ABSTRATO

A tirosinase é uma enzima importante no controle da formação de melanina nos melanossomas e desempenha um papel fundamental na pigmentação do cabelo e da pele. A expressão ou ativação anormal da tirosinase está associada a várias doenças, como albinismo, vitiligo, melanoma e doença de Parkinson. A deposição excessiva de melanina pode causar doenças como sardas e manchas marrons no corpo humano, e também está intimamente relacionada ao escurecimento de frutas e vegetais e muda de insetos. Detectar e inibir a atividade da tirosinase é de valor extraordinário no progresso do diagnóstico e tratamento dessas doenças. Portanto, muitas sondas de detecção óptica seletiva e pequenos inibidores moleculares foram desenvolvidos e fizeram contribuições significativas para a pesquisa básica e clínica dessas doenças. Neste trabalho, a detecção e inibição da tirosinase e sua aplicação em produtos clareadores são revisadas, com ênfase especial no desenvolvimento de sondas fluorescentes e inibidores. Esperançosamente, esta revisão ajudará a projetar sondas e inibidores de tirosinase mais eficientes e sensíveis, bem como lançar luz sobre novos tratamentos para doenças como o melanoma.

De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante,anti-inflamatório, epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche epelebranqueamentoreside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada portirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, então os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importanteafetando melaninaProdução. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, assiminibindomelaninaProdução.

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Palavras-chave:

1. Introdução

A tirosinase (EC 1.14.18.1; catecol oxidase; polifenol oxidase [1] ou difenolase) é considerada a enzima contendo cobre mais importante na formação da melanina. A tirosinase pode catalisar a hidroxilação e subsequente oxidação da unidade monofenol a ortoquinona sob a ação do oxigênio molecular. É encontrado nos melanossomas, local de síntese, armazenamento e transporte da melanina. Os valores de pH de melanossomas leves e severamente melanizados são cerca de 4,5 e 3, respectivamente. O pH ótimo para a atividade da tirosinase é 6,8 [2]. Raper [3] e Mason [4] foram os primeiros a esclarecer as vias biossintéticas de formação de melanina em vários organismos, que foram recentemente embelezadas por Schallreuter et al. [5] e Cooksey et al. (Fig. 1) [6].

A tirosinase é amplamente encontrada em plantas, animais e microrganismos. Dado o envolvimento da tirosinase na patogênese do melanoma, o monitoramento e a regulação farmacológica de sua atividade auxiliarão no diagnóstico e tratamento da doença [7]. As sondas foram desenvolvidas para detectar especificamente a atividade da tirosinase em ambientes fisiológicos. Inibidores que poderiam tornar a tirosinase inativa também foram desenvolvidos, e alguns deles foram usados ​​clinicamente para tratar doenças. Por exemplo, ácido kójico e arbutina [8], como inibidores específicos da tirosinase, foram utilizados clinicamente como produtos clareadores. Com os avanços na descoberta de drogas, um número crescente de compostos eficazes que podem detectar/inibir a atividade da tirosinase foi projetado e sintetizado recentemente. Isso facilitaria muito o progresso do diagnóstico e tratamento dessas doenças resultantes da produção aberrante de melanina. Nesta revisão, discutiremos o progresso no desenvolvimento de sondas e inibidores baseados em pequenas moléculas para a atividade da tirosinase endógena. Esperançosamente, isso nos ajudará a aprender mais sobre a tirosinase e a encontrar mais compostos funcionais direcionados/reguladores da tirosinase.

2. Estrutura da tirosinase

O sítio ativo da tirosinase apresenta uma estrutura de centro de cobre dual-core composta por dois íons de cobre (Fig. 2), que se ligam a resíduos de histidina na proteína. Os dois centros de íons de cobre são conectados por uma ponte de coordenação endógena. A tirosina e outras substâncias são complexadas com a enzima, através da ligação entre o centro ativo da enzima e o grupo hidroxila. No processo da reação catalítica da melanina, o sítio catalítico é categorizado em três formas: estado de oxidação (Eoxy), estado de redução (Emet) e estado de desoxigenação (Edeoxy), a diferença está na estrutura do centro ativo do íon de cobre binuclear (Figura 2).

O epóxi é composto por dois átomos quadrados de cobre (II); cada átomo é formado por dois equadores fortes e o ligante é um NH axial mais fraco [9]. A molécula de oxigênio exógeno liga e liga os dois centros de cobre na forma de peróxidos. O comprimento da ligação CueCu é de cerca de 0,35 nm. A combinação de moléculas de oxigênio leva à formação da estrutura (m-h2:h2 -peroxo) [10], então o centro ativo Eoxy pode ser escrito como [Cu(II)eO2eCu(II)]. A estrutura eletrônica dos peróxidos desempenha um papel crucial nas funções biológicas do Eoxy. Devido à forte ação do aceptor s*, o peróxido tem uma carga menos negativa, enquanto o aceptor de elétrons p interage com os elétrons no orbital s* do peróxido, o que enfraquece muito a força da ligação oxigênio-oxigênio, tornando o núcleo do centro ativo da tirosinase facilmente quebrável [9]. Mettirosinase (Emet) é semelhante a Eoxy e também contém dois átomos tetragonais de cobre (II) acoplados através de uma ponte endógena. A diferença é que o ligante ponte entre os íons de cobre é hidróxido em vez de peróxido [2]. Em termos de propriedades oxidativas, Emet e Eoxy também são ligeiramente diferentes. Emet não é capaz de oxidar compostos monofenólicos. Na ausência de substratos, Emet existe como a forma principal nos organismos. A desoxitirosinase (Edeoxy), semelhante à desoxi hemocianina, tem uma estrutura simétrica [(Cu(I)eCu(I)].

3. Mecanismo de ação da tirosinase

Embora os pesquisadores tenham realizado estudos aprofundados sobre a tirosinase e suas proteínas relacionadas, o mecanismo de sua reação catalítica ainda é controverso. Por exemplo, a atividade catalítica no mesmo sítio ativo da tirosinase é diferente. O centro catalítico da tirosinase contém um centro de cobre binuclear, denominado Cu(A) e Cu(B), respectivamente. Cada íon de cobre no centro ativo é coordenado com três diferentes resíduos de histidina. Há uma grande diferença entre a atividade do micofenolato e a atividade da difenolase, e a tirosinase reduzida tem uma fase lag ao reagir com o monofenol. Estes são tópicos importantes que precisam ser continuamente explorados e estudados [11].

A reação entre a tirosinase e substratos relacionados ocorre principalmente através da formação de uma ligação de coordenação efetiva entre o grupo hidroxila no substrato e o centro ativo da tirosinase. Oliveiras e cols. [12] propuseram que Eoxy e substratos adequados em mamíferos desencadeiam atividade de micofenolato e atividade de difenolase. Durante a atividade do micofenolato, os monofenóis (L-Tirosina) são oxidados para formar o-quinonas (o-dopaquinona), um importante precursor da melanina, e Edeoxi. Durante a atividade da difenolase, Eoxy e Emet também podem oxidar o-difenóis (L-DOPA) para produzir o-dopaquinona [13]. Esse mecanismo é geralmente aceito pelos pesquisadores, pois pode refletir com mais precisão as características cinéticas da tirosinase, na qual a etapa limitante da taxa na produção de melanina é o ciclo do monofenol [14].

3.1. Mecanismo de atividade do micofenolato

Durante a síntese de melanina, a principal função da enzima é oxidar substratos monofenólicos a o-quinona por Eoxy. Este processo é uma característica importante que distingue a tirosinase de outras oxidorredutases, como a catecol oxidase. Durante o ciclo do monofenol (Fig. 2), o átomo de oxigênio no fenol desprotonado é coordenado com o íon cobre do centro ativo da tirosinase oxidada para formar o complexo micofenolato Eoxy (EoxyM), e então o fenol é substituído ortoeletrofilicamente pela difenolase Emet complexo (EmetD). EmetD passa por um processo de clivagem para gerar diretamente o-quinona e Edeoxi. Edeoxy combina diretamente com moléculas de oxigênio para reformar Eoxy. Este é o processo cíclico da atividade do micofenolato. Este processo não termina até que a reação do substrato esteja completa. No processo de reação do ciclo do monofenol, se o Emet no estado natural encontrar um substrato de monofenol, ele sofrerá uma reação de oxidação extremamente lenta e impedirá o andamento normal da reação do monofenol. Portanto, esse período é chamado de 'período de latência' porque a própria Emet não pode se ligar às moléculas de oxigênio [12].

3.2. Mecanismo da atividade da difenolase

4. Função da tirosinase

A tirosinase faz parte da família do cobre tipo 3 e existe no processo inicial de formação da melanina. Participa principalmente dos seguintes dois processos de reação [17]: (1) hidroxilação de L-tirosina a L-DOPA; (2) oxidação de L-DOPA para formar dopaquinona. A dopaquinona acabará por formar melanina através de uma série de reações. Os outros dois membros da família do cobre tipo 3 são catecol oxidase e hemocianina. A catecol oxidase exibe apenas atividade de difenolase e a hemocianina está na linfa de muitos moluscos e artrópodes portadores de oxigênio. Embora os centros ativos das proteínas da família do cobre tipo 3 sejam conservados em termos de estrutura total e capacidade de conectar moléculas de oxigênio, suas atividades potenciais enzimáticas são ligeiramente distintas devido à variabilidade da ligação do substrato ao centro enzimático ou à incontrolabilidade que o substrato pode alcançar.

Além de participar do processo de produção de melanina, a tirosinase também possui outras funções fisiológicas importantes. Em esponjas, plantas e alguns invertebrados, a tirosinase está envolvida principalmente no processo de cicatrização de feridas e resposta imune primária [18]. Em artrópodes, a tirosinase pode promover o processo de endurecimento do estrato córneo de animais após a muda. A tirosinase bacteriana pode ser secretada no solo e participar do processo de acoplamento aleatório de diferentes compostos aromáticos para formar o húmus. E descobriu-se que a tirosinase também pode ser um antídoto potencial para substâncias tóxicas do benzeno [13,19]. Além disso, desempenha um papel indispensável na eliminação de plantas parasitas contra bactérias simbióticas fenólicas, na produção de pigmentos naturais e na síntese de antibióticos de aminoácidos, como a lincomicina. O ponto comum desses efeitos é inseparável da tirosinase usando reações redox com moléculas de oxigênio [11].

5. Doenças relacionadas à tirosinase

A distribuição da tirosinase está intimamente ligada às funções fisiológicas de plantas e animais. Geralmente acredita-se que as cores das penas, cabelos, olhos, epiderme de insetos, sementes e outros pigmentos são resultados da tirosinase [10]. A tirosinase tem funções variadas, mas importantes, em diferentes organismos. Na maioria dos insetos sob condições fisiológicas normais, a tirosinase existe na forma de zimogênio, e diferentes tipos de tirosinase existem em partes específicas dos insetos para completar funções fisiológicas específicas [20]. Além de participar da produção de melanina, a tirosinase do inseto é a única enzima envolvida na ceratose. A queratina endurecida por insetos pode bloquear a invasão de microorganismos e corpos estranhos e proteger o corpo mole dos invertebrados. Em artrópodes, a tirosinase também participa de dois outros processos fisiológicos importantes, a saber, resposta de defesa e cicatrização de feridas. A melanina produzida pela tirosinase em mamíferos é secretada nos queratinócitos da epiderme e do cabelo, descolorindo a superfície do corpo, protegendo a pele e os olhos, resistindo à radiação ultravioleta e evitando o superaquecimento dos tecidos internos [10]. A tirosinase encontrada em mamíferos é comumente descoberta em melanócitos, que são células altamente específicas que existem na pele, folículos pilosos e olhos para produzir pigmentos [4,21]. Quando a função da tirosinase é reduzida ou ausente, ela afetará o metabolismo da melanina e causará doenças como epilepsia e albinismo. Doenças autossômicas recessivas em animais e humanos também estão relacionadas à perda de tirosinase ou diminuição da atividade [22].

6. Sondas de tirosinase

As sondas são substâncias que reconhecem especificamente o alvo e liberam sinais detectáveis ​​que refletem a presença e a atividade do alvo. O método colorimétrico tradicional para análise de tirosinase tem sido limitado devido à sua baixa sensibilidade [23]. A princípio, vários outros métodos de detecção baseados em eletroquímica e nanopartículas de ouro foram relatados pelo grupo de Willner [24e27], o que não apenas aumenta a versatilidade da detecção, mas também atualiza muito a colorimetria em termos de sensibilidade. Uma estratégia fluorescente também foi introduzida para projetar sondas de tirosinase altamente sensíveis, como mostrado na Fig. 3. Pontos quânticos inicialmente desenvolvidos e sondas fluorescentes de polímero conjugado podem ser aplicados para monitorar a atividade da tirosinase [28]. No entanto, sondas fluorescentes de moléculas pequenas são particularmente atraentes por causa de suas vantagens especiais, como sensibilidade, especificidade e compatibilidade. Em 2008, a equipe de Zhu sintetizou um novo oligo solúvel em água (fenilenovinileno) (Pr1) como um fluoróforo FL contendo ogiva de tirosina (WH) como uma sonda fluorescente para tirosinase. Foi demonstrado que Pr1 é adequado para detectar a atividade da tirosinase até agora em uma solução tampão aquosa, mesmo em gel de agarose [29]. Primeiro, uma sonda fluorescente de infravermelho próximo (NIR) baseada em cianina (Pr2) foi usada para monitorar a atividade da tirosinase em 2010 por Ma et al. [30]. A mudança de cor significativa antes e depois da reação pode ser detectada a olho nu. No entanto, essas sondas também mostram um modo de desligamento causado pela fração quinona gerada pela oxidação catalisada pela tirosinase. Para uso funcional, no entanto, a melhor abordagem é implementar um bioensaio no modo de ativação devido à sua sensibilidade e maior adequação para bioimagem da tirosinase em sistemas vivos. Em 2010, Kim et al. [31] propuseram uma sonda fluorogênica baseada em BODIPY para detectar a atividade da tirosinase endógena em células de melanoma vivas (Pr3, Fig. 4). Com base em pesquisas anteriores de tirosinase aplicadas para remover os grupos protetores de aminas [32], Yan et al. [33] prepararam sondas de tirosinase, Pr4 e Pr5, nas quais um grupo fenol e um grupo naftilamina foram conectados por meio de uma ligação de ureia em 2012. É importante ressaltar que Pr4 foi a primeira sonda fluorogênica ativada por dois fótons projetada para detectar a atividade da tirosinase em tampão aquoso e células vivas. Em 2013, Wang et al. [34] mostraram que a sonda fluorescente baseada em NBD-NH2-(Pr6 e Pr7) contendo frações de fenol (WH) pode ser usada para detectar a atividade da tirosinase e rastrear possíveis inibidores de tirosinase com um "ligar" estratégia. No entanto, não há nenhum experimento biológico relacionado à imagem celular neste trabalho. Em 2016, Li e seus colegas projetaram um grupo de novas sondas baseadas em 7- amino-4-(trifluorometil)-cumarina como um fluoróforo FL e as sintetizaram, Pr8-11, com distâncias variáveis ​​entre FL fluoróforo e fenóis. Verificou-se que Pr9 é uma sonda fluorogênica altamente sensível e seletiva para geração de imagens de células vivas de melanoma [35]. Em 2018, a equipe de Wu foi a primeira a usar uma sonda fluorescente FL (Pr12) para diagnosticar melanoma precoce em modelos de camundongos roedores (Figs. 4 e 5A). A sonda pode ser ativada por oxidação mediada por tirosinase e então hidrolisar ligações de uréia para produzir um sinal de fluorescência. Ao mesmo tempo, também pode monitorar o nível de tirosinase endógena em células vivas e peixe-zebra de forma sensível e seletiva (Fig. 5 B/C) [36].

Em 2016, o grupo de Ma [37] desenvolveu uma nova sonda fluorogênica chamada Mela-TYR (Pr13, Fig. 4) para direcionar melanossomas para detectar a atividade da tirosinase. O Pr13 foi projetado incorporando ftalimida com morfolina e uréia derivada de 4-amino-fenol. A sonda mostra uma resposta de ativação altamente sensível e seletiva à tirosinase por meio de uma reação de clivagem de oxidação. As sondas de fluorescência descritas acima continham principalmente um grupo 4-hidroxifenil como fração de reconhecimento (WH) e mostraram resposta de fluorescência paralela a várias espécies reativas de oxigênio (ROS) e tirosinase, portanto, interferidas por ROS. O grupo de Ma descobriu uma nova fração de reconhecimento de tirosinase, 3-hidroxi benziloxi (WH), que mostrou diversos mecanismos de reação para tirosinase e ROS [38]. Uma sonda de fluorescência NIR (Pr14, Fig. 4) foi desenvolvida instalando 3- hidroxi benziloxi em um fluoróforo NIR (HXPI) e mostrou uma resposta off-on altamente específica à tirosinase em vez de ROS, superando assim a interferência. A presença do grupo hidroxila 3- facilita a hidroxilação pela tirosinase na vaga da posição 4-mas não pela ROS, e o intermediário sofreria 1,6-eliminação espontânea por rearranjo, liberando o fluoróforo livre. A alta especificidade da sonda desenvolvida foi comprovada por imagem e detecção da atividade endógena da tirosinase em células vivas e peixes-zebra, e a alta especificidade da sonda foi ainda verificada por um ensaio imunossorvente ligado a enzima (Figs. 4 e 6). O grupo de Ma posteriormente desenvolveu outra sonda fluorogênica de ativação (Pr15, Fig. 4) baseada em resorufina incorporada com um grupo 3-hidroxifenil [39]. Foi usado para detectar e visualizar a atividade da tirosinase endógena em uma variedade de células vivas. Inspirado pelo projeto acima, Zhang e colegas de trabalho [40] propuseram uma sonda de tirosinase fluorogênica (Pr16, Fig. 4) com resorufina como um fluoróforo e o éster de pinacol de ácido m-tolil borônico (WH) como um novo reconhecimento de tirosinase metade. A sonda mostrou alta seletividade para tirosinase sobre outras substâncias biológicas, incluindo ROS. No entanto, foi severamente interferido pelo H2O2. Em 2019, Hu et al. [41] relataram uma nova sonda fluorogênica com alta seletividade química baseada em fluoresceína (Pr17, Fig. 4), que pode rastrear a tirosinase in vitro e in vivo e realizar a alta detecção quimioseletiva da tirosinase. Além disso, a sonda reagiu em solução aquosa e exibiu um aumento de fluorescência de mais de 24 vezes na presença de tirosinase. Além disso, o Pr17 apresentou ótimas características de membrana celular e permeabilidade tecidual, o que ajudou seu sucesso em seguir a atividade da tirosinase endógena em diferentes modelos de células vivas e peixes-zebra. O grupo de Ding construiu uma nova sonda de fluorescência NIR solúvel em água (Pr18, Fig. 4) que pode reconhecer especificamente a tirosinase, que é altamente estável dentro da temperatura e pH fisiológicos e pode detectar com precisão a tirosinase em sistemas biológicos sem ser perturbada por entidades onipresentes. Ele pode ser usado para imagens de tirosinase em células vivas, peixes-zebra e modelos de camundongos xenogênicos [42].

Sidhu et ai. idealizou e sintetizou uma sonda fluorescente raciométrica (Pr19, Fig. 4) baseada em naftalimida. Pr19 tem alta seletividade e sensibilidade para tirosinase, e o limite de detecção (LOD) é bastante baixo [43]. A mudança do espectro de excitação ou emissão ocorre depois que a sonda é combinada com os reagentes. Ele pode ser registrado usando a proporção da intensidade de fluorescência medida em dois comprimentos de onda diferentes, o que é chamado de medição de proporção. Sondas fluorescentes raciométricas baseadas neste princípio mostram sua sensibilidade e seletividade e podem ser usadas para o estudo da função enzimática em sistemas vivos [44]. A equipe de Guo propôs uma nova sonda fluorescente raciométrica e ativa NIR (Pr20, Fig. 4) para detecção em tempo real da atividade da tirosinase endógena. Essas características especiais do Pr20, combinadas com rara citotoxicidade, características fotofísicas superiores e permeabilidade da membrana celular, o tornam ideal para a detecção quantitativa da atividade endógena da tirosinase [45]. Derivados de cianina, como corantes fluorescentes NIR típicos, podem ser agregados de forma controlada em soluções aquosas e, portanto, exibem muitas propriedades espectrais significativamente diferentes. O átomo de cloro no centro do esqueleto de cianina é facilmente substituído por outros grupos funcionais. Com base nessa função, Zhang et al. [46] desenvolveram uma nova sonda fluorescente baseada em cianina (Pr21, Fig. 4) para a detecção de fluorescência raciométrica da atividade da tirosinase (Fig. 7). A determinação da razão obteve uma boa relação sinal/ruído, e o valor de LOD da atividade da tirosinase foi de 0,02 U/mL. Além disso, Pr21 foi empregado com sucesso na geração de imagens da atividade da tirosinase endógena em células B16 e distinguindo-a qualitativamente de outras células cancerígenas/normais na ausência de tirosinase (Fig. 7).

7. Inibidores da tirosinase

Os inibidores são geralmente divididos em inibidores reversíveis e inibidores irreversíveis com base em se os inibidores que interagem com as enzimas causam inativação permanente da enzima. A inibição característica da tirosinase é a inibição reversível. Para a inibição caracterizada por inibição reversível, a combinação de inibidor e enzima é um processo de equilíbrio dinâmico reversível [47e49]. Aumentar a concentração do inibidor fará com que a atividade enzimática diminua, mas o inibidor apenas inibe a atividade enzimática em vez de inativar permanentemente a enzima. Quando a concentração do inibidor diminui, a atividade da tirosinase aumenta. Enquanto isso, a inibição irreversível será a inativação permanente da tirosinase. De acordo com os diferentes sítios e métodos de interação dos inibidores de tirosinase com a enzima, eles podem ser divididos em quatro formas: competitiva, não competitiva, mista e de ligação lenta.

Os flavonoides são um conjunto de compostos compostos por dois anéis benzênicos conectados por uma cadeia de três carbonos. Como os grupos hidroxila, metoxi e cadeia lateral glicosídica estão nos anéis de benzeno, o arranjo pode ser subdividido em flavonóis, chalconas, diidroflavonas e laranjas (Fig. 8) [56]. Os flavonoides são amplamente distribuídos nas folhas, sementes, cascas e seguidores das plantas, e os pesquisadores verificaram mais de 4.000 flavonoides. Para algumas plantas, os flavonóides e seus derivados têm proteção contra raios UV, patógenos e herbívoros [57]. A análise da estrutura do extrato de raiz de alcaçuz mostra que a capacidade inibitória da tirosinase da neoglicirrizina, glicirrizina, isoliquiritigenina e glicirrizina está relacionada à sua lipofilicidade. Dentre eles, a inibição do monofenol é mais efetiva que a do difenol, indicando que é uma reação limitante na primeira etapa da reação de oxidação [58].

Algumas flavonas contendo uma estrutura {{0}}hidroxi-4-cetona podem inibir competitivamente a atividade enzimática por quelação do cobre no sítio ativo da tirosinase, resultando na inativação irreversível da tirosinase. Após a quelação da tirosinase, a molécula teoricamente perde sua estrutura planar e torna-se distorcida. Os inibidores competitivos são geralmente paralelos em estrutura ao substrato, de modo que a molécula entra facilmente no sítio ativo da tirosinase e impede a entrada de L-DOPA [59,60]. Jung et al. extraíram dois flavonóis das folhas de Zanthoxylum piperitum. Os flavonóis podem inibir a atividade da tirosinase dos cogumelos, que é uma inibição competitiva, mas não podem inibir a produção de melanina do Streptomyces bikiniensis. Mais tarde, descobriu-se que o composto flavonoide isolado da Formosa filipina também pode inibir a tirosinase, e o efeito inibitório é melhor que o do ácido kójico [62]. Liang et ai. descobriram que o pigmento amarelo de cártamo também pode inibir a atividade da tirosinase de cogumelo, com um valor de metade da concentração inibitória máxima (IC50) de 1,01 mg/mL. Esta relação de inibição parece ser dependente da dose [63]. (2R, 3R)-(þ)-purpurina extraída de Shuiliao inibe 70% da atividade da tirosinase e a concentração é de 0,50 mM. A capacidade inibitória é melhor que a do ácido kójico e arbutina [64].

7,8,40 -trihidroxiflavona é um derivado flavonoide que inibe a atividade da tirosinase difenolase de forma não competitiva com um valor de IC50 de 10,31 ± 0,41 mM e um Ki de 9,50 ± 0,40 mM. O mecanismo de ação deste composto com a tirosinase é um mecanismo estático e mostra um único sítio de ligação com uma constante de ligação de (7,05 ± 1,20) × 104 M-1 a 298 K. Parâmetros termodinâmicos mostram que o processo de ligação está relacionado às ligações de hidrogênio e às forças de van der Waals [51].

3,8-hidroxiquinolina (In1, Fig. 9 [65]) separada dos subsídios Scolopendra mutilans pode inibir a produção e oxidação de melanina nas células Melan-a. In1 mostra um efeito antioxidante desenvolvido pela concentração e inibe significativamente a atividade da tirosinase do cogumelo através da inibição não competitiva. Ao mesmo tempo, o In1 é considerado não citotóxico no estudo, conforme mostrado na Tabela 1 [65]. A fração de acetato de etila do extrato de flor de Nymphaea nuchal (NNFE) (100 mg/mL) pode efetivamente reduzir a produção de melanina e inibir a atividade da tirosinase de cogumelo. O mecanismo subjacente envolve a interferência com fatores de transcrição e vias de sinalização universal na síntese de melanina [66]. A capsaicina (In2, Fig. 9 [67]) e a dihidrocapsaicina (In3, ​​Fig. 9) extraídas da pimenta podem inibir a atividade da tirosinase. O resultado mostra que o valor de IC50 de In2 é 1,73 vezes menor que o de In3. A constante de inibição (Ki) também suporta a atividade inibitória de In3 (0,39 mM, Tabela 1) em tirosinas é menor do que a de In2 (0,30 mM, Tabela 1) [67]. Verificou-se que a cafeína (In4, Fig. 9 [68]) extraída do pólen de camélia mostra forte atividade inibitória em relação à tirosinase de cogumelo em um modelo não competitivo, conforme mostrado na Tabela 1. In4 altera o local de ligação da L-tirosina e o anel conformação adjacente ao centro ativo por ligação à tirosinase. Os resultados experimentais mostram que o In4 tem um efeito inibitório óbvio na atividade da tirosinase nas células e a geração de melanina de células de melanoma B16F10 está relacionada à concentração [68]. O ácido cáftárico (In5, Fig. 9) extraído das uvas pode inibir competitivamente a tirosinase, e o valor de IC50 (Tabela 1) é menor do que os compostos relacionais, ácidos cafeico e clorogênico [47]. A floretina (In6, Fig. 9) pode ligar-se à tirosinase por meio de um processo estático, que faz com que a conformação da tirosinase mude, inibindo assim sua atividade. Ao mesmo tempo, o In6 tem uma forte capacidade antioxidante e a capacidade de reduzir o-dopaquinona a LDOPA [48].

Os pesquisadores avaliaram duas espiroacridinas (AMTAC-01, In7, Fig. 9) e (AMTAC-02, In8, Fig. 9) como inibidores da tirosinase. Os resultados mostram que os derivados de acridina interagem fortemente com a tirosinase de cogumelo. O In8 é mais eficaz na inibição da atividade enzimática do que o In7, conforme mostrado na Tabela 1, o que indica que o grupo metoxi do In8 está altamente correlacionado com a atividade inibitória [49]. Várias 21 tiossemicarbazonas halogenadas (TSCs) foram sintetizadas e investigadas. Verificou-se que os TSCs 6, 12 e 21 (In9/10/11, Fig. 9 [69]) exibem potentes propriedades inibitórias com diferentes IC50, respectivamente (Tabela 1). Eles demonstram um mecanismo mutuamente reversível e competitivo para inibir a tirosinase. Entre os compostos estudados, os derivados para-substituídos da acetofenona das tiosemicarbazonas têm a maior afinidade com a enzima [69]. A penicilina V (In12, Fig. 9) é um antibiótico b-lactâmico bacteriolítico. Estudos descobriram que o In12 pode inibir a atividade do micofenolato e da difenolase. Estudos de supressão de fluorescência e docking molecular mostraram que o In12 pode formar uma interação estática perto do bolso catalítico da enzima, dificultando assim o transporte do substrato para o sítio ativo e reduzindo a plasticidade do cobre para a catálise [70]. Recentemente, Raza et al. estudaram o potencial inibitório de N-(fenil substituído)-4-{(4-[(E)-3- fenil-2-propenil]-1-piperazinil) butanamidas ( 5a-e) na tirosinase. Todos os compostos foram considerados biologicamente ativos, com 5b (In13, Fig. 9) mostrando o maior potencial inibitório [71]. Mahajan et ai. projetou e sintetizou quinazolinona ben amidas 4a-h (In14e21, Fig. 9). Através do estudo do efeito inibitório dos compostos sobre a atividade da tirosinase, verificou-se que todos os compostos apresentam valores de IC50 mais baixos do que o ácido kójico padrão, conforme mostrado na Tabela 1 [72]. Shen e outros. encontraram um novo inibidor de tirosinase, o peptídeo ECGYF (EF-5, In22) como mostrado na Fig. 9. A ligação entre In22 e tirosinase depende principalmente de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, e o efeito da inibição da tirosinase é mais forte do que o de arbutina e glutationa [73]. Ele e outros. isolaram três tamariscinóis 1/2/3 (In23/24/25) e dois fenólicos 4 e 5 (In26 e 27), conforme mostrado na Fig. 9. As experiências mostraram que todos os isolados têm efeitos inibitórios sobre a tirosinase de cogumelo, sendo o In23 o mais eficaz (Tabela 1) [74].

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