Populações de células T CD8 e CD4 em rins humanos
Mar 25, 2022
Abstrato:Antecedentes: Em locais de fronteira e em órgãos internos, as células T de memória residentes em tecidos (TRM) contribuem para a barreira imunológica contra patógenos como vírus, bactérias, fungos e câncer. No entanto, as informações sobre a presença e função dessas células no rim humano são escassas. A fim de compreender melhor a defesa imunológica mediada por células T neste órgão, objetivamos determinar aspectos fenotípicos e funcionais das células T CD8 e CD4 presentes em células saudáveis e aloenxertos.rim tecido. Métodos: Usando citometria multicanal, avaliamos o fenótipo e a função das células T em amostras de tecido renal saudável (n=5) erimtecido de aloenxerto (n=7) e comparou esses aspectos com células T no sangue periférico de controles saudáveis (n=13). Resultados:Rimas amostras de tecido continham quantidades substanciais de células T CD8 e CD4. Ao contrário das células circulantes,rimAs células T frequentemente expressavam CD69 e CD103 e eram mais frequentemente ciclando ativamente. Além disso, quase todosrimAs células T expressavam CXCR3 e frequentemente expressavam CXCR6 em comparação com as células T na circulação. Marcadamente,rimAs células T produziram maiores quantidades de IFN do que as células circulantes e eram frequentemente polifuncionais. Conclusão: Células T funcionais com os traços característicos de TRM residem em humanosrimtecidos. Essas células são mais frequentemente ciclando ativamente e frequentemente expressam CXCR3 e CXCR6.
Palavras-chave:linfócitos residentes em tecidos; células T; CD8; CD4; CD69; CD103; rim; aloenxerto
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1. IntroduçãoAs células T de memória residentes (TRM) persistem nos tecidos para fornecer uma defesa localizada de longo prazo contra patógenos. Em contraste com as células T recirculantes, as populações de TRM não podem ser detectadas no sangue periférico e diferem significativamente das populações de células T recirculantes no que diz respeito ao seu fenótipo, função e metabolismo [1]. De fato, isso não é surpreendente, considerando o fato de que diferentes sistemas orgânicos, como os pulmões, estão expostos a cargas mais altas de diferentes patógenos do que no caso da circulação, que geralmente é isolada do mundo exterior [2].A retenção tecidual de TkM persiste por anos e é mediada por mecanismos que envolvem o eixo Esfingosina-1-receptor fosfato1 (S1PR1)-esfingosina 1-fosfato (SP1). S1PR1 é um receptor expresso por células T que medeia a egressão de órgãos linfoides secundários após a ligação à molécula de sinalização bioativa SP1, que é um importante mediador do tráfego de células T. Este eixo pode ser interrompido por CD69, uma lectina do tipo C ligada à membrana que antagoniza a expressão de S1PR1, mediando assim a retenção. Além disso, em camundongos, a expressão de S1PR1 é induzida pelo fator de transcrição Krüppel-like Factor 2 (KLF2), que foi regulado negativamente em TRM, inibindo assim também a saída de linfócitos [3]. Por sua vez, a regulação negativa de KLF2 mostrou ser mediada pelo homólogo do fator de transcrição de Blimpl em células T (Hobit), que é expresso de maneira específica para TpM em células T murinas [4]. Além disso, alguns TRM também expressam CD103 (integrina E), pelo que o TRM pode ser identificado usando a expressão de CD69 e CD103 [1].
Embora o conhecimento sobre o fenótipo e a função do TRM esteja aumentando para vários tecidos humanos, pouco se sabe sobre esses aspectos narim. Aqui, as células T são expostas a um conjunto distinto de patógenos, como bactérias que ascendem do trato urinário inferior e vírus renotrópicos, como o poliomavírus BK (BKPyV). De fato, descrevemos recentemente como os rins humanos contêm um subconjunto de células T que expressam CD69 e/ou CD103, entre as quais existem células T CD8 visando especificamente as proteínas BKPyV virion protein1 (VP1) e a proteína do antígeno T grande (LTAG) [5]. Nós, e outros, também demonstramos a presença de células T (MAIT) invariantes associadas à mucosa CD69/CD103-emrimtecido [6,7].
Para entender melhor que tipo de células T constituem a resposta imune localizada neste órgão, usamos citometria de fluxo multicanal para investigar o fenótipo e a função derimTRMs, isolados do doadorrimmaterial de receptores de transplante renal (RTRs) e derimtecido adjacente aos carcinomas de células claras renais, para ver como essas populações se comparam às populações de células T na circulação.Descobrimos que o ser humanorimO tecido contém quantidades substanciais de células T CD4 e CD8 expressando apenas CD69, CD69 e CD103, ou nenhum desses marcadores. Descobrimos que as células CD69-CD103- emrimtecido diferem substancialmente das células T na circulação e podem representar uma população TRM sem os marcadores TRM canônicos. Além disso, mostramos que as células T renais são mais frequentemente ciclando ativamente, conforme avaliado pelo aumento da expressão de Ki-67, quando comparado ao sangue. Também descobrimos que as células T CD8 e CD4 emrimtecido quase sempre expressa CXCR3 e muitas vezes expressa CXCR6. Esses achados implicam um papel para esses receptores de quimiocinas na atração e manutenção de populações de células T de memória residentes no rim.
2. Materiais e métodos
2.1. Pacientes e AmostrasAs amostras foram obtidas do Biobank Renal Diseases do Amsterdam UMC localização AMC. Neste Biobanco, amostras de pacientes, como sangue erimtecido, são coletados e armazenados de vida saudávelrimdoadores e RTRs que são acompanhados antes e após o transplante renal. Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios descritos nas Declarações de Helsinque e Istambul e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da inscrição no Biobank. Além disso, tecido residual de pacientes submetidos à nefrectomia tumoral (tecido renal distante do tumor) foi doado pelo Departamento de Patologia e também armazenado no Biobanco. Esses tecidos foram processados anonimamente de acordo com o Código de Conduta da Federação das Sociedades Médicas Científicas Holandesas (Tecido Humano e Pesquisa Médica: Código de Conduta para Uso Responsável, 2011 www.federa.org).
2.2. Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs)Amostras de sangue foram obtidas de controles saudáveis soronegativos para citomegalovírus (CMV) (vivosrimdoadores antes da cirurgia, n= 13). As características dos participantes deste estudo são apresentadas na Tabela 1. As PBMCs foram isoladas do sangue com heparina sódica por centrifugação em gradiente de densidade padrão e posteriormente criopreservadas até o dia da análise.
2.3. Tecido renalAmostras de tecido renal saudável (n {0}}) foram obtidas de rins que foram removidos cirurgicamente devido a carcinoma de células renais (tecido não tumoral distante do pólo contralateral do rim) e tecido renal transplantado (n {{1 }}) foi obtido a partir de aloenxertos renais explantados após falha do transplante. Essas amostras são chamadas de amostras de rim saudável e de transplante, respectivamente. Fatias de córtex renal foram cortadas em cubos de 1-mm com o McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, EUA), transferidas para tubos de 50 mL e lavadas com PBS frio até que não houvesse sangue visivelmente presente e o sobrenadante estava claro. Foi adicionado meio de digestão pré-aquecido (37 graus), 40 mL por 10 g de tecido (DNAse Tipo IV (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Holanda), colagenase tipo IV (0,5 mg/mL) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, EUA), BSA (60 mg/mL) (Sigma Aldrich), 20 uL/mL de soro fetal de vitela (FCS, VWR International BV, Amsterdã, Holanda), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdã, Holanda), penicilina-estreptomicina (Biochrom GMBH, Berlim, Alemanha) em HBSS (Westburg BV, Leusden, Holanda)), e incubada em agitador por 20 min a 37 graus. A suspensão quente foi transferida para um tubo C (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Alemanha) e submetida ao programa M_spleen_04.01 nos GentleMacs (Miltenyi). O meio de digestão foi desativado com PBS frio e a suspensão de células resultante passou por um filtro de células para obter uma suspensão de célula única, que foi submetida a centrifugação de gradiente de densidade padrão de acordo com o protocolo do fabricante (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Noruega ). As células mononucleares isoladas (MNCs de rim) foramcriopreservados até o dia da análise em IMDM suplementado com 20 por cento de FCS, 000036 v/v por cento de -mercaptoetanol, 5 por cento de DMSO, penicilina e estreptomicina.
2.4. Citometria de fluxoAs medições foram realizadas em um citômetro de fluxo LSRFortessa (BD Biosciences). Para cada amostra, 2×106 PBMCs ou 0,5×106 a 10×106 MNCs renais foram analisados. O volume de cada reação de coloração foi relativo ao número de células e as concentrações de anticorpos permaneceram constantes. As células foram incubadas com os anticorpos de superfície (Tabela Suplementar S1) por 30 min a 4 graus no escuro. As células mortas foram excluídas usando o corante de viabilidade fixável eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, EUA). Anticorpos monoclonais com alvos intracelulares (Tabela Suplementar S1) foram adicionados após a fixação e permeabilização das células usando o FoxP3/Transcription Factor Staining Set (eBioscience Inc.). Métodos publicados para citometria de fluxo e classificação de células para fins imunológicos foram seguidos [8]. A estratégia de gating usada para a análise fenotípica pode ser encontrada na Figura Suplementar S1. Mostramos anteriormente que nenhum dos marcadores analisados foi afetado pelo método de digestão usado para isolar as MNCs renais [7].
As limitações da amostra de tecido resultaram na exclusão de amostras dos painéis de cortina. As contagens de células CD3 mais analisadas por amostra em PBMCs saudáveis, MNCs renais saudáveis e rins TX podem ser encontradas na Figura S3. As amostras de MNCs foram analisadas apenas quando continham mais de 50 por cento de células vivas dentro do linfócito, conforme avaliado pela viabilidade dve, e os subconjuntos de células T baseados em CD69/CD103 foram caracterizados apenas se sua contagem total de células excedesse 50.
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2.5. Ensaio de estimulaçãoPBMC e MNC renal foram estimulados como descrito anteriormente [7,9]. PBMCs e MNCs renais foram descongelados na presença de DNAse I (200 KU/mL), lavados e deixados para se recuperar durante a noite em placas de 96-poço (Corning) não tratadas, de fundo redondo, em meio de cultura (RPMI suplementado com 10 por cento de FCS e penicilina-estreptomicina) a uma concentração de 20×106/mL (100 μL/poço).
Na manhã seguinte, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) e ionomicina (1 ug/mL; Sigma Aldrich) foram adicionados para estimular as células. Meio sozinho foi adicionado como controle negativo. Todas as incubações foram realizadas em meio de cultura na presença de CD28 (clone 15E8;2 ug/mL), CD29 (clone TS 2/16;1 ug/mL), brefeldina A(10 ug/mL, Invitrogen) e GolgiStop ( BD Biosciences) em um volume final de 200 uL por 4 h a 37 graus e 5 por cento de CO2.
Subsequentemente, as células foram incubadas durante 30 min com os anticorpos de superfície (Tabela Suplementar S2). As células mortas foram excluídas usando o corante de viabilidade fixável eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, EUA). Anticorpos monoclonais para coloração intracelular (Tabela S1) foram adicionados após fixação e permeabilização das células usando o Conjunto de reagentes Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). As células foram lavadas duas vezes e analisadas em um citômetro de fluxo LSRFortessa. A estratégia de gating usada na análise funcional pode ser encontrada na Figura Suplementar S2. Para determinar a polifuncionalidade de cada subconjunto de células T, o número médio de funções de cada população foi calculado usando a seguinte fórmula:((porcentagem de células produzindo 1 citocina]*1) mais ([porcentagem de células produzindo 2 citocinas]*2) mais ([porcentagem de células produzindo 3 citocinas]*3) mais ([porcentagem de células produzindo 4 citocinas]*4) mais ([porcentagem de células produzindo todas as 5 citocinas]*5))/100.
2.6. Análise de Dados
Os dados foram analisados usando FlowJo versão 10 (FlowJo, Ashland, OR, EUA). Todos os gráficos e figuras foram criados usando Graphpad Prism versão 8.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). O mesmo programa também foi utilizado para as análises estatísticas dos dados. O teste não paramétrico de Mann-Whitney-U foi usado para determinar a significância de amostras não pareadas. Para comparar amostras pareadas, foi utilizado o teste de postos sinalizados de Wilcoxon. valores p<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Resultados
3.1. Expressão Distinta de CD8 e/ou CD4 e Marcadores de Residência Tecidual por Células T em Tecido Renal SaudávelPrimeiro, comparamos a expressão de CD4 e CD8 por células T CD3-positivas no sangue periférico com células detectadas em tecido renal saudável. As células T CD4-CD8 plus (CD8) foram detectadas com mais frequência no tecido renal do que no sangue ((mediana) 25 por cento vs. 38 por cento )(Figura la). Em contraste, CD4*CD{{9} }(CD4) células T foram detectadas em frequências mais altas no sangue do que no tecido renal ((70 por cento vs. 52 por cento) Figura la). No geral, as células T CD4 foram vistas com mais frequência no tecido renal saudável do que as células T CD8 (Figura 1b).
Em seguida, investigamos a expressão dos marcadores de residência tecidual, CD69 e CD103, em subconjuntos de células T CD8 e CD4-definidas. Como esperado, CD69 e CD103 praticamente não foram expressos pelas células do sangue periférico (Figura 1c). No tecido saudável, os fenótipos CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus e CD69-CD103 plus foram expressos por, 46 por cento , 45 por cento , 6,6 por cento e 1,8 por cento de células CD8T, 61 por cento, 38 por cento, 0,44 por cento e 0,43 por cento de células CD4T, respectivamente (Figura lc). Em conclusão, as células T CD8, mas particularmente CD4, foram detectadas em números substanciais no tecido renal humano saudável. Além disso, a expressão de CD69 e CD103, marcadores de residência tecidual, foi detectada principalmente entre células T encontradas em tecidos saudáveis e não em sangue.
3.2. Padrões de Expressão Diferentes de Marcadores Denominadores de Subconjunto Comuns por Célula T na Saúde/por Tecido Renal
CD45RA, uma tirosina fosfatase, CCR7, um receptor de quimiocina conhecido por mediar o tráfego de células T para órgãos linfoides secundários, e CD28 e CD27, ambos receptores coestimuladores fortemente envolvidos na ativação de células T, são todos marcadores tradicionalmente usados para identificar subconjuntos de células T funcionais J1{ {53}},1l. Queríamos investigar até que ponto a distribuição desses subgrupos no sangue difere da distribuição no tecido renal. Como esperado, os maiores subconjuntos de células T CD8 detectados na circulação (ou seja, aqueles relativos a 5% ou mais da população total) foram aqueles com CD45RA mais CCR7 mais CD28 mais CD27 mais (células T virgens ou TN, ( mediana) 13 por cento), CD45RA-CCR7 mais CD28 mais CD27 mais (células T de memória central ou TcM, 6 por cento), CD45RA-CCR7-CD28 mais CD27 mais (TEv1,30 por cento), CD45RA-CCR7-CD28 mais CD27-(Tau2,10 por cento ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 por cento ) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 por cento) e CD45RA mais CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 por cento) fenótipo. No tecido saudável, quase nenhuma (0,6 por cento) células T CD8 foram detectadas com um fenótipo TN e apenas algumas (0,8 por cento) apresentaram um fenótipo Tax. Em contraste, as células T CD8 detectadas no tecido renal saudável eram compostas de considerável TEv1-(22 por cento), TEM2-(12 por cento), Tpx3-(18 por cento), TEx{ {65}} (23 por cento) e populações de células T TEyRA(11 por cento) (Figura ld e Figura S4). Ao observar as células T CD4 no sangue, as maiores populações foram aquelas expressando Ty-(35 por cento), TcM-(25 por cento), TEMl-(16 por cento), TFM2-(9 por cento), e uma população com um fenótipo CD45RAtCCR não especificado de outra forma7-CD28 mais CD27* (0,4 por cento) (Figura 1d e Figura S4). No tecido renal saudável, poucas células T CD4 expressaram um TN-(3 por cento) ou um TcM fenótipo -(3 por cento). Em vez disso, um número substancial de células com um fenótipo TEM1-(22 por cento), TEM2-(40 por cento) ou TEM4(14 por cento) foi detectado em tecido saudável (Figura ld e Figura S4) . Em conclusão, a distribuição de subconjuntos de células T CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definidos difere substancialmente entre o sangue e o tecido renal saudável.
3.3. Células T CD8 e CD4 em tecido renal humano saudável com mais frequência compreendem células de ciclo ativoEm seguida, investigamos se existem diferenças na expressão de marcadores típicos de um perfil de memória efetora citotóxica, entre populações de células T CD8 e CD4 no sangue e no tecido renal. Primeiro, analisamos a expressão dos fatores de transcrição T-box T-bet e eomeso-dermina(Eomes). Esses reguladores transcricionais estão diretamente envolvidos na geração de células efetoras de fase aguda, induzindo a expressão de moléculas como interferon-y e granzima B, e na geração de respostas de memória secundária. Como esperado, a expressão de T-bet foi frequente entre as células T CD8 circulatórias (54 por cento), enquanto as células T CD4 circulatórias raramente expressaram este fator de transcrição (13 por cento). Curiosamente, para as células T CD4, a expressão de T-bet foi significativamente maior entre as células T detectadas no tecido renal saudável do que na circulação (53 por cento vs 13 por cento). Alguma expressão também foi detectada com frequência entre as células T CD8 circulatórias (59 por cento), sendo novamente rara entre as células T CD4 circulatórias (15 por cento). No entanto, a expressão de Eomes foi mais frequente entre as células T CD4 no tecido renal (32 por cento) do que no sangue (Figura 2a,b).
Em seguida, investigamos a expressão da granzima B, uma serina protease que é conhecida por mediar a apoptose após injeção no citoplasma por células T citotóxicas. De acordo com relatórios anteriores, a expressão de T-bet e granzima B foi detectada em números substanciais em células T CD8 circulantes (28 por cento). No entanto, sua expressão foi rara entre as células T CD4 circulantes (1 por cento). Para as células T CD8, a expressão da granzima B foi semelhante no tecido renal e nas populações circulantes (28 por cento ys.23 por cento) (Figura 2c). Curiosamente, as maiores frequências de expressão de T-bet e Eomes detectadas em células T CD4 renais não corresponderam a uma maior frequência de expressão de granzima B neste compartimento (5 por cento). Em seguida, analisamos a expressão de KLRGl, um receptor coinibitório conhecido por ser predominantemente expresso por células efetoras de fase aguda citotóxica e células efetoras de memória. KLRG1 foi expresso frequentemente por células T CD8 circulantes (54%), mas não por células T CD4 ( 10 por cento ). Não foram encontradas diferenças entre os compartimentos anatômicos na expressão de KLRG1l para células T CD8 ou CD4. Por fim, investigamos a expressão de Ki-67, um marcador que denota células em ciclo ativo. De acordo com observações anteriores, a expressão de Ki-67 entre as células T CD8 e CD4 circulantes foi rara (1 por cento e 2 por cento, respectivamente). Curiosamente, entre as células T CD8, mas particularmente entre as células T CD4, a expressão de Ki{29}} foi significativamente mais detectada em células T no tecido renal (3 por cento e 11 por cento, respectivamente) (Figura 2e). Em conclusão, as células T CD4 foram detectadas em tecido renal humano saudável, mas não as células T CD8 neste compartimento, T-bet e Homes expressos com mais frequência. No entanto, isso não se traduziu em uma expressão mais frequente de granzima B pelas células T CD4 renais. Além disso, embora o número total de células cíclicas fosse baixo, o tecido renal continha células T CD8 e CD4 cíclicas significativamente mais ativamente do que a circulação.
3.4. As células T CD8 e CD4 no tecido renal saudável são quase todas CXCR3-PosiçãoEm seguida, procuramos diferenças na expressão de outros marcadores, típicos em populações circulantes de células de memória não imediatamente citotóxicas, como mostrado anteriormente para populações de células T circulantes. Primeiro analisamos a expressão de IL-7R , expressa principalmente em células de memória ingênuas e precocemente diferenciadas na circulação, onde está envolvida na sustentação da proliferação homeostática [10,12,13]. No sangue periférico, IL-7Ra foi expresso frequentemente por células T CD8 (84 por cento ) e células T CD4 (98 por cento ). As células T CD8 e CD4 no tecido renal saudável expressaram esse marcador com uma frequência significativamente menor do que as células T circulantes (71 por cento e 76 por cento, respectivamente) (Figura 2f).
Em seguida, investigamos a expressão de vários outros receptores de quimiocina Curiosamente, CXCR3, um receptor de quimiocina envolvido no tráfego de células T para tecidos inflamados[14-17], foi expresso por um número extremamente grande de células T CD8 e CD4 no tecido renal(99 por cento e 91 por cento, respectivamente), e significativamente menos frequentemente pelas células T circulantes (58 por cento e 26 por cento, respectivamente) (Figura 2g). Por fim, determinamos a expressão de CXCR6, conhecida por estar implicada na formação de populações de TRM [18-22]. Enquanto CXCR6 foi expresso por apenas uma pequena população de células T CD8 circulantes (16 por cento), e virtualmente não por células T CD4 circulantes. uma proporção significativamente maior de células T CD8 e CD4 no tecido renal expressou esta molécula (40 por cento e 40 por cento, respectivamente) (Figura 2h). Em conclusão, os marcadores normalmente associados a um estado não imediatamente diferenciado na circulação, provavelmente-7Ra, CCR7, CD28 e CD27, foram significativamente menos expressos pelas células CD8 e T do rim quando comparados aos do sangue. Em contraste, as células T renais expressaram mais frequentemente CXCR6 e quase sempre expressaram CXCR3.
3.5. As distinções no fenótipo entre rim saudável e células T de aloenxerto são mínimasEm seguida, queríamos investigar se esses achados permaneciam em tecido de aloenxertos renais transplantados que foram obtidos para várias indicações clínicas (Tabela 1).Com relação ao número de células T CD8 e CD4 em tecido saudável e aloenxerto, não foram observadas diferenças (Figura 3a). No entanto, notamos uma tendência não significativa de mais células CD4T e menos células CD8T no tecido saudável do que no tecido aloenxerto (Figura 3b). Além disso, ao analisar a expressão CD69/CD103 e os subconjuntos definidos CD45RA/CCR7/CD28/CD{11}}não há diferenças na distribuição de CD69/CD103- ou CD45RA/CCR7/CD28/CD27- subconjuntos definidos foram anotados, independentemente do fenótipo CD8/CD4 (Figura 3d e Figura S5). Ao examinar as frequências de expressão dos marcadores mais típicos para células T circulantes citotóxicas, não encontramos diferenças na expressão de T-bet, KLRG1 ou granzima B entre células T de rim saudável ou aloenxerto (Figura 3a,gh). Descobrimos que a expressão de Eomes foi vista com menos frequência em células T CD4 de tecido de aloenxerto, do que em células T de tecido saudável (Figura 3f). Não foram observadas diferenças na expressão dos outros marcadores. (Figura 3-le Figura S5b-d). Em conclusão, além de uma menor frequência de expressão de Eomes entre as células T CD4 de aloenxerto, as populações de células não diferiram entre as populações do estudo.
3.6. CD69-CD103-As células T no tecido renal são diferentes das células circulantesDada a composição fenotípica semelhante de células T CD8 e CD4 encontradas em tecido renal saudável e em tecido de aloenxerto renal, reunimos dados de ambos os grupos de estudo para examinar melhor as características dessas células de acordo com a expressão de CD69 e CD103. Como as células CD69-CD103 plus sempre foram detectadas em frequências muito baixas(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Primeiro, investigamos as diferenças nesses subconjuntos de acordo com a co-expressão de CD69/CD103 em populações de células T renais (Figura 4 e Figura S6). Curiosamente, para as células T CD8 e CD4, diferenças substanciais foram observadas na distribuição de subconjuntos CD45RA/CCR7/CD28/CD{10}}definidos entre CD69-CD103-,CD69 mais CD{ {14}}e subconjuntos CD69*CD103*. Para células T CD8, as células CD69-CD103- continham uma população considerável de células TeyRA (21 por cento) que era muito menor entre os subconjuntos CD69 mais CD103- e CD69 mais CD103 (5,8 por cento e 2,2 por cento, respectivamente). Em vez disso, essas últimas populações continham subpopulações muito maiores TEy3 (13 por cento, 30 por cento e 32 por cento, respectivamente) e TEy4 (8 por cento, 19 por cento e 33 por cento, respectivamente). Para células T CD4, poucas células TEyRA foram observadas entre os subconjuntos CD69-CD103-, CD69*CD103- e CD69 mais CD103* (2,6 por cento, 0 por cento e 1,7 por cento, respectivamente). Em vez disso, essas células continham grandes subpopulações de células TFw1 (26 por cento, 24 por cento e 10 por cento, respectivamente) e TEy2 (30 por cento, 46 por cento e 27 por cento, respectivamente). Entre CD69 mais CD103-e particularmente entre as células CD69*CD103*, uma subpopulação TEM4 muito maior foi observada (6%, 11% e 34%, respectivamente).
Dadas essas distinções e a observação anterior de que as populações de células T do rim mal compreendiam células TN e TcM, investigamos ainda mais as células CD69-CD103- encontradas no tecido renal para determinar até que ponto essas células eram não apenas as células circulantes que passam pela circulação renal. Para isso, comparamos essas células com células circulantes. As células CD69-CD103~ no tecido renal diferiram significativamente daquelas na circulação: T-bet, Ki-67 e CXCR3 foram expressos com mais frequência por células T renais, independentemente do fenótipo CD8/CD4 (Figura 5a-c). Em contraste, IL-7R , CCR7, CD28 e CD27 foram todos expressos com uma frequência significativamente menor por células T renais CD69-CD103-, independentemente do fenótipo CD8/CD4 (Figura 5d- g). CD69-CD103-As células T CD4 no tecido renal expressaram KLRG1 significativamente mais frequentemente do que no sangue e as células T CD69-CD103-CD8 no tecido renal expressaram Eomes significativamente mais frequentemente do que em sangue.
Em seguida, queríamos ver como a coexpressão de CD69 e CD103 afetava os marcadores de potencial funcional. Primeiro, analisamos os marcadores associados ao potencial citotóxico. Embora tenham sido observadas diferenças entre subpopulações individuais, nenhum padrão consequente foi observado para T-bet e Eomes em células T CD8 quando CD69 ou CD103 foram coexpressos (Figura 6a,b). Em contraste, em células T CD4, esses fatores de transcrição aumentaram juntamente com Coexpressão de CD69 e CD103 (Figura 6a,b). Ao olhar para KLRG1, notamos que para células T CD8, a expressão de KLRG1 diminuiu juntamente com a coexpressão de CD69/CD103. Para células T CD4 foi observada uma tendência semelhante. No entanto, aqui apenas as células CD69-CD103-expressaram KLRG1 em uma frequência mais alta do que as células CD69 mais CD103- e CD69 mais CD103* (Figura 6c). As frequências de expressão da granzima B também diminuíram juntamente com os marcadores de residência no tecido, com sua frequência de expressão sendo mais baixa entre as células CD69 mais CD103*, tanto nas células T CD8 quanto nas CD4 (Figura 6d). A expressão de Ki-67, que foi maior entre as células T renais quando comparada às células T no sangue, não diferiu de acordo com a coexpressão de CD69 ou CD103 (Figura 6e).
Em seguida, investigamos marcadores normalmente associados a um perfil de memória não citotóxico de acordo com a coexpressão CD69/CD103. A expressão de IL-7Ra, CCR7 e CD28 foi mais alta nas populações de CD69-CD103-, com uma tendência na definição de expressão junto com a coexpressão de CD69/CD103 (Figura 6f-h ). Em seguida, analisamos a expressão de CXCR3 e CXCR6. Ambos os receptores de quimiocinas foram mais frequentemente expressos por células CD69tCD103t, independentemente do fenótipo CD8/CD4, e mostraram uma tendência ascendente com a coexpressão de CD69/CD103. Somente para CXCR6, essa tendência foi estatisticamente significativa, afetando tanto os Tells CD8 quanto os CD4 (Figura 6j,k). Em conclusão, as células CD69-CD103- no tecido renal diferem substancialmente das células na circulação e podem dizer respeito a outra população de TBv não marcada pela expressão de CD69 ou CD103. O único marcador que diferiu consistentemente, independentemente do fenótipo CD8/CD4, em termos de coexpressão de CD69 e CD103, foi o CXCR6.
3.7. Células T no tecido renal mais frequentemente produzem interferon- do que células T no sangueFinalmente, investigamos a capacidade de produção de citocinas por populações de células T CD8/CD4-definidas no tecido renal. Primeiro, comparamos a produção de interferon-y (IFNy), fator de necrose tumoral (TNF), interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e IL-17 por populações de células T definidas por CD8/CD4-estimuladas encontradas no sangue para aquelas no tecido renal saudável (Figura 7a-e). Curiosamente, apenas IFNy foi consistentemente expresso por uma maior proporção de células T no tecido renal saudável, quando comparado às células T no sangue, independentemente do fenótipo CD8/CD4 (Figura 7a). As diferenças também foram notadas em um nível de subconjunto individual. Especificamente, TNF e GM-CSF foram produzidos com mais frequência por células T CD4 no tecido renal (Figura 7b.c). Com relação à polifuncionalidade (ou seja, o número de citocinas produzidas simultaneamente), as células T CD4 no tecido renal foram mais polifuncionais do que as células CD4 no sangue (Figura 7f).
Em seguida, analisamos as diferenças na capacidade de produção de citocinas entre células T estimuladas de tecido saudável e de aloenxerto. Não foram detectadas diferenças na produção de citocinas individuais ou em várias citocinas produzidas simultaneamente entre células T de tecido renal saudável ou de aloenxerto (Figura S7). Uma vez que CD69 é expresso após estimulação de células T, estudamos apenas a diferença entre células T CD103-negativas e CD103- que expressam CD4 e CD8 (Figura 7g-). Ao comparar células T CD4 e CD8 que expressam CD103 com células que não expressam CD103 no tecido renal, notamos que as células CD8 e CD4 CD103 expressaram mais IFNy do que células CD{15}}(Figura 7g). Além disso, embora as células produtoras de IL-1ZA fossem baixas entre as células T CD103 mais CD8 e CD4 no tecido renal, elas foram consistentemente encontradas com mais frequência nessa população em comparação com a população CD103-. Em conclusão, mais células T' no tecido renal produziram IFNy quando comparadas às células T circulantes, independentemente do fenótipo CD8/CD4. De fato, a maior porcentagem de células produtoras de IFNy foi encontrada entre as células T derivadas de rim CD103-expressando CD4 e CD8. Além disso, as células T em aloenxertos renais não diferiram daquelas em tecido renal saudável em relação a esses parâmetros.
4. Discussão
No presente estudo abordamos a diversidade de subconjuntos de células T, de acordo com a expressão de CD8 e CD4, e os marcadores de residência tecidual, CD69 e CD103, em rins humanos e comparados a estes ao sangue. Números substanciais de células T CD8 e CD4 foram de fato detectados no tecido renal. Além disso, essas células T nos rins continham um número considerável de células CD69*CD103-. Células CD69 plus CD103 plus também foram detectadas, mas predominantemente entre as células T CD8 e praticamente inexistentes entre as células T CD4. Um achado semelhante dizia respeito ao TRM pulmonar anteriormente [23]. Como esperado, essas populações que expressam CD69 e CD{15}}estavam quase ausentes da circulação. Uma diferença marcante ao comparar as células T do rim com as do sangue diz respeito a uma distribuição distinta dos subconjuntos tradicionais CD45RA/CCR7/CD28/CD{19}}definidos. Curiosamente, a expressão de CD28 não foi mais frequentemente expressa quando as células T estavam coexpressando CD69 sozinho ou em combinação com CD103. Teoricamente, isso deve tornar essas populações menos suscetíveis a sinais coestimulatórios por CD80 e CD86. Outras diferenças diziam respeito a uma maior frequência de expressão de CXCR3, CXCR6 e Ki-67. Além disso, as células T renais continham mais frequentemente células produtoras de IFNy e eram frequentemente polifuncionais. De fato, dentro do rim, CD103 mais Tpys continham mais células produtoras de IFN do que suas contrapartes CD{31}}negativas. Além disso, as células CD103T produziram mais frequentemente IL-17, embora isso diga respeito a uma população modesta.
CISTANCHE VAI MELHORAR A INFECÇÃO RENAL/RENAL
No que diz respeito à expressão mais frequente de CXCR3 por células T renais CD8 e CD4, o eixo CXCR3/CXCL10 foi previamente demonstrado estar envolvido na formação de populações de TpM na pele, fígado e tecido linfóide [24-28]. Além disso, está envolvido no tráfego para o epitélio estressado e inflamação em um sentido geral [14-17]. Dadas as altas frequências de CXCR3 entre essas células T no tecido renal saudável, o CXCR3 parece estar implicado na homeostase do TRM no tecido renal e pode não necessariamente envolver inflamação ou sinais de perigo para fazê-lo. No que diz respeito ao CXCR6, o eixo CXCR6/CXCL16 já demonstrou ser essencial para o tráfego de Tpst para diferentes compartimentos como pulmões, pele, fígado e cérebro, e pode dizer respeito a um mecanismo universal essencial para guiar e reter TRM para e em tecidos, também em relação a TRM em tecido renal humano [18-22].
Farber e colaboradores caracterizaram e compararam extensivamente as populações de CD8 e CD4 TRM que residem em diferentes tipos de tecidos humanos derivados de doadores de órgãos. Eles descreveram como as populações de TRM no pulmão, baço, intestino delgado e vários tecidos linfoides secundários diferem em relação ao transcriptoma, mas também à expressão de várias proteínas, incluindo citocinas, investigadas no estudo atual [29-31. No entanto, essas investigações não abrangeram populações de TRM no rim humano, e os dados sobre este
assunto é escasso. Anteriormente, mostramos que as células T CD8 direcionadas às proteínas do poliomavírus BK VP1 e LTAG, derivadas de um vírus que possui um forte tropismo por células epiteliais renais, são detectáveis em rins de aloenxerto. Essas células T específicas de vírus expressaram CD69 e CD103 em maior número do que suas contrapartes encontradas na circulação dos mesmos pacientes. Além disso, essas células T geralmente expressavam um fenótipo negativo para CD45RA-CD27-granzima B[5]. Mais tarde, outros também relataram populações de TRM em tecido renal humano obtido de nefrectomias de transplante. Nesta publicação, os autores relatam que as células T nestes tecidos dizem respeito principalmente às células T CD8 [321. Em vez disso, descobrimos que as células T CD4, de fato, compreendiam o maior subconjunto de células T. No entanto, também descobrimos que o equilíbrio mudou, embora não significativamente, para um maior número de células T CD8 no tecido do aloenxerto quando comparado ao tecido renal saudável. Dessa forma, essa discrepância pode ser explicada por um grupo de estudo diferente, e pode ser que, na saúde, a defesa imunológica esteja mais focada em ameaças extracelulares, como bactérias, versus ameaças mais intracelulares, como vírus e câncer em hospedeiros imunocomprometidos. Não encontramos outras diferenças nos marcadores estudados, entre células T de rim saudável e aloenxerto. No entanto, mais pesquisas, usando técnicas com uma visão mais ampla sobre transcriptomas, como sequenciamento de RNA, ou proteoma, como espectrometria de massa, devem ser empregadas para estabelecer se esse é realmente o caso.
Além disso, de Leur et al. descrevem como o TRM nos rins frequentemente expressa granzima B, enquanto detectamos apenas pequenas quantidades de granzima B em tecido renal saudável e aloenxerto [32]. No entanto, detectamos células T substanciais que expressam T-bet e Eomes no tecido renal, o que em populações de células T circulantes está normalmente associado a uma maior expressão de granzima B [10]. Embora o último possa não ser surpreendente, dado o fato de que a expressão da granzima B também é induzida diretamente por T-bet [33,34], essa associação não foi aparente entre as células T renais no estudo atual. Como nós e outros mostramos que também o TRM humano derivado do pulmão, cérebro e pele [25,26,3536], bem como os MAIT ælls 【6,7】 residentes em tecidos derivados do rim são baixos em sua granzima B conteúdo, embora muitas vezes expresse quantidades substanciais de T-bet e Eomes, isso pode ser um traço comum de TkM (humano). Além disso, no pulmão TRM a expressão da granzima B foi rapidamente regulada para cima após estimulação [35l, sugerindo que isso também pode ocorrer em outros TeM. Aqui, os autores levantaram a hipótese de que essa 'citotoxicidade oculta serve para proteger a integridade estrutural dos tecidos de danos causados por células T citotóxicas.
Em conclusão, mostramos que as células T no tecido renal estão presentes em números substanciais e compreendem populações que frequentemente expressam CD69 plus e CD103 plus, moléculas pelas quais as células T aderem e persistem nos tecidos. No entanto, as células T CD69-CD103- no tecido renal parecem ser distintas das células T circulantes e podem se referir a outra população TiM distinta, possivelmente persistindo nos rins por outros mecanismos ainda a serem desvendados. Outra opção pode ser que essas células CD69-CD103-T digam respeito a uma população que apenas recentemente saiu da circulação, e que adquiriu apenas transitoriamente novas características fenotípicas devido a uma interação com o microambiente renal. Mais investigações nessa população são necessárias para elucidar essas possibilidades. Além disso. Células T renais CD8 e CD4 estavam frequentemente ciclando ativamente e expressavam CXCR6 com mais frequência. Além disso, as populações de CD8 e CD4 deslocaram uma expressão particularmente alta de CXCR3, implicando fortemente esses receptores de quimiocina, bem como CXCR6 no acúmulo de TRM e persistência em rins humanos. Portanto, mais investigações são necessárias para melhorar nossa imagem das populações de Tpv no rim humano. No entanto, os resultados apresentados aqui formam um primeiro passo sólido para uma caracterização mais detalhada das populações de células T no tecido renal e seu papel na saúde e na doença.
