiva, permite a absorção de nutrientes, íons e água e limita o contato do hospedeiro com entidades nocivas, incluindo microrganismos, antígenos alimentares e toxinas ambientais (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Como um tecido de alta rotatividade em indivíduos, o trato intestinal fornece o melhor ambiente de vida para micro-organismos simbióticos, incluindo condições anaeróbicas naturais, nutrientes abundantes e temperatura e pH adequados.

Figura 1. As teaflavinas prolongam a vida útil da Drosophila e aumentam a capacidade de escalada

(A e B) As moscas da fruta fêmeas foram cultivadas com alimentos padrão que foram suplementados com 1 mg/ml ou 2,5 mg/mL de teaflavinas (TFs) ou sem TFs como basal. As moscas foram transferidas para frascos frescos contendo novos meios a cada dois dias, e moscas mortas pontuaram ao longo da vida adulta, curvas de sobrevivência (A) e longevidade média (B) de moscas fêmeas foram analisadas e mostradas.

(Cand D) As fêmeas w18 foram alimentadas com alimentos padrão de Drosophila (referido Basal) ou com alimentos suplementados com 1mg/ml ou 2,5mg/ETFs, respectivamente. Seis grupos independentes de moscas nas idades indicadas (10 dias, 30 dias, 40 dias e 50 dias, respectivamente) foram submetidos aos ensaios de alimentação com café(C) e Fluoresceína (D). valor, formando nichos ocupados por espécies bacterianas específicas no corpo (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Enquanto isso, esses microrganismos simbióticos e seus metabólitos também afetam direta ou indiretamente o processamento de nutrientes; digestão e absorção; equilíbrio energético; função imune; desenvolvimento e maturação gastrointestinais; e muitas outras atividades fisiológicas importantes (Bonfini et al.,2016; Broderick,2016; Maynard e VVeinkove,2018; Nicholson et al., 2012). A relação mutuamente benéfica entre os dois simbiontes pode manter a estabilidade e o equilíbrio dinâmico do microecossistema intestinal Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).

cistanche pode anti-envelhecimento

Uma série de estudos mostrou que a resposta imune inata é fundamental para manter a homeostase da microbiota intestinal e é conservada de invertebrados para vertebrados (Guillouet al., 2016; Guo et al.,2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar et al., 2010). Em Drosophila, duas principais vias de sinalização, a saber, as vias Toll e imunodeficiência (Imd), estão envolvidas nas respostas imunes inatas (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Notavelmente, a via de Drosophila Toll compartilha semelhanças com as vias do receptor de interleucina-1 de mamíferos (IL-1R) e vias do receptor semelhante a Toll (TLR) dependente de MyD88-, enquanto a via Imd é semelhante à via do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) e à via TLR dependente de TRIF em mamíferos (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Essas duas vias controlam a expressão de peptídeos antimicrobianos (AMPs) por meio da ativação de fatores de transcrição NF-KB (Imler,2014; Myllymaki et al.,2014; Valanne et al.,2011).bioflavonóidesA via de sinalização Imd é normalmente ativada por infecção bacteriana Gram-negativa e resulta na expressão de outro conjunto de AMPs, como Attacin, Cecropin e Diptericin (Kleino e Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). A expressão desses AMPs requer o receptor da proteína de reconhecimento de peptidoglicano (PGRP)-LC na via Imd e a clivagem dependente de sinal e translocação nuclear de Relish, um fator de transcrição da família NF-kB (Kleino e Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Um estudo recente mostrou que a formação de amiloide é necessária para a ativação da via Drosophila Imd após o reconhecimento de peptidoglicanos bacterianos (Kleino et al., 2017). No entanto, se este condensado de Imd está envolvido em outros processos biológicos, como manutenção da homeostase intestinal e regulação do envelhecimento, permanece em grande parte desconhecido.

No presente estudo, utilizamos moscas da fruta e camundongos como modelos animais para investigar os papéis dos FTs no controle da integridade intestinal e do envelhecimento. Mostramos que os TFs retardam a proliferação excessiva de células-tronco intestinais no início da idade, protegem contra a disbiose do microbioma intestinal e previnem a ativação da via de sinalização Imd, prolongando assim a vida útil em Drosophila. Outros estudos mecanísticos indicaram que os TFs contribuem negativamente para a sinalização de Imd pode ser através do bloqueio da condensação de Imd em vez de sua ubiquitinação. Além disso, descobrimos que os TFs são altamente eficazes na prevenção da colite induzida por DSS em camundongos. Em conjunto, nossos achados revelam um papel potencial dos TFs na modulação do comportamento do Imd, o que pode ser o fator chave em suas contribuições positivas para a homeostase intestinal e extensão da vida útil.

RESULTADOS

A suplementação dietética de teaflavinas prolonga a vida útil da Drosophila

Para examinar se as teaflavinas (TFs) afetam o envelhecimento e a expectativa de vida em Drosophila, criamos moscas w'118 fêmeas com alimentos de criação padrão que foram suplementados com TFs de 1mg/mL ou 2,5mg/ml e realizamos ensaios de expectativa de vida conforme descrito anteriormente (Ji et al. ., 2019). Moscas alimentadas com dieta suplementada com igual volume de solvente TFs (H2O) foram consideradas controles. Conforme mostrado na Figura 1A, a adição dietética de uma concentração relativamente baixa de TFs (1 mg/mL) prolongou ligeiramente a vida útil da mosca da fruta e uma alta concentração de TFs (2,5 mg/mL) teve um efeito significativamente positivo na extensão da vida útil. Notavelmente, a absorção a longo prazo de altas concentrações de TFs (2,5 mg/mL) resultou em aproximadamente 8 dias de elevação na expectativa de vida média de moscas fêmeas (Figura 1B), sugerindo um papel benéfico de TFsina na regulação da longevidade em Drosophila. Resultados semelhantes foram obtidos quando testamos os efeitos potenciais de TFs adicionais na vida útil de moscas macho w'*'''8 (Figuras S1A e S1B).

Figura 2. As teaflavinas previnem a disfunção intestinal com início na idade e a disbiose da microbiota em Drosophila

(A e B) A perda de integridade intestinal foi avaliada pelo Smurftest nas idades de 10 dias, 30 dias, 40 dias e 50 dias de fêmeas w18 adultas. Exemplos de não-Smurfs e Smurfs foram mostrados em (A). As porcentagens de Smurfs nos diferentes grupos indicados foram analisadas e apresentadas em (B).

(C) Abundâncias bacterianas salvas por qPCR do gene 16S rRNA em arquivos w18 femininos de diferentes grupos indicados foram analisadas e mostradas.

(DF) Foi realizado o sequenciamento do gene 16S rRNA bacteriano comensal. As proporções dos táxons bacterianos (D), um mapa de calor dos principais táxons microbianos (F) e a abundância relativa de Gammaproteobacteria (F) foram analisadas e apresentadas.

Figura 2. Continuação

(G e H) Os intestinos foram dissecados das moscas fêmeas indicadas alimentadas com 2,5 mg/ml de TFs ou sem TFs como controle aos 10 dias e 40 dias de idade. Imagens de lâminas de intestino médio foram capturadas por microscopia de fluorescência para sinais GFP (G). A análise estatística mostrando as porcentagens de células GFP-positivas é mostrada em (H).

(I) As vísceras das moscas fêmeas indicadas foram coletadas e submetidas a ensaios de imunocoloração utilizando anticorpos contra Histona 3(pH3) fosforilada. Em B, C, H e, os dados são analisados ​​pelo teste de Student bicaudal e são mostrados como média ± SEM.NS, não significativo,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Sabe-se que os ETFs têm um sabor amargo, e os alimentos amargos geralmente são evitados por ambos os consumidores, incluindo moscas da fruta e mamíferos (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Em seguida, procuramos elucidar se os FTs podem afetar a ingestão de alimentos de Drosophila, porque estudos anteriores provaram que a restrição alimentar leva a uma vida útil prolongada tanto em vertebrados quanto em invertebrados (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020). Para isso, primeiro realizamos o ensaio de café, uma abordagem amplamente utilizada para medir de forma direta e precisa a taxa de alimentação por meio de um alimentador capilar contendo um meio líquido, conforme descrito anteriormente (Ja et al., 2007). Conforme mostrado nas Figuras 1C e S1C, a suplementação dietética de TFs (1 mg/mL e 2,5 mg/mL, respectivamente) pouco alterou o consumo alimentar das moscas testadas. Para confirmar ainda mais isso, utilizamos a Fluoresceína como marcador de alimentos (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) e realizamos um ensaio de alimentação natural (Danilov et al., 2015). Conforme mostrado nas Figuras 1D e S1D, não observamos nenhuma correlação entre a suplementação de TFs e os níveis de ingestão alimentar. Em conjunto, nossos resultados sugeriram que os papéis benéficos dos TFs no prolongamento da vida podem não ser devidos à restrição alimentar em Drosophila.

TFs adicionais são dispensáveis ​​para impactar a homeostase energética da Drosophila

Tem sido sugerido que os polifenóis do chá preto exercem um efeito positivo na prevenção da obesidade, inibindo a digestão, absorção e ingestão de lipídios e sacarídeos, reduzindo assim a ingestão de calorias (Cameron et al., 2008). Em seguida, procuramos elucidar se a extensão da vida útil de LDrosophila regulada por TFs é devido a alterações na absorção de nutrientes e armazenamento de energia. Para fazer isso, primeiro examinamos os níveis de triacilglicerídeos (TAG), um dos metabólitos lipídicos mais comumente detectados (Tennessen et al., 2014), em moscas fêmeas ao longo de toda a sua vida, conforme descrito anteriormente (Fan et al., 2017).comprar cistacheConforme mostrado na Figura 1E, o tratamento de TFs dificilmente impactou as abundâncias gerais de TAG em diferentes faixas etárias. Quando detectamos ainda o conteúdo de glicogênio e quantificamos os carboidratos circulantes (glicose e trealose) pelo kit Hexokinase (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), os resultados mostraram que não houve alterações óbvias entre as amostras com ou sem tratamento de TFs (Figuras 1F-1H). De nota, resultados consistentes foram obtidos quando examinamos fenótipos metabólicos utilizando macho w118 como modelos animais (Figuras S1E-S1H). Coletivamente, esses dados sugeriram que a suplementação dietética de FTs é dispensável para a regulação da homeostase de carboidratos e energia ao longo da vida da Drosophila.

Investigamos ainda a cinética da senescência natural de Drosophila sob intervenção dietética de FTs, realizando testes de geotaxia negativa iterativa rápida (RING) conforme descrito anteriormente (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Conforme mostrado nas Figuras 1l,1J, S1l e S1J, os índices de escalada de idade (40 dias) w1118 (tanto mulheres quanto homens) em grupos de suplementação de TFs foram acentuadamente melhorados (um aumento de quase 12% em mulheres e quase 18% de elevação em homens ) em comparação com grupos de controle, sugerindo que os TFs potencialmente melhoram a escalada e as atividades locomotoras de Drosophila.

As teaflavinas previnem o vazamento intestinal no início da idade e a disbiose da microbiota

Estudos anteriores mostraram que as atividades locomotoras e a expectativa de vida da mosca-das-frutas estão altamente relacionadas à condição de saúde do hospedeiro, como sexo, dieta, idade e genótipo (Caruso et al., 2013; Heintz e Mair, 2014). Recentemente, várias linhas de evidência provaram que a preservação da homeostase da sinalização intestinal de Imd melhora a integridade intestinal, prevenindo a proliferação excessiva de ISC e células precursoras e retardando a disfunção epitelial intestinal com início na idade, o que, por sua vez, contribui positivamente para a saúde do organismo (Clark et al. , 2015; Guo et al., 2014). Em Drosophila, uma vida útil reduzida está intimamente associada à disfunção da barreira epitelial intestinal, e o desenvolvimento da integridade dessa barreira durante o envelhecimento resulta em extensão da vida útil (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Assim, buscou-se determinar se os FT alteram a integridade do intestino por meio do ensaio Smurf, método já descrito anteriormente (Clark et al.,2015; Rera et al.,2011). Conforme mostrado na Figura 2A, as moscas da fruta testadas nas quais os corantes azuis foram restritos ao trato digestivo foram referidos como não-Smurf (painel esquerdo na Figura 2A). Se os corantes azuis fossem observados

Figura 3. Continuação

(EG) Os intestinos foram isolados de limas w1118 fêmeas alimentadas com 2,5 mg/ml de TFs ou sem TFs como basal aos 10 dias, 30 dias, 40 dias e 50 dias de idade, respectivamente. O RNA total foi extraído e submetido a análises de aRT-PCR. Os níveis de expressão de mRNA de diptericina (F), atacina (F) e cecropina A1(G) foram analisados ​​e mostrados. No GE, os dados são analisados ​​pelo teste t de Student bicaudal e apresentados como média ± SEM.NS, não significativo, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

vazando das entranhas para o abdômen, os hospedeiros foram contados como Smurf (painel direito na Figura 2A). Consistente com achados anteriores (Clark et al.,2015), as proporções de Smurf aumentaram gradualmente durante o envelhecimento (Figura 2B). Curiosamente, as proporções de adultos Smurfs diminuíram bastante nos grupos alimentados com TFs em comparação com os controles pareados por idade em ambas as mulheres (de 8,2% para 3,7%, de 19,4% para 15,6% e de 35,4% para 27,1% para os grupos com idades de 30 dias, 40 dias e 50 dias, respectivamente, Figura 2B) e adultos do sexo masculino (de 2,7% a 0,9% , de 6,9% a 0,9% e de 8,3% a 2,7% aos 30 anos dias, 40 dias e 50 dias, respectivamente, Figura S2A), indicando que os TFs podem prevenir a disfunção da barreira intestinal em moscas de fruta envelhecidas. Digno de nota, observamos maiores diminuições das porcentagens de Smurfs em homens (reduzidas em quase 65,8 por cento , 86,9 por cento e 67,4 por cento nas idades de 30 dias, 40 dias e 50 dias, respectivamente) do que aqueles em idade -fêmeas pareadas (reduzidas em quase 54,1%, 19,5% e 23,3% nas idades de 30 dias, 40 dias e 50 dias, respectivamente), implicando que os TFs podem desempenhar um papel melhor na redução do vazamento intestinal em moscas machos.

Estudos anteriores sugeriram que a disfunção da barreira intestinal com início na idade está frequentemente correlacionada com a disbiose da microbiota intestinal (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Assim, examinamos a composição bacteriana comensal intestinal após a suplementação com TFs. Primeiro utilizamos primers universais e realizamos experimentos de PCR quantitativos para quantificar os níveis do gene 16S rRNA bacteriano. Conforme mostrado na Figura 2C, em cortes envelhecidos, a população bacteriana total dos grupos de intervenção de TFs mostrou uma redução impressionante (quase 45 por cento -55 por cento) em comparação com os controles, sugerindo que a suplementação de TFs provavelmente previne a expansão da microbiota durante o envelhecimento . Em seguida, realizamos metagenômica para examinar detalhadamente as alterações na comunidade microbiana intestinal causadas pela suplementação dietética com TFs. Conforme mostrado nas Figuras 2D-2F, a proporção de Gammaproteobacteria, cuja expansão foi encontrada intimamente associada à falha da barreira intestinal (Clark et al., 2015), foi obviamente diminuída pela suplementação de TFs em intestinos envelhecidos( uma redução de quase 7 por cento), o que implica que os TFs contribuem positivamente para a homeostase da microbiota intestinal durante o envelhecimento em Drosophila.

As teaflavinas melhoram a homeostase proliferativa intestinal em Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), em que as células-tronco intestinais (ISCs) e células progenitoras foram marcadas com GFP. Conforme mostrado nas Figuras 2G e 2H, o número de células GFP-positivas nos grupos de intervenção de TFs na idade de 40 dias (20 intestinos foram contados) foi muito menor (quase 29,7 por cento) do que nos controles pareados por idade (quase 47,6 por cento e 19 tripas foram contadas), sugerindo que os TFs podem inibir a superproliferação de ISCs no início da idade. Além disso, realizamos experimentos de imunocoloração utilizando anticorpos contra Phospho-Histone 3(pH3), um marcador específico para células mitóticas em tecidos intestinais. Observamos menos células pH{15}}positivas nos intestinos de adultos idosos suplementados com TFs (o número médio foi de 20,6) do que nos controles (o número médio foi de 39,5, Figura 2). Em conjunto, nossos resultados sugerem que a suplementação dietética com TFs melhora a homeostase proliferativa intestinal e previne a displasia da microbiota com início na idade, retardando assim o envelhecimento em Drosophila.

As teaflavinas modulam negativamente os sinais IMD intestinais

Para explorar os mecanismos moleculares subjacentes pelos quais os TFs contribuem positivamente para a homeostase intestinal de Drosophila, realizamos análise de RNA-seq utilizando amostras intestinais pareadas por idade de mulheres adultas w1118 tratadas com ou sem TFs. Análises de fragmentos por quilobase por milhão (FPKM) sugeriram que os padrões gerais de expressão gênica eram semelhantes entre os dois grupos experimentais (Figura 3A). A análise de expressão diferencial adicional, no entanto, identificou um total de 229 genes expressos diferencialmente, dos quais 99 foram regulados positivamente e 126 foram regulados negativamente (Figura 3B). Curiosamente, a análise da ontologia gênica desses genes revelou que a via de resposta imune foi altamente alterada pela suplementação dietética com TFs (Figura 3C).

Em Drosophila, as vias de sinalização imune inata demonstraram desempenhar um papel dominante na regulação da homeostase intestinal e longevidade (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Em seguida, nos concentramos em examinar os padrões de expressão dos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a jusante dos sinais imunológicos inatos. Como mostrado

Figura 4. Continuação

(D) As proteínas Imd purificadas foram incubadas com várias concentrações de TFs (50 uM, 100 uM e 200 uM, respectivamente) à temperatura ambiente durante 5 min. As amostras foram então submetidas a análise de espectro de emissão de fluorescência usando os comprimentos de onda indicados (excitação a 430 nm, emissão de 450 nm a 550 nm com uma largura de fenda de 5 nm). Uma amostra sem TFs foi usada como controle de linha de base.

（E and F）Lysates of guts from NP11>As moscas Myc-Imd foram preparadas e incubadas com TFs（100μM） à temperatura ambiente por 30 min. Os ensaios SDD-AGE (painel superior em E) e SDS-PAGE (painel inferior em E) foram realizados para analisar agregados de proteína Imd. A tubulina foi usada como controle de carga.cistanchA análise densitometria foi realizada para quantificar os condensados ​​de Imd em diferentes amostras, e os resultados foram apresentados em (F). (G) Um cromatograma representativo da amostra de TFs.

（H e I） As proteínas Flag-Imd purificadas foram incubadas com TFs, TF1, TF2a, TF2b ou TF3（100 μM para cada amostra）ou com um volume igual de tampão （controle）à temperatura ambiente por 30 min, conforme indicado. As amostras foram então submetidas a ensaios SDD-AGE (painel superior em H) e SDS-PAGE (painel inferior em H) para determinar os padrões de agregação de Imd. A análise densitometria para quantificar os condensados ​​de Imd em diferentes amostras foi realizada e mostrada em (). Em C, F e I, os dados são analisados ​​pelo teste de Student bicaudal e mostrados como média ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

na Figura 3D, genes AMP governados pela via de imunodeficiência (Imd), incluindo diptericina A (DptA), dip-tericina B (DptB), atacina A (AttA), cecropina A1 (CecA1), cecropina A2 (CecA2) e cecropina C (Cece), foram significativamente diminuídos (em 39,4 por cento, 72,3 por cento, 10,5 por cento,86,5 por cento, 99,8 por cento e 36,1 por cento, respectivamente) nos grupos tratados com TFs em comparação com os grupos de controle. Para confirmar ainda mais os resultados obtidos a partir da análise de RNA-seq, realizamos uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (gRT-PCR) para quantificar os níveis de expressão relativa de genes AMP relacionados a Imd em amostras intestinais de Drosophila obtidas em quatro diferentes faixas etárias incluindo 10 dias, 30 dias, 40 dias e 50 dias. Conforme mostrado nas Figuras 3E-3G, os níveis de expressão de mRNA de certos genes, incluindo diptericina, atacina e cecropina A1, foram significativamente diminuídos (em quase 35,9 por cento -66,6 por cento ) em TFs tratados tripas envelhecidas. Coletivamente, nossos dados revelaram que os TFs potencialmente antagonizaram a ativação da via de sinalização Imd em células intestinais de Drosophila durante o envelhecimento.

As teaflavinas são dispensáveis ​​para regulação transcricional da via Imd ou ubiquitinação de Imd

Procuramos examinar a associação entre TFs e Imd e realizamos o ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR) conforme descrito anteriormente (Lan et al., 2020). Conforme mostrado na Figura 4A. Os TFs exibiram afinidade de ligação moderada com a proteína Imd purificada a uma constante Kp estimada de 8,078 uM. Em seguida, tendemos a determinar como os TFs controlam a via de sinalização intestinal de Imd. Com base nos resultados da análise do transcriptoma dos dados de RNA-seq, descobrimos que os níveis de expressão dos principais fatores reguladores na via de sinalização Imd, como PGRP-LC, Imd e Relish, dificilmente foram alterados pelo tratamento com TFs (Figura S3A ). Além disso, coletamos amostras intestinais de moscas que foram submetidas à suplementação dietética com ou sem TFs em várias idades e realizamos experimentos de qRT-PCR para detectar especificamente os padrões de expressão desses genes. Conforme mostrado na Figura S3B, os níveis de mRNA de certos genes, incluindo effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny e diap2, foram semelhantes entre os grupos de controle e grupos de intervenção de TFs, sugerindo que os TFs não estão envolvidos na regulação dos sinais Imd no nível transcricional.

Em seguida, examinamos os perfis de ubiquitinação de Imd porque estudos anteriores sugeriram que a ubiguitinação de Imd é essencial para a transdução de sinal a jusante na via Imd (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Primeiro, realizamos um ensaio de deslocamento de E1 in vitro e descobrimos que o tratamento com TFs não tem influência aparente nas reações enzimáticas de E1 e ubiquitina para formar E1/Ub conjugado (Figura S4A). Além disso, transfectamos células S2 de Drosophila com plasmídeos expressando Imd marcado com Flag juntamente com Ub marcado com HA e depois tratamos as células com ou sem TFs. Outros ensaios de ubiquitinação sugeriram que a suplementação de TFs mal afetou os níveis de Imd ubiquitinado em células cultivadas (Figuras S4B e S4C). Para determinar as relações entre TFs e ubiquitinação de Imd in vivo, utilizamos a mosca transgênica P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (referido como NP1* s > Myc-Imd), em que uma proteína Imd marcada com Myc foi altamente expressa em células intestinais (Figura S4D). Nossos experimentos de ubiquitinação mostraram que a suplementação dietética com TFs foi dispensável para modular a ubiquitinação de Imd nos tecidos intestinais (Figuras S4D e S4E). Em conjunto, nossos resultados indicaram que os TFs governam negativamente os sinais de Drosophila Imd por não afetarem o padrão de ubiquitinação de Imd.

Theaflavins impedem a montagem do condensado Imd

Um estudo recente sugeriu que a agregação de Imd é essencial para a ativação de genes a jusante na via Imd (Kleino et al., 2017). Procurou-se, então, examinar se os TFs regulam o processo de

Figura 5. Continuação

(F e G)Mulheres w18 (referidos como imd plus / plus ), mutantes imd' heterozigotos e homozigotos (referidos como imd plus /- e imd-/-, respectivamente) foram criados com alimentos padrão de Drosophila (referidos como Basal) ou suplementação dietética com 2,5 mg/mL (referidos como TFs) e, em seguida, foram submetidos ao ensaio de tempo de vida Curva de sobrevivência (F) e longevidade média (G) foram analisadas e mostradas.

Em e F, o teste Log Rank foi utilizado para análise estatística. Em BE, e, o teste t de Student bicaudal foi usado para análise estatística, e os dados são sh como média ± SEM. NS, não significativo, *p<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Formação de agregados Imd. Primeiro, purificamos proteínas Imd marcadas com Myc de células S2 cultivadas e incubamos as proteínas com diferentes concentrações de TFs (Figura 4B). Curiosamente, descobrimos que os TFs impediram marcadamente a agregação de Imd (reduzida em 81,7 por cento -89,7 por cento, Figuras 4B e 4C), conforme sugerido por nossos ensaios de eletroforese em gel de agarose detergente semidesnaturante (SDD-AGE). Para confirmar esta descoberta, realizamos ainda ensaios de ligação de tioflavina-T e obtivemos resultados consistentes (Figura 4D). Por último, criamos moscas transgênicas NP1ts > Myc-Imd que foram submetidas à suplementação dietética com ou sem TFs e coletamos amostras de intestino de adultos idosos. Os experimentos SDD-AGE sugeriram que a agregação de Imd foi fortemente regulada negativamente por TFs em células intestinais (diminuída em 16,7 por cento -22 por cento, Figuras 4E e 4F).

Para determinar como os TFs contribuem para controlar a montagem do condensado Imd, submetemos os TFs à HPLCanal-ysis e descobrimos que eles continham principalmente quatro tipos de monômeros (Figura 4G), a saber, teaflavina (TF1), teaflavina 3-O-galato ( TF2a), teaflavina 3'-O-galato (TF2b) e teaflavina 3,3'-di-O-galato (TF3), que foram consistentes com relatórios anteriores (Li et al., 2013; Takemoto e Takemoto, 2018) . Em seguida, incubamos cada um desses produtos químicos com Imdprotein purificada e realizamos experimentos SDD-AGE. Conforme mostrado nas Figuras 4H e 4l, o tratamento de todos esses monômeros de TF resultou em uma redução acentuada (em 59,5 por cento, 60,9 por cento, 58,4 por cento, 58,2 por cento e 55,8 por cento para TFs, TF1, TF2a, TF2b e TF3, respectivamente) em os níveis agregados de Imd. Coletivamente, nossos resultados sugerem que os TFs regulam negativamente a via de sinalização de Drosophila Imd, provavelmente controlando o comportamento dos condensados ​​de Imd.

As teaflavinas prolongam a vida útil da Drosophila de maneira dependente de IMD

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>mais) moscas. porque Relish é o principal fator de transcrição responsável pelas expressões do gene AMP a jusante de Imd (Myllymaki et al., 2014). Conforme mostrado nas Fiqures S5C e S5D. a adição dietética de TFs prolongou marcadamente a longevidade das moscas de controle, e essa extensão na vida útil foi significativamente evitada nas moscas Relish RNAi. Coletivamente, nossos dados indicaram que a suplementação dietética de TFs contribui positivamente para a expectativa de vida da Drosophila, provavelmente dependendo dos sinais intestinais de Imd.

Para ver se a extensão da vida útil por TF ainda ocorre em um fundo axênico, realizamos ensaios de vida útil usando fêmeas w1118 sob condições axênicas. Conforme mostrado nas Figuras S5E e S5F, a adição de diferentes concentrações de TFs (1 mg/mL e 2,5 mg/mL) pouco afetou as taxas de mortalidade e longevidade média de vida em adultos w18. Como as condições de criação axênica podem impedir em grande parte a microbiota abundante, restringindo assim os sinais Imd em cortes (Clarke al., 2015), nossos dados sugerem que os TFs prolongam a vida útil da Drosophila pode ser através da modulação dos sinais imunológicos inatos regulados pela microbiota intestinal.

Figura 6. As teaflavinas aliviam a colite induzida por DSS em camundongos CD-1

(A) O tratamento com TFs não afetou o consumo de água em vários grupos de camundongos CD-1.

(BD) A administração por gavagem de várias concentrações de TFs (1 mg/mL, 2,5 mg/mL e 5mg/mL, respectivamente) melhorou o encurtamento do cólon e o aumento do baço causados ​​por DSS em camundongos CD-1. Imagens representativas (B) e análises estatísticas do cólon (C) e baço (D) foram mostradas. (E) A administração de várias concentrações de TFs (1 mg/mL, 2,5 mg/ml e 5 mg/mL, respectivamente) preveniu o vazamento intestinal induzido por DSS em camundongos CD{10}}. (F e G) Os dois pontos foram coletados de grupos de camundongos indicados. O RNA total foi extraído e submetido a ensaios de qRT-PCR para detectar os níveis de expressão de mRNA de TNFa(F) e IL-6 (G).

(HL) Cólons de vários grupos de camundongos foram coletados longitudinalmente e submetidos a ensaios de coloração HE. As amostras foram examinadas por microscopia, e imagens representativas das amostras indicadas （HL） foram obtidas e mostradas. Barras de escala, 40 μm. (M-Q') Imagens SEM mostrando os microtricomas de dois pontos de diferentes amostras indicadas. Barras de escala, 50 um (MQ) e 4 um (M'-Q').

No GC, os dados são analisados ​​pelo teste de Student bicaudal e apresentados como média ± SEM.NS, não significativo, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

As teaflavinas aliviam a colite induzida por DSS em camundongos CD-1

Para investigar ainda mais o papel potencial dos TFs na manutenção da homeostase intestinal em mamíferos, camundongos CD-1 foram usados ​​para induzir colite por sulfato de dextrano de sódio (DSS). Os camundongos receberam intragástricamente diferentes concentrações de TFs (1 g/L, 2,5 g/L ou 5 a/L) ou água como controle por quatro semanas, seguido de tratamento com 2% de DSS em água potável por 7 dias. Para ver se os TFs afetam a quantidade de DSSa em diferentes grupos de camundongos, monitoramos o consumo de camundongos todos os dias. Como mostrado em Fiqure6A, o tratamento com TFs é dispensável para impactar o consumo de bebida em camundongos com colite induzida por DSS, camundongos tratados com DSS apresentaram síndrome de colite com diarreia e/ou hematoquezia, que foram prevenidas pelo tratamento com TFs dose-dependente (Figuras S6A-S6E).cistache AustráliaAlém disso, a intervenção com TFs resgatou a redução do comprimento do cólon causada pelo DSS e melhorou o aumento do baço (Figuras 6B-6D).

Em seguida, usamos dextrano-4000-FITC (FITC-DX) para examinar a função de barreira intestinal desses camundongos. Conforme mostrado na Figura 6E, camundongos dos grupos tratados com DSS mostraram uma alta concentração de FITC-DX em amostras de sangue, indicando vazamento intestinal nesses animais. No entanto, a intervenção com TFs impediu significativamente o transporte de FITC-DX dos órgãos digestivos para o sistema circulatório (reduzido em 56,1 por cento -77,5 por cento, Figura 6E). Notavelmente, a administração de TFs não alterou a permeabilidade intestinal de camundongos em condições normais (Figura S6F). Como a inflamação desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de colite do modelo de camundongo, realizamos ainda experimentos de qRT-PCR, mostrando que o tratamento com TFs regulou significativamente as expressões de IL-6 e TNF nos intestinos de camundongos tratados com DSS (Figuras 6F e 6G).

Para analisar ainda mais as alterações patológicas no cólon, realizamos ensaios de coloração de hematoxilina-eosina (HE). Conforme mostrado nas Figuras 6H-6L e S6G-S6J, o dano epitelial grave induzido por DSS foi acentuadamente melhorado pelo tratamento com TFs de maneira dose-dependente. As imagens de microscopia eletrônica de varredura dessas amostras intestinais forneceram resultados consistentes (Figuras 6M-6Q' e S6K-S6N'). Em conjunto, nossas descobertas indicaram que os TFs desempenham um papel benéfico na proteção da função da barreira intestinal em insetos e mamíferos.

DISCUSSÃO

Neste estudo, investigamos as funções fisiológicas dos TFs na modulação da homeostase intestinal e longevidade e os mecanismos moleculares subjacentes. Mostramos que a suplementação dietética com TFs contribui positivamente para a prevenção da disbiose da microbiota intestinal com início na idade e o retardo da disfunção epitelial intestinal, prolongando assim a vida útil da Drosophila. Nossos estudos mecanísticos in vitro e in vivo revelaram que os TFs provavelmente desempenham um papel negativo no controle da via de sinalização de Imd, bloqueando a coalescência de Imd. Além disso, descobrimos que a colite induzida por DSS pode ser aliviada eficientemente pela suplementação de TFs em camundongos CD-1. Nossos resultados suportam a noção de que os TFs contribuem vantajosamente para a homeostase intestinal em invertebrados e vertebrados.

Suplementação dietética com teaflavinas prolonga a vida útil da Drosophila

O consumo de chá é popular em todo o mundo e perde apenas para o consumo de água (Rothenberg e Zhang, 2019). Numerosos estudos se concentraram nas funções fisiológicas, muitas vezes por meio de abordagens experimentais e clínicas (Cameron et al.,2008; Niu et al.,2013; Peng et al.,2009; Rothenberg e Zhang.2019; Spindleret al.,2013; Takemoto e Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Tem sido amplamente demonstrado que o chá beneficia a saúde ao diminuir os níveis de lipídios e por meio de efeitos anti-obesidade, e os principais compostos funcionais do chá são as catequinas, especialmente galato de epigalocatequina (EGCG) (Abbas e Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Estudos anteriores também indicaram que o chá verde e o chá preto pode aumentar a vida útil das moscas da fruta (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), vermes (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) e ratos (Imran et al. .,2018; Niu etal.2013) e o principal mecanismo regulatório é a prevenção efetiva do estresse oxidativo por EGCG via modulação de ROSsinais.benefícios do cistache,No entanto, se os TFs, como os compostos "dourados" característicos do chá preto, desempenham um papel na regulação do envelhecimento e da vida útil, permanece em grande parte desconhecido. Este estudo fornece evidências convincentes que indicam que a intervenção de FTs é dispensável para impactar a ingestão de alimentos, e a absorção a longo prazo de FTs através da dieta prolonga significativamente a vida útil em moscas da fruta masculinas e femininas. Esses achados fornecem diretrizes para estudos adicionais sobre as funções dos TFs na longevidade dos mamíferos.

As teaflavinas melhoram a disbiose da microbiota do início da idade e promovem a homeostase intestinal Desequilíbrio progressivo da homeostase proliferativa e da capacidade regenerativa é uma marca registrada do envelhecimento e das doenças do início da idade (Clark et al., 2015; Heintz e Mair, 2014; Maynard e Weinkove, 2018; Rera e outros 2012). A inflamação crônica está associada à perda da homeostase e ao aumento da incidência de câncer em organismos envelhecidos (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Isso é particularmente significativo em epitélios de barreira, como o epitélio intestinal (Guo et al., 2014; Maynard e Weinkove, 2018). Com um modelo para o desenvolvimento de displasia relacionada à idade no intestino envelhecido, demonstramos que melhorar as interações hospedeiro-comensais no epitélio da barreira do envelhecimento pode promover a saúde e a vida útil. Usamos uma série de abordagens não invasivas para avaliar a função intestinal e a dinâmica da microbiota durante o envelhecimento. Primeiro, o ensaio Smurf indicou um papel positivo dos TFs na regulação da disfunção da barreira epitelial durante o envelhecimento. Então, o ensaio de imunocoloração usando várias moscas transgênicas revelou que os TFs retardaram a proliferação excessiva de ISCs e o turnover de células diferenciadas. Finalmente, o sequenciamento do microbioma sugeriu que os TFs regulam negativamente a expansão da microflora comensal intestinal com início na idade. Esses resultados indicaram fortemente que os TFs desempenham um papel fundamental no retardo do processo de envelhecimento do hospedeiro, mantendo a homeostase intestinal.

As teaflavinas aliviam as respostas imunes excessivas no intestino regulando negativamente a sinalização Imd

Tem sido sugerido que o delicado equilíbrio entre a função imune intestinal e a microbiota deve ser mantido para garantir a homeostase a longo prazo dos epitélios de barreira (Guo et al., 2014; Maynard e Weinkove, 2018). Estudos anteriores também mostraram que a inflamação crônica excessiva no intestino está associada à disfunção relacionada à idade no epitélio de barreira e é uma marca registrada do envelhecimento (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . Assim, manter uma população comensal saudável preservando a homeostase imune inata em tais epitélios é uma abordagem promissora para promover a saúde e a longevidade (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Explorar os mecanismos moleculares por quais TFs retardam o envelhecimento, realizamos análise de RNA-seq usando intestinos dissecados com ou sem tratamento com TFs. Nossos dados sugeriram que o grupo de genes altamente expresso nos intestinos de moscas-das-frutas controle em comparação com o de animais tratados com TFs foi enriquecido com genes classificados como genes de "resposta imune". Análises bioinformáticas adicionais e ensaios get-PCR revelaram que a expressão de genes AMP relacionados a Imd foi drasticamente inibida pela adição de TFs na dieta. Os resultados dos experimentos com camundongos CD-1 utilizando DSS para induzir respostas imunes anormais nos intestinos confirmaram ainda mais a noção de que os TFs funcionam como protetores contra a inflamação intestinal.

As teaflavinas suprimem os sinais determinando a montagem amiloide de Imd

Como os TFs regulam negativamente a via de sinalização Imd? Com base nos resultados da análise do transcriptoma, descobrimos que os TFs são dispensáveis ​​para a regulação transcricional dos principais fatores na via de sinalização Imd. De interesse, observamos a aparente afinidade de ligação dos TFs com a proteína Imd purificada pelo ensaio SPR, o que sugere uma probabilidade de que os TFs possam desempenhar um papel no controle do comportamento da proteína Imd ou seu processo de modificação pós-traducional. Estudos anteriores destacaram um papel fundamental da ubiquitinação na transdução de sinal Imd (Kleino e Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014), e a prevenção da ubiquitinação Imd resulta no profundo desligamento da sinalização Imd (Myllymaki et al., 2014; Thevenon e outros, 2009). No entanto, nossos ensaios de ubiquitinação in vitro e in vivo mostraram que os TFs dificilmente afetam o padrão de ubiquitinação de Imd. Um estudo recente mostrou que a formação de amiloide é necessária para a ativação da via Drosophila Imd após o reconhecimento de peptidoglicanos bacterianos (Kleino et al., 2017). Curiosamente, nossos ensaios de SDD-AGE e ThTbinding sugeriram que a coalescência de Imd é impedida por TFs. A prevenção da agregação de Imd por derrubar ou mutação de Imd em células intestinais aparentemente reverteu os efeitos benéficos dos TFs na extensão da vida útil. Para confirmar ainda mais nossa descoberta, seria interessante examinar se os TFs não são mais funcionais para prolongar a vida útil em moscas de frutas quando o motivo RHIM críptico conservado (cRHIM, aminoácidos da 118ª à 121h) de Imd é especificamente nocauteado e destruído, com base na constatação de que o crime no IMD é essencial para sua agregação e formação de amiloide (Kleino et al., 2017). No entanto, nosso estudo destaca um papel fundamental dos TFs no controle da homeostase intestinal e do processo de envelhecimento, talvez através da modulação da coalescência de Imd. Estudos futuros devem se concentrar em explorar quais resíduos ou regiões de Imd são ligados por TFs e como essa ligação resulta na prevenção da condensação de Imd. Além disso, nossos achados no sistema de mamíferos indicaram que os TFs podem efetivamente proteger o cólon contra a inflamação causada pelo químico venenoso exógeno DSS, sugerindo um papel regulador conservado dos TFs na manutenção da homeostase intestinal. Vale a pena investigar se os TFs desempenham um papel no controle da montagem de proteínas em tecidos de mamíferos.

Este artigo foi extraído de zhongwenxie@ahau.edu.cn