Capítulo 1: O papel dos inflamassomas na glomerulonefrite

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Abstrato: Oinflamassomaé um complexo multiproteico imune que ativa a pró-caspase 1 em resposta a estímulos indutores de inflamação e leva à produção de citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-18. Os inflamassomas NLRP1 e NLRP3 são os mais bem caracterizados e têm sido relacionados a diversas doenças autoimunes. Sabe-se que o rim expressa genes do inflamassoma, que podem influenciar o desenvolvimento de algunsglomerulonefrite, como nefrite lúpica, glomerulonefrite ANCA, nefropatia por IgA e nefropatia anti-GBM. Polimorfismos desses genes também foram descritos para desempenhar um papel em doenças autoimunes edoenças renais. Nesta revisão, descrevemos as principais características, mecanismos de ativação, regulação e funções dos diferentes inflamassomas. Além disso, discutimos as últimas descobertas sobre o papel do inflamassoma em várias glomerulonefritas a partir de três pontos de vista diferentes: estudos in vitro, animais e humanos.

Palavras-chave: inflamassoma; NLRP3; glomerulonefrite; imunidade inata

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1. O inflamassoma

O sistema imunológico é composto por dois braços, a imunidade inata e adaptativa, que são responsáveis ​​pela imunidade imediata e de longo prazo a antígenos derivados de patógenos e não-patógenos. A imunidade inata detecta infecções, alterações na homeostase celular e danos nos tecidos, gerandoinflamação, reparo tecidual e restauração do equilíbrio homeostático. Esses efeitos são promovidos pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs). PAMPs e DAMPs se ligam a receptores de reconhecimento de padrão, que incluem receptores semelhantes a Toll (TLRs), receptores semelhantes a NOD citoplasmáticos (NLRs) e estão ausentes em receptores semelhantes a melanoma 2- (AIM2). Estudos anteriores demonstraram o papel de vários membros da família NLR na formação de inflamassomas, complexos multiproteicos capazes de reconhecer estímulos indutores de inflamação. Esses complexos ativam a pró-caspase-1, responsável pela clivagem de múltiplos substratos, principalmente as citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-18. A liberação dessas citocinas pelo inflamassoma também pode ser realizada através de uma forma inflamatória de morte celular programada denominada piroptose [4]. Portanto, a ativação do inflamassoma desenvolve atividade de imunidade inata em resposta à infecção tecidual. O estímulo não infeccioso também pode ativar o inflamassoma. Embora os inflamassomas possam ser ativados por muitos membros da família NLR, esta revisão se concentrará principalmente no inflamassoma NLRP3 e NLRP1, NLRC4 e proteínas ausentes no melanoma 2 (AIM2) (Figura la), também importantes em muitosdoenças imunológicas. Além disso, o papel desses complexos em diferentes glomerulonefrites será revisto.

Figura 1. Estrutura do inflamassoma e mecanismo de ativação. (a) Representação esquemática da montagem do inflamassoma de NLRP3 e confirmação detalhada do andaime de NLRP3, proteína do tipo mancha de apoptose adaptadora (ASC) e a procaspase efetora-1. (b) Estrutura de NLRP1, NLRP3, NLRC4 e AIM2 que participam da formação dos principais inflamassomas. Os membros da família NLR (NLRP1, NLRP3, NLRC4) contêm repetições ricas em leucina (LRR) e um domínio central de ligação ao nucleotídeo (NBD). O domínio PYD N-terminal está presente nos membros da subfamília NLRP, enquanto o NLRC4 apresenta um domínio CARD. O NLRP1 também contém uma extensão C-terminal contendo um domínio de função para encontrar (FIIND) e um domínio CARD. AIM2 é composto por um domínio PYD N-terminal e um domínio C-terminal HIN (localização hematopoiética, indutível por interferon e nuclear). (c) Vias de ativação de NLRP3 e funções efetoras. A montagem do inflamassoma NLRP3 pode ser desencadeada de várias maneiras: detecção de PAMPs e DAMPs via PRRs, estimulação de citocinas via receptor IL-1(IL-1R), ou através de ligação de TNF a receptores de fator de necrose tumoral (TNF) TNFR1 e TNFR2. Esses elementos desencadeiam a transcrição de NF-kB, que promove a transcrição dos genes NLRP3 e IL1B; este é o primeiro sinal ou priming. O segundo sinal ou ativação pode ser produzido por fluxo iônico, efluxo de K, influxo de Ca2 mais influxo de Nat e efluxo de Cl, espécies reativas de oxigênio (ROS) e disfunção mitocondrial ou dano lisossomal. A montagem do inflamassoma NLRP3 provoca a maturação proteolítica das citocinas IL-1 e IL-18, que também participam do desenvolvimento da autoimunidade e da piroptose pela ação da gasdermina-D. Resposta primária de diferenciação de proteína mielóide 88, MyD88; quinase reguladora de sinal de apoptose, ASK; quinases quinase associada ao receptor de interleucina 1, IRAK; caspase-8, CASP8; proteína associada ao Fas com domínio de morte, FADD; P2X purinoceptor 7, P2X7R; potencial de receptor transitório melastatina, TRPM; potencial do receptor transitório vanilóide, TRPV. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

2. Inflamossomos da Família NLR

A família NLR compreende 23 genes humanos. Os membros desta família apresentam elementos estruturais comuns: série C-terminal de repetições ricas em leucina (LRRs) e domínios centrais de ligação a nucleotídeos (NBD), um componente do domínio NACHT maior. Além disso, os membros da família NLR podem ser divididos em diferentes subfamílias, dependendo de seu domínio efetor N-terminal: domínio de ativação e recrutamento de caspase (CARD), inibidor de repetição de proteína de apoptose (BIR) ou domínio de pirina (PYD). As subfamílias NLRP e NLRC são as mais importantes, sendo a primeira a subfamília de NLRs mais bem caracterizada. Os membros da subfamília NLRP possuem domínios PYD em seu N-terminal enquanto as proteínas NLRC possuem um ou mais domínios CARD [8-10]. Os membros da família NLR NLRP1, NLRP3 e NLRC4 foram os mais bem estudados na formação do inflamassoma.

2.1. Subfamília NLRP

A subfamília NLRP é composta por 14 membros no genoma humano, mais 3 parálogos em camundongos sendo NLRP1(NALP1/CARD7) o primeiro a ser descrito na formação de inflamassomas. Sua estrutura consiste em um PYD N-terminal seguido por um domínio NACHT e LRRs. Isso também é contribuído por uma extensão C-terminal contendo um domínio function-to-find (FIIND), que processa automaticamente NLRP1 em duas cadeias polipeptídicas, e um domínio CARD, que leva à ativação de caspase{10}} e a conseqüente pro -liberação de citocinas inflamatórias. Tem sido relatado que as mutações NLRP1 podem desempenhar um papel em doenças inflamatórias, como psoríase [15], artrite reumatóide (AR) [16] ou no lúpus eritematoso sistêmico (LES).

O inflamassoma NLRP3 (Cryopyrin/Nalp3/Cias1/Pypaf1) é o mais amplamente estudado e é o único membro conhecido a ser ativado por numerosos sinais inflamatórios patogênicos e estéreis. Além disso, NLRP3 desempenha um papel na regulação da produção de IL-1 em macrófagos [18,19]. O NLRP3 é composto pelo andaime NLRP3, uma proteína do tipo mancha de apoptose adaptadora (ASC) e a procaspase efetora-1. Ele interage com ASC por meio de interações homotípicas PYD-PYD para promover a formação do inflamassoma recrutando e ativando a procaspase-1 para gerar caspase ativa-1(Figura lb). Esta proteína efetora leva à conversão dos precursores de citocinas pró-IL-1 e pró-IL-18 em IL-1 e IL-18 maduras e biologicamente ativas. A principal atenção dada ao inflamassoma NLRP3 deve-se especialmente à sua implicação na patogênese de várias doenças inflamatórias humanas, particularmente as síndromes periódicas associadas à criopirina (CAPS)[21]. Concentrando-se em seu papel crítico na regulação da inflamação, o inflamassoma NLRP3 pode ser de grande importância para terapias direcionadas à inflamação.

2.2. Subfamília IPAF-NAIP

Seu elemento mais bem estudado, NLRC4(IPAF/CARD12), foi previamente caracterizado como um fator ativador de ICE-protease (IPAF) quanto à sua capacidade de ativar caspase-1. No entanto, estudos posteriores colocaram claramente sua estrutura de domínio na família NLR e, como possuía um domínio CARD, foi renomeado NLRC4. O domínio CARD permite vincular-se diretamente ao CARD de caspase-1 sem a participação de ASC [24]. No entanto, o NLRC4 é capaz de se ligar ao ASC e ativar eficientemente a caspase-1, bem como a caspase-8 e a caspase apoptótica.

O NLRC5 é um inflamassoma menos conhecido que liga as respostas imunes inata e adaptativa regulando a expressão de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). É expresso em macrófagos, células dendríticas, células T, células B e fibroblastos. Além disso, uma interação observada com o inflamassoma NLRP3 parece ter um efeito sinérgico na clivagem de IL-1, portanto, pode modular positivamente a ativação do inflamassoma NLRP3 [28]. Portanto, NLRC5 poderia formar um inflamassoma funcional, mas são necessários mais estudos para conhecer sua função fisiológica com mais precisão.

Além disso, NOD1 é o membro fundador da família NLR e, juntamente com NOD2, foram os primeiros NLRs identificados como sensores para PAMPs [29]. Os receptores NOD1(NLRC1) e NOD2(NLRC2) podem ativar NF-kB e levar à produção de citocinas inflamatórias. No entanto, eles não foram descritos para formar um complexo inflamassoma.

3. Inflamossomos da Família Não-NLR

Recentemente, outros inflamassomas não pertencentes à família NLR têm sido amplamente descritos, como as proteínas ausentes no melanoma 2 (AIM2) e os inflamassomas de pirina. AIM2 foi descrito como um sensor capaz de desencadear a ativação do inflamassoma, piroptose e liberação de IL-1 e IL-18 em resposta à detecção de DNA de fita dupla (dsDNA) entregue intracelularmente [31]. membro da família de proteínas ALR, composta por um domínio PYD N-terminal e um domínio HIN (hematopoiético, indutível por interferon e localização nuclear) C-terminal. Além disso, regula negativamente a inflamação e as respostas do interferon tipo I (IFN) independentemente de sua função inflamassoma [33]. Diferentes estudos elucidaram uma ligação entre o aumento da expressão de AIM2 e várias doenças humanas, como aterosclerose, doença de pele e doença renal crônica.

4. Mecanismos de ativação do inflamassoma NLRP3

O inflamassoma pode ser entendido como um elemento bilateral e regula a infecção por patógenos, mas quando a resposta imune desencadeada não é bem regulada, pode estar envolvido em patologias como CAPS e distúrbios autoinflamatórios [21]. Os inflamassomas podem reconhecer uma grande variedade de estímulos endógenos ou exógenos, estéreis ou infecciosos dentro da célula (PAMPs e DAMPs), que desencadeiam sua montagem e ativação. Este processo pode ser explicado considerando os sensores a montante que reconhecem os sinais de ativação, os adaptadores e os efetores a jusante ]35. A inviabilidade da interação direta entre o NLRP3 e essa diversidade de estímulos levou a um evento celular produzindo uma mudança conformacional no NLRP3, convertendo-o em uma forma ativa. No entanto, não existe um mecanismo único para a ativação do inflamassoma NLRP3 36]. A ativação de NLRP3 pode ser desencadeada pela detecção de PAMPs e DAMPs via PRRs, como TLRs e NLRs, por estimulação de citocinas via receptor IL-1 (IL-1R), ou por ligação de TNF ao fator de necrose tumoral (TNF ) receptores TNFR1 e TNFR2 [37]. Além disso, existem mediadores que facilitam a transdução de sinal desses receptores: a resposta primária de diferenciação mieloide da proteína adaptadora 88(MyD88), a quinase reguladora de sinal de apoptose (ASK)1 e ASK2, quinase associada ao receptor de interleucina 1 (IRAK)1 e IRAK4, caspase-8(CASP8), proteína associada ao Fas com domínio de morte (FADD), proteína de ligação à ubiquitina SHARPIN e proteína que interage com TRAF com domínio associado à forquilha (TIFA). Todos esses elementos desencadeiam a transcrição do NF-kB, que promove a transcrição dos genes NLRP3 e IL1B, habilitando a célula a responder aos ativadores de NLRP3.

A ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos é um processo de duas etapas, portanto, requer um sinal de priming. No processo de priming, um estímulo não ativador provoca a expressão transcricional dos principais componentes do inflamassoma, sendo este o primeiro hit'. Segundo estímulo ou 'segundo golpe' agrava a atividade funcional do inflamassoma NLRP3 [39]. A ativação do inflamassoma NLRP3 pode ser produzida por diferentes estímulos, incluindo fluxo iônico, K+efluxo, Ca2+influxo, Na+influxo e Cl- efluxo, espécies reativas de oxigênio (ROS) e disfunção mitocondrial ou dano lisossomal. K mais canais de efluxo P2X purinoceptor 7(P2X7R) participam deste tipo de ativação do inflamassoma. Outros canais de Ca2+ residentes na membrana plasmática, como o potencial receptor transitório melastatina 2 (TRPM2), TRPM7 e o potencial receptor transitório vanilóide 2 (TRPV2), podem levar ao influxo de Ca2+ para o citosol [21] (Figura lc). As mitocôndrias regulam a homeostase e respondem a mudanças no K+ e ROS intracelular, resultando em disfunção mitocondrial e apoptose. Além disso, a sinalização apoptótica mitocondrial estimulada por NF-kB causa a produção de IL-1 . O DNA mitocondrial oxidado é liberado como consequência da disfunção mitocondrial e apoptose, e ativa diretamente o inflamassoma NLRP3 [40-42].

Além da ativação do inflamassoma canônico NLR-ASC-caspase-1, há também um inflamassoma não canônico caracterizado por sua ativação via caspase-1l em camundongos com os ortólogos humanos caspase-4/ 5. A caspase-11 reconhece o lipopolissacarídeo (LPS) transfectado no citosol de bactérias Gram-negativas, ligando-se diretamente ao seu domínio CARD. Ele inicia a maturação proteolítica de IL-1, bem como a morte celular piroptótica de maneira dependente de GSDMD [35,43]. A ativação não canônica do inflamassoma por um componente do LPS foi mostrada em um estudo anterior em que camundongos sem caspase-1l eram resistentes à letalidade induzida por LPS, mesmo na presença de TLR4 [44]. No entanto, a partir dos inflamassomas canônicos e não canônicos, foi observada uma via alternativa de ativação do inflamassoma. Não requer K mais efluxo, indução de formação de manchas ASC, ou levando a piroptose subsequente, e foi espalhado por TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8 sinalização a montante de NLRP3.

O inflamassoma NLRP3 pode ser regulado em um nível pós-transcricional e pós-traducional. No nível pós-transcricional, fatores epigenéticos, como metilação do DNA e acetilação de histonas, podem regular a expressão de RNAm de NLRP3 em resposta à infecção por Mycobacterium tuberculosis. A desregulação dos mecanismos epigenéticos pode contribuir para o desenvolvimento patológico de síndromes autoinflamatórias ao aumentar a expressão de componentes do inflamassoma. MicroRNAs também são estudados como reguladores pós-transcricionais de inflamassomas NLRP3 (miR-223, miR-133a, miR-7, miR-30e..)[35,47] . A ativação do inflamassoma NLRP3 também pode ser regulada por modificações pós-traducionais, principalmente fosforilação e ubiquitinação. Essas modificações geralmente estão vinculadas. Eles podem provocar diferentes destinos na proteína NLRP3, incluindo a modificação de redes de proteínas que interagem, tráfego, mudança na localização subcelular, ativação/inibição da atividade enzimática e degradação proteassomal, lisossomal ou autofágica [48]. De fato, um estudo recente mostrou que a fosforilação do NLRP3 em seu domínio LRR pode regular a montagem do inflamassoma.

5. Funções efetoras do inflamassoma

Como dito anteriormente, os inflamassomas desempenham um papel crucial no sistema imunológico inato por sua capacidade de controlar a ativação da enzima proteolítica caspase-1, que leva à maturação proteolítica das citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL{ {2}}, bem como a morte celular por piroptose [50]. A IL madura-1 liga-se a IL-1R, promovendo a heterodimerização do receptor e o subsequente recrutamento de componentes como MyD88. IL-1 leva à liberação de outras citocinas, como IL-l, IL-6 e TNF-, bem como outros fatores que controlam o crescimento e a diferenciação de células imunes. IL-18 participa de muitas vias fisiológicas. Um nível mais alto de IL-18 pode causar síndromes metabólicas. Por exemplo, a inflamação crônica gerada nos tecidos adiposos pode levar à resistência à insulina e ao diabetes mellitus tipo 2.

Outro importante processo realizado pelos inflamassomas é uma forma lítica de morte celular programada denominada piroptose. Tanto a sinalização canônica do inflamassoma, recrutando caspase-1, quanto o inflamassoma não canônico, via caspase-4, caspase-5(em humanos) e caspase-11 (em camundongos), podem desencadear piroptose. É caracterizada por edema celular, lise de membrana e liberação de compostos inflamatórios no espaço extracelular, como IL-1 , IL-6 e IL-18. Estudos anteriores mostraram que os mentores, um grupo de proteínas efetoras formadoras de poros, podem desempenhar piroptose inflamatória induzida por caspase, sendo o domínio N-terminal da gasdermina-D suficiente para desencadear o processo. Além disso, a apoptose{12}}dependente de caspase é uma via adicional resultante da ativação do inflamassoma. Os inflamassomas AIM2 e NLRP3 mostraram formas clivadas de caspase apical-8 e caspase executora-3, em resposta ao DNA citosólico e nigericina, respectivamente. O processo ocorreu independentemente da caspase-1, mas dependia do adaptador inflamassoma ASC. Curiosamente, um estudo recente descreveu a capacidade da proteína de ligação ao Z-DNA 1 (ZBP1), um sensor imune inato capaz de ativar a morte celular na forma de piroptose, apoptose e necroptose (PANoptose) juntamente com o inflamassoma NLRP3.

Enquanto as funções efetoras têm sido amplamente estudadas, existem vários papéis adicionais dos complexos inflamassomas que foram menos caracterizados. IL-1 é uma proteína citoplasmática sem líder cujos mecanismos de secreção são pouco definidos. Um mecanismo independente de retículo endoplasmático (ER)/Golgi denominado 'secreção de proteína não convencional foi mostrado, e era dependente da ativação de caspase-1. No entanto, os mecanismos específicos e os componentes moleculares envolvidos neste processo não são claros. Outro papel emergente dos inflamassomas é a ativação de eicosanóides, moléculas bioativas derivadas de lipídios de membrana que desempenham um papel em processos homeostáticos e patológicos. Além disso, foi observada uma ligação entre a ativação do inflamassoma e a autofagia, bem como a regulação da maturação do fagossoma.

6. O papel do inflamassoma na imunidade adaptativa e autoimunidade

A produção de citocinas pró-inflamatórias é fundamental para uma resposta inata eficaz, bem como um mecanismo pelo qual o sistema imune inato influencia o desenvolvimento subsequente de uma resposta imune adaptativa. Como se sabe, os inflamassomas são componentes do sistema imune inato que produzem as citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-18, e conduzem a diferenciação de linhagens específicas de células T auxiliares (Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras), que são os principais atores da imunidade adaptativa [60]. Por outro lado, uma ativação aberrante do inflamassoma é responsável pelo desenvolvimento de CAPS, bem como outras doenças comuns, como distúrbios metabólicos, doenças relacionadas a cristais e doenças autoimunes. A inflamação também é crucial em muitas doenças renais, incluindo lesão renal aguda (LRA) e doença renal crônica (DRC). Embora o sistema imunológico inato esteja sempre envolvido, nessas condições, a imunidade adaptativa desempenha o papel principal.

Em relação às doenças autoimunes, elas são caracterizadas por células autorreativas e pela superprodução de autoanticorpos, produzidos por falta de tolerância imunológica e respostas imunes autorreativas aberrantes. A patogênese das doenças autoimunes ainda precisa ser esclarecida, mas foi demonstrado que a aberração na imunidade inata e adaptativa está envolvida. O inflamassoma NLRP3 foi recentemente associado ao reconhecimento do sinal imune inato e à indução de respostas imunes autorreativas, provavelmente sendo um ponto de verificação na imunidade inata para causar imunidade adaptativa distorcida [62,63]. Portanto, como a função do inflamassoma NLRP3 pode afetar o desenvolvimento de doenças autoimunes? As citocinas liberadas pelo inflamassoma, especialmente IL-1 , produzem um efeito inflamatório que promove o desenvolvimento da maioria das doenças autoimunes, incluindo AR e doença inflamatória intestinal. Além disso, o inflamassoma NLRP3 também é responsável por doenças autoimunes devido a uma disfunção imune adaptativa. IL-1 medeia a proliferação de células T, portanto, pode promover células T autorreativas para causar a morte de células b [63,66]. O inflamassoma NLRP3 promove a diferenciação Th1 na AR, induzida por IL-1 de maneira caspase-1-dependente, e também pode induzir a diferenciação e polarização de Th2, Th17 e células dendríticas em outras doenças autoimunes [63, 67]. As células Th17 podem produzir citocinas pró-inflamatórias, como IL-17A, IL-17F, IL-21 e IL-22, enquanto as células Th1 secretam IFN-, induzida por IL{{ 26}}, e todos esses fatores contribuem para o desenvolvimento da autoimunidade. Além disso, doenças autoimunes podem ser promovidas por piroptose, levando à liberação de detritos celulares e sua reação com células imunes, desencadeando inflamação.

De fato, múltiplos polimorfismos nos genes do inflamassoma têm sido associados à suscetibilidade e ao desenvolvimento de doenças autoimunes. Por exemplo, variantes raras de ganho de função podem estar implicadas em doenças inflamatórias hereditárias, caracterizadas pela produção descontrolada de IL-1 e/ou IL-18, denominadas inflamassomopatias. Mutações em NLRP3 são a inflamação prototípica, mas também foram descritas como doenças autoinflamatórias associadas a mutações que ativam os inflamassomas NLRP1, NLRC4 e pirina [69,70]. Além disso, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) desempenham um papel crucial em doenças autoimunes e podem afetar o priming de inflamassomas, alguns de seus componentes ou produtos finais (IL-1 , IL-18).