Aumentando a atividade anticancerígena do taxol "endófito de jojoba" de Aspergillus Favus por meio da conjugação com nanopartículas de ouro mediadas por -irradiação Ⅱ
May 30, 2023
Identidade Química e Atividade Anticancerígena do Taxol de A. favus
Os supostos pontos TLC deA. favusO taxol foi descartado e dissolvido em metanol,e as propriedades químicas do composto foram resolvidas a partir de diferentes HPLC,Análises cromatográficas e espectroscópicas HNMR e FT-IR. Próton nuclear magnéticosinais de ressonância (1 H RMN) deA. favusO Taxol extraído foi distribuído entre 1.0e 8.0 ppm, com três sinais de prótons resolvidos em 1.0–3.0 ppm correspondendo a metil,grupos acetato e acetileno, enquanto sinais de prótons em 6,5–9.0 ppm correspondente aas porções aromáticas (Fig.3). O padrão e distribuição de sinais de prótons deA.favocêO taxol autentica a identidade estrutural e a semelhança da amostra com o padrãoTaxol (Fig.3). Além disso, o Taxol deA. favustem os mesmos espectros FTIR do Taxol autêntico.O pico em 3393,3 cm−1foi atribuído ao hidroxilo (OH), enquanto o pico em 2923,5 foiatribuído ao trecho CH alifático, os picos em 1661.0 cm−1corresponde a C=Ofrequência de alongamento. Os picos observados em 1452.0 cm−1e 1404.0 foram referenciados paraa frequência de alongamento NH, enquanto o pico em 1109,0 cm−1refere-se ao grupo carbonilofreqüência de alongamento de oxigênio. Os picos na faixa entre 1020,0 e 979,77 cm−1eramreferenciado à presença de curvaturas C e H aromáticas. Conclusivamente, o padrão espectral deFTIR em relação aos grupos funcionais deA. favusO taxol era idêntico ao autênticoTaxol (Fig.3). Conclusivamente, a partir das análises cromatográfica e espectral, o supostoamostra foi resolvida e autenticada como compostos de Taxol em comparação com o autênticocomposto.
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Efeito de diferentes tipos de meio na produção de taxol por A. favus
A influência da composição do meio na produção de Taxol porA. favusfoi avaliadocrescendo em PDB, M1D, Czapek's-Dox e extrato de malte. Depois da incubação culturalção, o Taxol foi extraído e quantificado conforme descrito em Materiais e Métodos. Deresultados na Fig.4, o maior rendimento de Taxol porA. favusfoi obtido crescendo em malteextrato (170 µg/l) e Czapek's-Dox (166 µg/l), comparado ao meio de crescimento PDB como controle(89 µg/l). Assim, o rendimento de Taxol porA. favusaumentou cerca de 2 vezespor seu crescimento em meio Czapek's-Dox e extrato de malte, em comparação com o meio controle.Assim, mais estudos de otimização para maximizar o rendimento do Taxol porA. favuspela respostaabordagem estatística de metodologia de superfície foram implementadas.
Otimização de Variáveis de Bioprocesso Usando Metodologia de Superfície de RespostaTriagem de projeto Plackett-Burman para fatores críticos
O rendimento de Taxol porA. favusfoi otimizado pelo projeto experimental estatístico dePlackett–Burman [18, 28]. Os intervalos mínimo e máximo dos parâmetros selecionadosselecionados pelo projeto Plackett-Burman foram resumidos na Tabela2. A concentração de taxol foideterminado por TLC e HPLC. Todos os experimentos foram
foi considerada a concentração média de Taxol. A análise estatística deste projeto ilustrathat the model F-value of 5.98 implies the model is significant and values of "Prob>F" menosrealizado em triplicado eque 0.0500 conforme relatado na Tabela3. O rendimento real e previsto de Taxol em resposta aoparâmetros experimentais revelados pelo projeto de Plackett-Burman foram mostrados pelomatriz na tabela4. O "Pred R-Squared" de 0.3061 não é tão próximo do "Adj R-Squared"de 0.5760 como normalmente se espera. O máximo real (255,35 µg/l) e previsto(280,4 µg/l) rendimento de Taxol porA. favusmediante um planejamento fatorial por projeto de Plackett-Burmanfoi obtido na corrida # 8. A partir dos dados obtidos (Fig.4), o maior rendimento de Taxol porA. favus(225 µg/l) foi obtido usando extrato de malte (20 g/l), peptona (2 g/l), sacarose (20 g/l), tona de soja(2 g/l), cisteína (0,5 g/l), glutamina (0,5 g/l), extrato de carne bovina (1 g/l), à temperatura de incubação30 graus, pH inicial 6,0, e após 12 dias de incubação em velocidade de agitação (150 rpm). nesta culturaexecução (12), o rendimento de Taxol porA. favusaumentou significativamente em cerca de 1,4 vezes,em comparação com o meio de controle (170 µg/l). A redução do modelo, transformação da resposta,e Adeq Precision medem a relação sinal-ruído, e uma relação maior que 4 é desejável[46]. Com base no parâmetro estimado e aplicando análise de regressão múltipla nodados experimentais, as variáveis de teste e a variável de resposta foram relacionadas pelo seguinteequação do modelo: equação de primeira ordem em termos de fatores codificados — Taxol Con.= mais 11,51 mais 1,91E mais 2,92 J mais 0,81 K. Os níveis reais e previstos de Taxol porA. favussobre Plackett-BurO bioprocesso de otimização humana está resumido na Tabela4e Fig.4. O máximo real(255,35 µg/l) e rendimento previsto (280,4 µg/l) de Taxol porA. favusem um planejamento fatorial porO design de Plackett-Burman foi obtido na execução # 8 no componente médio. o efeito de indiParâmetros individuais, conforme revelados pelo design de Plackett-Burman, foram representados no ParetoGráfico representando a ordem de significância das variáveis envolvidas na produção de Taxol Fig.4. Assim, as variáveis mais significativas que afetam a produtividade de Taxol porA. favuseram cisteína,pH e tempo de incubação conforme revelado pelo projeto Plackett-Burman.
O design composto central faceado foi adotado para estudos de otimização adicionais usando ovariável significativa do projeto Plackett-Burman. Os resultados de 20 execuções de trêsvariáveis com efeitos positivos demonstraram que as produções de Taxol se diversificaram acentuadamentecom a condição foram testados na faixa de 96,5–302,7 µg/l. O rendimento máximo deTaxol porA. favus(302,7 µg/l) foi observado usando cisteína (0,50 g/l) a pH 6,0 e incubadopor 15 dias conforme registrado na Tabela5. A produção mínima de Taxol foi registrada emcorrida número 15, onde cisteína (1.0 g/L) em pH 7.0 e incubada por 7 dias. o estatísticoa análise do projeto do modelo linear demonstra que o valor F é 87,08, implicando osignificance of the model, and the values of "Prob>F" menor que 0.050 indica esse modelotermos são significativos (Tabela6). Portanto, cisteína, pH e tempo de incubação são significativostermos do modelo. A análise revelou que o "Pred. R-Squared" de 0.8972 está em razoávelacordo com o "Adj. R-Squared" de 0.9315. Rácio "Adeq. Precision" de 30.800 medidasa relação sinal-ruído, pois uma relação maior que quatro é desejável, o Adeq.Os resultados obtidos do experimento CCD foram analisados por ANOVA que rendeua seguinte equação de regressão ao nível da produção de Taxol: modelo de primeira ordem equatermos de ção de fatores codificados — Taxol Conc.{{0}} mais 11,47 mais 1,60A mais 2,43B mais 0,67C. O tridimensionalcurvas de superfície de resposta mostrando o efeito das interações dos mais significativosparâmetros essenciais, cisteína, pH e tempo de incubação, foram mostrados na Fig.4.
mesa 2mínimo e máximointervalos dos parâmetros selecionadosem P-BD para otimização deprodução de taxol
Tabela 4Projeto de Plackett-Burman para avaliar fatores que afetam a produção de Taxol porA. favus
variáveis com efeitos positivos demonstraram que as produções de Taxol se diversificaram acentuadamentecom a condição testada na faixa de 96,5–302,7 µg/l. O rendimento máximo deTaxol porA. favus(302,7 µg/l) foi observado usando cisteína (0,50 g/l) a pH 6,0 e incubadopor 15 dias conforme registrado na Tabela5. A produção mínima de Taxol foi registrada emcorrida número 15, onde cisteína (1.0 g/L) em pH 7.0 e incubada por 7 dias. o estatísticoa análise do projeto do modelo linear demonstra que o valor F é 87,08, implicando osignificance of the model, and the values of "Prob>F" menor que 0.050 indica esse modelotermos são significativos (Tabela6). Portanto, cisteína, pH e tempo de incubação são significativostermos do modelo. A análise revelou que o "Pred. R-Squared" de 0.8972 está em razoávelacordo com o "Adj. R-Squared" de 0.9315. Rácio "Adeq. Precision" de 30.800 medidasa relação sinal-ruído, como uma relação maior que quatro é desejável, o Adeq.Os resultados obtidos do experimento CCD foram analisados por ANOVA que rendeua seguinte equação de regressão ao nível da produção de Taxol: equação do modelo de primeira ordemtermos de fatores codificados — Taxol Conc.{{0}} mais 11,47 mais 1,60A mais 2,43B mais 0,67C. O tridimensionalcurvas de superfície de resposta mostrando o efeito das interações dos mais significativosparâmetros, cisteína, pH e tempo de incubação, foram mostrados na Fig.4.
meio de extrato de malte modificado obtido do RSM por design de Plackett-Burman. Depoisincubação cultural sob condições padrão, o Taxol foi extraído e quantificado por TLCe HPLC. A partir dos resultados obtidos (Fig. S1), não há efeito significativo no Taxol productividade sob radiação nas diferentes doses.
Síntese de AuNPs e Conjugação com A. favus Taxol Mediado por - Radiação
Polivinilpirrolidona(Nanopartículas de ouro cobertas com PVP (AuNPs) foram sintetizadasmisturando PVP com cloreto de ouro (III), mediado por irradiação gama em doses de{{0}}.25–10,0 kGy, e os PVP-AuNPs desenvolvidos foram avaliados a partir do UV–Vis, FT-IR,e análises XRD. O esboço da formação do consórcio Taxol-PVP-AuNPs foi mostradona Fig.5. Tamanho dos PVP-AuNPs desenvolvidos mediados por 1.0 raios gama kGy foram monitoradospor DLS, e era cerca de 50 nm (Fig.5). A partir da imagem HRTEM, o esperadoforma e tamanho dos AuNPs sintetizados foi demonstrado com partículas esféricas dentroa nanoescala varia de 20 a 30 nm com o diâmetro principal médio de 25 nm (Fig.5). Resultados semelhantes foram observados com PVP-AuNPs mediados por radiação gama [49, 50]. As propriedades espectrais das AuNPs desenvolvidas em resposta a diferentes doses de gamaraios foram avaliados a partir da análise UV-Vis, com espectro de absorção máximo registradoem λ540nm a 1,5–3.0 kGy. Além disso, o desenvolvimento de AuNPs foi monitoradoà inspeção visual, com plausível coloração amarelada a marrom, revelando a formaçãode AuNPs.
A conjugação química de Taxol e PVP-AuNPs foi verificada a partir do espectro FT-IRanálise, como revelado pela ligeira mudança da intensidade e taxa de transmissão deos grupos funcionais de conjugados Taxol-PVP-AuNPs em comparação com Taxol como controle.A intensidade do pico em 3393,3 cm−1atribuído para o hidroxilo (OH) em Taxol-PVPO consórcio de AuNPs foi aumentado em cerca de 3 vezes em comparação com o Taxol nativo, revelando aestiramento químico nos grupos hidroxila (Fig.5). Bem como a intensidade dos picos1661.0 cm−1referindo-se à frequência de alongamento C=O foi fortemente aumentada em cerca de 10dobra na conjugação com PVP-AuNPs, garantindo o alongamento nas ligações C=O. Oa intensidade do pico 2923,5 correspondente ao alongamento CH alifático foi bastante estável. Aligeira mudança na intensidade dos picos observados em 1452.0 cm−1e 1404,0 cm−1foiobservada devido à frequência de estiramento de NH. A intensidade do pico 1109,0 cm−1dea frequência de alongamento do grupo carbonil-oxigênio foi ligeiramente reduzida após a conjugação comPVP-AuNPs.
A estrutura cristalina/física do Taxol após a conjugação com PVP-AuNPs foiresolvido a partir da análise XRD (Fig.5). Do XRD, o Taxol-PVP-AuNPs consortium tinha a mesma configuração estrutural, orientação cristalina e tamanho do nativoTaxol, garantindo a ausência de efeito negativo na estrutura cristalina do Taxol nativo. Deos resultados, a estrutura amorfa e cristalina do Taxol-PVP-AuNPs em comparação como Taxol nativo foi confirmado. A partir da análise de XRD, a conjugação de Taxol ePVP-AuNPs foi resolvido conforme revelado pelas propriedades de difração relativas2ɵ=38,18 graus , 44,01 graus , 64,57 graus , 77,67 graus e 81,74 graus que descrevem as observações de Braggem (111), (200), (220), (311) e (222), respectivamente. Todos os picos estavam relacionados com o idealcartão do Comitê Conjunto de Padrões de Difração de Pó (JCPDS) de AuNPs (JCPDScartão nº 04–0784) [51]. Assim, a força dos cristais das AuNPs sintetizadas foi mostrada,fornecendo a estrutura cristalina cúbica de face centrada (FCC). Além disso, há um simplespico amorfo a 19,25 graus para o Taxol que está incluído na organização e permanência doAuNPs. O padrão XRD confirmou a conjugação bem sucedida de Taxol e PVP-AuNPs.O tamanho médio do cristalito das AuNPs incorporadas foi determinado a partir de Scherrerequação [52], e foi de 20,2 nm para o consórcio Taxol-PVP-AuNPs mediado por gamaraios como mencionado na equação:
onde D é o tamanho médio do cristalito, é a largura total na metade do máximo, λ é o raio-Xcomprimento de onda, θ é o ângulo de Bragg,ek é uma constante.
Atividade anticancerígena de conjugados de Taxol-PVP-AuNPs
Oatividade antiproliferativa de Taxol-PVP-AuNPsconjugados foi avaliado contraLinhagens celulares HEPG-2 e MCF-7, normalizando para Taxol nativo e AuNPs, separadamente. Deos resultados (fig.6), a bioatividade do Taxol foi dramaticamente aumentada após a conjugaçãocom AuNPs, em comparação com Taxol nativo como controle. Conforme revelado pelo IC50valores, Taxo-O consórcio PVP-AuNPs exibiu atividade signifcativa contra HEPG-2 (2,2 µg/ml) eMCF-7 (3,3 µg/ml) em comparação com Taxol nativo e AuNPs separadamente. Então, na conjugaçãocom AuNPs, a atividade do Taxol foi aumentada em duas vezes em direção às linhas celulares testadas.Em relação à bioatividade das AuNPs, oatividade antiproliferativado Taxol-PVP-AuNPsconsórcio foi aumentado em cerca de 4 vezes em comparação com AuNPs como controle. Interessantemente,a atividade do consórcio Taxol-AuNPs era plausivelmente consistente com o Taxol autêntico.
Taxol de atividade antimicrobiana e AuNPs sintetizadas contra diferentesmicrorganismos
o umatividade antimicrobianado extraídoA. favusConsórcio de Taxol e Taxol-AuNPsfoi avaliado contra várias bactérias e fungos multirresistentes (Tabela7). Após a conjugaçãocom AuNPs, a atividade antimicrobiana do Taxol foi fortemente aumentada em comparaçãoao Taxol nativo e AuNPs separadamente, conforme revelado pelo diâmetro de inibiçãozonas dos microorganismos testados (Fig.6). Como mostrado na Fig.6, o consor Taxol-AuNPStium exibiu a maior atividade contraE. aglomerados(11 µg/ml),C. albicanos (12 µg/ ml), eE. coli(14 µg/ml), comparando com o nativoA. favusTaxol e autêntico. Omaior atividade de Taxol após a conjugação com AuNPs autentica a biodisponibilidade,solubilidade e eficácia do Taxol para se ligar à proteína tubulina alvo in vivo.
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