Capítulo 1: Fator 15 semelhante a Krϋppel suprime a proliferação de células mesangiais glomerulares renais através do aprimoramento da conjugação P53 SUMO1

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Abstrato

Célula mesangial (MC)proliferaçãoé uma característica patológica chave em uma série dedoenças renais, incluindo nefrite proliferativa mesangial e nefropatias diabéticas. O conhecimento das respostas do MC a estímulos patológicos é crucial para a compreensão desses processos patológicos. Anteriormente, determinamos que o fator Krüppel-like 15 (KLF15), um fator de transcrição dedo de zinco enriquecido nos rins, era necessário para a inibição da proliferação de MC. No presente estudo, investigamos o gene alvo direto e o mecanismo subjacente pelo qual KLF15 regulava a proliferação mesangial. Primeiro, selecionamos o modificador 1 relacionado à ubiquitina pequena (SUMO1) como o alvo transcricional direto de KLF15 e validamos esse achado com ensaios de ChlP-PCR e luciferase. Além disso, demonstramos que a superexpressão de KLF15 ou SUMO1 aumentou a estabilidade de P53, que bloqueou o ciclo celular de MCs renais humanos (HRMCs) e, portanto, aboliu a proliferação celular. Por outro lado, o knockdown de SUMO1 em HRMCs, mesmo aqueles superexpressos com KLF15, não conseguiu inibir as taxas de proliferação de HRMC e aumentar a SUMOilação de P53. Finalmente, os resultados mostraram que os níveis de SUMOilada P53 nos córtices renais de ratos modelo anti-Thy 1 diminuíram durante os períodos de proliferação. Esses achados revelam o mecanismo crítico pelo qual KLF15 tem como alvo SUMO1 para mediar a proliferação de MCs.

PALAVRAS-CHAVE: KLF15, Proliferação de células mesangiais, P53, SUMO1

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1| INTRODUÇÃO

As células mesangiais (MCs) representam aproximadamente um terço da população de células dentro do glomérulo. Eles desempenham papéis importantes na homeostase, mantendo a arquitetura estrutural do glomérulo, produzindo e mantendo a matriz mesangial, regulando a área de superfície de filtração e fagocitando células apoptóticas ou complexos imunes.1 Em muitas doenças glomerulares, como nefrite proliferativa mesangial e nefropatias diabéticas , os MCs são lesados ​​e sofrem uma grande mudança no fenótipo, resultando em proliferação mesangial descontrolada e deposição excessiva de matriz mesangial.2-4 Além de hiperproliferar e aumentar sua produção de proteínas da matriz extracelular (MEC) e metaloproteinases de matriz, os MCs podem liberar fatores inflamatórios, resultando em esclerose glomerular e fibrose intersticial; agravar ainda mais o dano renal e causar progressão para doença renal irreversível em estágio final.5-O conhecimento da resposta do MC a estímulos patológicos é crucial para o desenvolvimento de tratamentos para reduzir o dano renal causado pela proliferação anormal de MCs e retardar a progressão na doença renal terminal.

Os fatores semelhantes a Krüppel (KLFs) são um grupo de fatores de transcrição de ligação ao DNA de dedo de zinco. Evidências crescentes indicam que esta família está envolvida em uma variedade de processos celulares, como diferenciação celular, remodelação cardíaca, hematopoiese e determinação do destino de células-tronco.8-10 A família KLF consiste em dezoito membros, entre os quais KLF15 é amplamente distribuído norim, pâncreas, coração,fígadoe músculos esqueléticos. Estudos anteriores demonstraram que KLF15 é um regulador transcricional chave em diversos processos fisiológicos, incluindo gliconeogênese,respostas imunes, e diferenciação de adipócitos.1-14 Nosso estudo anterior demonstrou que KLF15 é necessário para inibir a proliferação de MCs.15 Este estudo teve como objetivo esclarecer o gene alvo direto e o mecanismo a jusante pelo qual KLF15 regula a proliferação mesangial.

2|MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 |Modelo de nefrite anti-Thy1

Ratos Wistar machos (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) pesando entre 200 e 220g foram alocados aleatoriamente nos grupos controle e anti-Thy1. Todos os ratos foram alojados em uma instalação de cuidados com animais sob um ciclo claro/escuro de 12/12 horas com acesso livre a comida e água. Avaliações e intervenções relacionadas ao bem-estar foram realizadas durante todo o experimento. No total, 28 ratos foram injetados com um anticorpo monoclonal anti-Thy1 de camundongo, conforme descrito anteriormente,16 e sete foram injetados com solução salina (controles). Os glomérulos foram purificados do tecido do córtex renal usando um método de peneiramento. Os soros foram coletados para medições dos níveis séricos de nitrogênio ureico e creatinina. Ratos modelo anti-Thy1 foram mortos nos dias O,3,5,7 e 10, e seus glomérulos foram colhidos. Todos os procedimentos experimentais e de bem-estar animal foram realizados em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (EUA National Research Council, 1996).

2.2|Cultura e tratamento de MC renal humano (HRMC)

As HRMCs renais primárias foram adquiridas à ScienCell (San Diego, CA). As HRMCs da terceira à sexta passagens foram mantidas em meio MC (MsCM; ScienCell) de acordo com as instruções do fabricante. Para experimentos, as células foram cultivadas até a confluência, paradas de crescimento em soro reduzido (0,5 por cento FBS) por 24 horas e divididas em diferentes grupos experimentais.

Para tratamento com diferentes concentrações de glicose, as células foram incubadas em MsCM contendo 5 mmol/L de glicose (glicose normal) ou 30 mmol/L de glicose (alta glicose, HG) por 48 horas a 37 graus C. Células incubadas sob condições experimentais idênticas condições com 5 mmol/L de glicose e 25 mmol/L de manitol em vez de 30 mmol/L de glicose foram usadas como controles osmóticos. Para tratamento com PDGF-BB, as células foram incubadas em MsCM contendo 20 ng/ml de PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) por 48 horas a 37 graus C.

2.3|Imuno-histoquímica (IHC)

O tecido renal embebido em parafina foi seccionado com 4 μm de espessura e as seções foram coradas para IHC. As fatias foram incubadas com 3 por cento de H, O, para bloquear a peroxidase endógena após a desparafinização. Após a recuperação e bloqueio do antígeno, as fatias foram incubadas com anticorpos anti-KLF15 (ab81604, Abcam), modificador 1 relacionado à ubiquitina anti-pequena (SUMO1, ab32058, Abcam) e anticorpos anti-PCNA (ab92552, Abcam) a 4 graus C . As fatias foram então incubadas com um anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano a 37 graus por 30 minutos, e a reação imuno-histoquímica foi observada de acordo com as instruções do fabricante com 3,3'-diaminobenzidina (DAB, ORIGINE, CN) como agente cromogênico . Posteriormente, as lâminas foram contracoradas com hematoxilina-eosina e fotografadas com um microscópio de luz (Olympus). A coloração imuno-histoquímica foi avaliada com o software Image J de acordo com o valor da densidade óptica média (AOD).

2.4 |Imunoprecipitação de cromatina (ChlP) com sequenciamento paralelo (ChIP-Seq)

O ChIP foi realizado usando um Kit Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as HRMCs foram superexpressas com KLF15 ou scramble em uma densidade celular de 2.0×10³células/mL e reticuladas com 1,7% de formaldeído em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente (RT ). As células reticuladas foram lisadas para obter a fração nuclear, que foi sonicada em tampão ChIP 1×. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação a 9300×g por 10 minutos a 4 graus. As amostras de cromatina foram incubadas com um anticorpo anti-KLF15 (ab81604, Abcam) ou um anticorpo anti-lgG (controle de fundo) durante a noite a 4 graus. Os complexos ligados ao anticorpo foram capturados por incubação com esferas magnéticas de proteína G. As bibliotecas ChlP-Seq para sequenciamento foram preparadas usando um TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). As bibliotecas foram submetidas a sequenciamento paralelo com um sequenciador HiSeq2500 (Illumina) usando o protocolo de comprimento de sequenciamento de 50 bp de extremidade única. Os dados brutos de sequenciamento de próxima geração (NGS) foram convertidos em arquivos FASTQ usando o software CASAVA (versão 1.8.2), e cada conjunto de dados foi alinhado ao genoma de referência humano (UCSC hg19) usando o Alinhador Burrows-Wheeler (versão 0.7.12 ).17 A chamada de pico ChIP-Seq foi realizada usando o programa MACS2 (versão 2.0.1) com os parâmetros padrão, mas um valor aq de 0,05, com os dados de entrada para subtração.18 Comparação de pico com o controle embaralhado (as células parentais) e amostras de superexpressão foram realizadas com Diffbind, um pacote R, usando o algoritmo DeSeq2, e uma taxa de falsa descoberta de 0,1 foi considerada para indicar significância.1 Os superpotenciadores foram identificados a partir do conjunto de picos detectados em HRMCs tratadas com DMSO com o superpotenciador software ROSE.2 grau Os picos de ChIP-Seq foram anotados com o pacote R ChlPpeakAnno, e os promotores foram definidos como regiões enriquecidas com KLF dentro de 1 kb do local de início da transcrição.21 O gene com o local de início da transcrição mais próximo do c A entrada de cada superpotenciador foi definida como o gene alvo desse superpotenciador.

2.5|PCR quantitativo em tempo real com chip (ChlP-PCR)

O procedimento ChlP-PCR foi semelhante ao procedimento descrito acima. ChIP DNA de células tratadas com anticorpo anti-KLF15 foi usado para detectar a associação entre KLF15 e SUMO1. O DNA de células tratadas com anticorpos anti-lgG serviu como controle. O DNA purificado foi usado para a análise da região promotora proximal de SUMO1 por PCR em tempo real em um ABI PRISM 7600 usando SYBR GreenER qPCR Supermix. Os primers SUMO1 foram os seguintes: direto: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';reverso:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. A amplificação relativa da sequência promotora do gene foi calculada usando o {{18 }} método AcT e a normalização foi realizada contra uma diluição de 1:100 do DNA de entrada.

2.6|Marcação de células e marcação de isótopos estáveis ​​por aminoácidos em análise de cultura de células (SILAC)

As células a 15 por cento de confluência foram semeadas no meio completo apropriado (para HRMCs: MsCM). Os procedimentos de marcação e SILAC foram descritos em pesquisas anteriores.22 Resumidamente, após serem marcados com lisina leve (marcada com 13C) ou pesada (marcada com 15N) e leve (marcada com 1c) ou pesada (marcada com 15N) )arginina, as células foram transfectadas com um plasmídeo de superexpressão de KLF15 ou um plasmídeo de controle. Após o tratamento, as células foram tripsinizadas e contadas para obter um pellet celular de 2×10'células/condição, e as células foram submetidas à análise de SILAC usando espectrometria de massa. Os pellets de células pesadas e leves foram lisados ​​em tampão de radioimunoprecipitação enriquecido com inibidores de protease e fosfatase usando rajadas de sonicação de 15-segundos curtos. Os lisados ​​foram centrifugados a 14,000 rpm por 20 minutos. Após a centrifugação, os sobrenadantes foram coletados e a concentração de proteína foi medida usando um analisador de aminoácidos Hitachi L-8900. Alíquotas de 200 ug de proteína foram preparadas a partir das amostras, combinadas e precipitadas usando um método de precipitação de metanol-clorofórmio. Os pellets de proteína foram ressuspensos em 8 mol/L de ureia/0,4 mol/L de tampão de bicarbonato de amônio, reduzidos com 45 mmol/L de DTT por 30 minutos a 37 graus C, alquilados com 100 mmol/L de iodoacetamida por 30 minutos no escuro à RT e digerido com protease Lys-C (1:20 p/p) durante a noite (~ 16 horas) a 37 graus. A digestão de Lys-C foi ainda diluída e digerida com tripsina (1:20 p/p) durante 8 horas a 37 graus. O digest foi dessalinizado com uma coluna MacroSpin (The Nest Group, Inc) e seco em um concentrador SpeedVac. Os peptídeos dessalinizados foram então enriquecidos com fosfopeptídeos usando resina de dióxido de titânio embutida em pontas de 10 μL (Glygen Corp). Os fluxos foram reservados e os peptídeos enriquecidos foram eluídos usando uma proporção de 1:33 de hidróxido de amônio para a água. As frações de fluxo e eluição secas com SpeedVac foram ressuspensas em tampão A (0,1 por cento de ácido fórmico em água) e submetidas a análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC/MS).

2.7| Ensaio de repórter de dupla luciferase

O promotor SUMO1(NM_001005781) humano de tipo selvagem com 1604bp(-1474nt- plus 129nt) incluindo o potencial local de ligação (-205nt--199nt) foi obtido usando PCR amplificado e subclonado em um vetor pGL3-Basic(Cat.# E1751 Promega) com sítios de enzimas de restrição SacI e Bglll, denominado pGL3-WT-SU. Além disso, o sítio de ligação-CACCCA-dentro do promotor de SUMO1 foi mutado para -CGTTTG-, denominado pGL3-MT-SU. O plasmídeo (pReceiver-M94) contendo o cDNA de tamanho completo de KLF15 humano foi obtido de GeneCopoeia. O plasmídeo de superexpressão KLF15 e pGL3-WT-SU ou pGL3-MT-SU foram transfectados em células HEK293T com reagente Lipofectamine 2000. As amostras foram então cotransfectadas com um plasmídeo pRL-TK (Cat #E2241, Promega) expressando Renilla luciferase. Após 24 horas de transfecção, as células foram lisadas. Os níveis de atividade de luciferase de Firefly e Renilla foram examinados usando um sistema de ensaio repórter de luciferase dupla (Biotek).

2.8 |Preparação de RNA, síntese de cDNA e análise de RT-qPCR

O RNA total foi extraído com TRlzol (Invitrogen) e purificado com um RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi gerado usando um kit de síntese de cDNA de primeira fita ProtoScript (New England Biolabs. A PCR quantitativa foi realizada usando Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). As sequências de oligonucleotídeos usadas para RT-qPCR são fornecidas na Tabela 1.

2.9|Ensaio de proliferação celular

O cDNA de SUMO1 humano completo (NM_003352.8) obtido da OriGene Technologies (Pequim, China) foi inserido no plasmídeo pCMV6-Entry (CAT#: RC200633). A proliferação celular foi analisada com um kit de imagem Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram incubadas em uma 6-placa de cultura de poço e transfectadas com um plasmídeo de controle KLF15 (Scramble, o grupo VECTOR), um plasmídeo de superexpressão de KLF15 (o mesmo acima, o grupo KLF15), um vetor de expressão para SUMO1 (o grupo VECTOR), um plasmídeo de superexpressão de SUMO1 (o grupo SUMO1), siRNA de controle negativo (o grupo SI CON), SUMO1 siRNA (o grupo SI SUMO1), um plasmídeo de superexpressão de KLF15 com SUMO1 siRNA (o grupo KLF15 mais SI SUMO1) ou um plasmídeo de superexpressão de KLF15 com siRNA de controle negativo (o grupo KLF15 mais SICON) por 24 horas. Em seguida, o meio foi substituído por um meio suplementado com 20 ng/mL de PDGF-BB por 48 horas, e uma concentração de EdU otimizada de 10 μmol/L foi adicionada cerca de 12 horas antes da estimulação de PDGF-BB. Após o tratamento, as células foram fixadas com 4 por cento de formaldeído, permeabilizadas com 0,5 por cento de Triton X-100, lavadas com 3 por cento de BSA em PBS, incubadas com coquetel de reação Click-iT⑧ por 30 minutos à temperatura ambiente e incubadas com Tampão de ação DAPIre por 10 minutos em RT enquanto protegido da luz. As células foram observadas por microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). Os núcleos das células em proliferação foram então corados de vermelho.

2.10|Análise de Western blot e imunoprecipitação (IP)

As células foram lisadas usando tampão RIPA (Thermo Scientific), e a proteína total nos sobrenadantes foi quantificada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific). A análise de Western blot e IP foram realizados conforme descrito anteriormente.23.24 Anticorpo anti-KLF15 (AV32587, Merk), anticorpo anti-SUMO1(S8070,Merk) e anti- -actina(A5316,Sigma) foram usados ​​para análise de Western blot. O anticorpo anti-P53 (P5813, Merk) foi usado para análise de IP.

2.11 |Análise de bioinformática

Candidatos de ChIP-Seq ou SILAC mostraram pelo menos duas vezes o enriquecimento sobre os controles. A análise de Gene Ontology (GO) foi realizada com o Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada (DAVID; versão 6.7). Os valores-p foram ajustados para testes de hipóteses múltiplas usando o método de Benjamini-Hochberg. Categorias significativamente enriquecidas na subontologia de função e caminhos KEGG com um valor P ajustado<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e os resultados são expressos como médias ± SEs. Todos os dados foram analisados ​​usando o software SPSS (ver.20.0; SPSS Inc) e comparados usando o teste t de Student ou ANOVA unidirecional. Um valor P<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">