Bioensaio para monitorar o efeito antienvelhecimento do tratamento do sangue do cordão umbilical

Contato:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Ciências da Vida, Universidade CHA, Gyeonggi-do 13488, República da Coreia

2. Centro de Biologia de Sistemas, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, EUA

3. Departamento de Biologia de Sistemas, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, EUA *Esses autores contribuíram igualmente.

Autor correspondente: Hakho Lee, PhD. Centro de Biologia de Sistemas, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, EUA. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Ciências da Vida, Universidade CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, República da Coreia. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Editora Internacional Ivyspring. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da licença Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Consulte http://ivyspring.com/terms para obter os termos e condições completos.

Recebido: 04.10.2018; Aceito: 2018. 11. 18; Publicado: 2019.01.01

Cistanche tem um efeito anti-envelhecimento

Abstrato

Fundo: O tratamento de animais idosos com plasma em estágio inicial de desenvolvimento (por exemplo, plasma do cordão umbilical) mostrou um potencial impressionante para retardar a degradação associada à idade das funções neuronais e cognitivas. Traduzir tais achados para a realidade clínica, no entanto, requer meios eficazes para avaliar a eficácia do tratamento; os métodos ideais devem ser minimamente invasivos, passíveis de ensaios seriados, custo-efetivos e quantitativos.

Métodos: Desenvolvemos uma nova abordagem de biossensor para monitoraranti-envelhecimentoterapia. Avançamos dois componentes principais do sensor: i) um metabólito transmitido pelo sangue foi identificado como um marcador substituto do envelhecimento; e ii) um sistema de ensaio compacto e econômico foi desenvolvido para aplicações no local. Tratamos camundongos idosos com plasma de cordão umbilical humano ou solução salina; perfil metabólito imparcial no plasma de camundongo revelou o ácido araquidônico (AA) como um potente indicador associado àanti-envelhecimentoefeito. Em seguida, implementamos um sensor magneto-eletroquímico competitivo (cMES) otimizado para detecção de AA diretamente do plasma. A plataforma desenvolvida pode detectar AA diretamente de pequenos volumes de plasma (0,5 µL) em 1,5 hora.

Resultados: os ensaios de cMES confirmaram uma forte correlação entre os níveis de AA eefeito anti-envelhecimento: Os níveis de AA, embora diminuindo com o envelhecimento, aumentaram nos camundongos idosos tratados com plasma, que também mostraram melhora no aprendizado e no desempenho da memória.

Conclusões: A plataforma cMES irá capacitar tanto pré-anti-envelhecimentopesquisa permitindo a vigilância do tratamento longitudinal minimamente invasivo; essas capacidades irão acelerar o desenvolvimento deanti-envelhecimentoterapias, melhorando a qualidade de vida dos indivíduos.

Palavras-chave: Antienvelhecimento, Ácido Araquidônico, Perfil de Metabólitos, Sensor magneto-eletroquímico, Biossensor

Introdução

O envelhecimento é cada vez mais reconhecido como um fator de risco clínico para a degeneração cognitiva (por exemplo, neurodegeneração, demência) e outras doenças crônicas (por exemplo, câncer, doenças cardiovasculares, degeneração muscular) [1]. Com a expansão da expectativa de vida humana e o crescimento da população idosa, esforços significativos estão em andamento para elucidar os mecanismos do envelhecimento [1-3] e encontrar estratégias terapêuticas para retardar ou mesmo reverter os processos de envelhecimento [4]. De fato, resultados promissores de estudos em animais foram relatados; camundongos adultos que receberam uma transfusão de plasma de camundongos jovens recuperaram a função cognitiva, plasticidade sináptica e atividade neuronal [5]. Desenvolvimento rápido emanti-envelhecimentotratamentos e sua tradução em ensaios humanos são antecipados [6]. As métricas atuais para monitorar os efeitos do tratamento, no entanto, têm praticidade limitada, pois os métodos geralmente são difíceis de aplicar com humanos (por exemplo, imagem cerebral invasiva, observação controlada do comportamento) e subjetivos (por exemplo, questionários sobre as experiências do paciente). Um requisito fundamental para avançaranti-envelhecimentoterapias reside, portanto, no desenvolvimento de ensaios quantitativos e minimamente invasivos para o monitoramento do tratamento.

Nós raciocinamos que os metabólitos seriam uma fonte potente paraanti-envelhecimentobiomarcadores. Os metabólitos são um fenótipo essencial em um organismo e estão sendo estudados como biomarcadores diagnósticos para outras doenças [7]. Em particular, o envelhecimento é tipicamente associado a alterações ou disfunções metabólicas, que afetam os perfis gerais de metabólitos nos organismos. Como tal, é concebível que o rastreamento da composição e/ou níveis de metabólitos informe a eficácia deanti-envelhecimentotratamento. Além disso, os ensaios de metabólitos, particularmente na forma de exames de sangue, podem ser quantitativos e minimamente invasivos; esses méritos facilitariam conhecer diferentes regimes de tratamento ou grupos de pacientes e monitorar a dinâmica (anti-)envelhecimento por meio de amostragem em série.

Descrevemos aqui uma nova estratégia de biossensor para monitoramentoanti-envelhecimentotratamento. Dois elementos-chave foram avançados: i) um metabólito transmitido pelo sangue foi identificado como um marcador substituto do envelhecimento; e ii) um sistema de ensaio rápido e econômico foi desenvolvido para aplicações em ambientes clínicos de rotina. Especificamente, tratamos uma coorte de camundongos idosos (cerca de 2 anos) com plasma de sangue do cordão umbilical humano. Análises metabolômicas abrangentes no sangue de camundongos revelaram que o ácido araquidônico (AA), cujo nível diminuiu significativamente com o envelhecimento, aumentou inversamente no grupo tratado. Essa observação nos levou a desenvolver um sensor magneto-eletroquímico para alvos moleculares pequenos: otimizamos uma reação eletroquímica competitiva em que o AA foi capturado em esferas magnéticas e concentrado para maior sensibilidade. A plataforma desenvolvida pode detectar AA diretamente de pequenos volumes de plasma (0,5 µL) em 1,5 horas. Usando esta plataforma, pudemos estabelecer ainda uma correlação positiva entre os níveis sanguíneos de AA e o melhor desempenho dos animais na tarefa motora.

Resultados

Tratamento de camundongos adultos com plasma de sangue do cordão umbilical A Figura 1a mostra o esquema geral do experimento.

Como agente, usamos plasma derivado de amostras de sangue de cordão umbilical humano. Estudos anteriores mostraram que camundongos idosos que foram injetados com plasma de camundongo jovem recuperaram a função de memória espacial, e a administração sistêmica de plasma de sangue de cordão humano melhorou a cognição dependente do hipocampo em camundongos idosos [5, 8]. A injeção de plasma, que é desprovido de componentes celulares, minimizou o risco de rejeição imune por incompatibilidade de espécies. Camundongos envelhecidos (idade inicial, 18 meses de idade) foram randomizados e receberam plasma (um grupo de tratamento) ou tampão salino (um grupo simulado) por meio de injeção de caudal (130 µL; ver Fig. S1 para detalhes). Como controle positivo, foram utilizados camundongos jovens (3 meses de idade). O plasma derivado do sangue do cordão umbilical não foi reunido e cada camundongo foi repetidamente infundido com plasma do mesmo doador (Fig. S1). Após um tratamento de 4-semanas, os camundongos foram submetidos a um teste de comportamento (ou seja, rotarod), e o sangue foi coletado para análise.

Figura 1. Desenho experimental. Plasma de sangue do cordão umbilical humano foi administrado aos grupos jovens (3-meses de idade), idosos (20- e 23-meses de idade) e idosos tratados com plasma (20- e 23-meses de idade). Os três grupos foram submetidos a 2-testes Rotarod de teste para medir a coordenação motora e o aprendizado. O perfil de metabólitos não direcionados foi realizado no sangue dos três grupos, e o maisanti-envelhecimento-via relevante foi determinada através de uma abordagem bioinformática. O biossensor foi desenvolvido para detectar o metabólito mais importante da via.

Figura 2. Determinação de biomarcadores metabólitos associados ao tratamento com plasma de sangue de cordão umbilical humano. (A) Perfil global de perturbação do metabólito. As linhas correspondem a recursos (uma combinação exclusiva de valor m/z e tempo de retenção) de LC/MS e colunas para amostras. As linhas são agrupadas hierarquicamente. (B) Gráfico de pontuação de PCA para redução dimensional. As amostras foram plotadas em relação ao componente principal (PC) 1 e 2. Os valores entre parênteses das legendas dos eixos são proporções de variância explicadas por esses componentes. O PC1 provavelmente explica os efeitos antienvelhecimento, uma vez que o grupo tratado com plasma estava muito mais próximo do grupo jovem do que do grupo simulado. (C) Análise de enriquecimento da via. Os metabólitos foram identificados combinando os valores de m/z medidos com as informações de massa molecular. Cada círculo representa um caminho específico encontrado. Para uma determinada via, a localização x ou tamanho do círculo corresponde à centralidade relativa de intermediação (uma medida do impacto da via) dos metabólitos, e a localização ou cor y (valores de p mais baixos para vermelho e mais altos para azul) na medida em que quais metabólitos estão sobre-representados. As vias dominantes têm valores de x e y mais altos. Assim, o metabolismo do ácido araquidônico (AA) foi identificado como a via mais provável para explicar aefeitos anti-envelhecimentodo plasma do sangue do cordão umbilical.

Análises metabólicas em amostras de sangue de camundongos

Primeiro, realizamos um perfil de metabólitos de pequenas moléculas imparciais no plasma de camundongos. Amostras de sangue de todos os três grupos de camundongos foram submetidas a análises de cromatografia líquida e espectrometria de massa (LC/MS). Processamos os dados de m/z por MAIT (kit de ferramentas de identificação automática de metabólitos) e identificamos recursos estatisticamente significativos por meio de ANOVA (8572 combinações únicas de m/z e tempo de retenção) (Fig. 2a). A análise de agrupamento hierárquico (HCA) de metabólitos revelou dois padrões principais: i) perfis de metabólitos foram distintamente diferentes entre camundongos idosos (não tratados) e jovens; e ii) o perfil de camundongos envelhecidos tratados com plasma foi mais próximo ao de camundongos jovens.

A análise de componentes principais (PCA) revelou estruturas inerentes de dados metabolômicos (Fig. 2b). Cerca de 50 por cento das variações totais foram explicáveis ​​pela primeira (PC1) e pela segunda componente principal (PC2). Todas as três coortes (ou seja, grupos jovens, tratados com plasma e simulados) se estabeleceram em posições discretas, indicando que foram identificadas características biologicamente relevantes para diferenciar classes de grupos. Curiosamente, o grupo idoso tratado com plasma afastou-se da farsa em direção ao grupo jovem. Para quantificar a separação dos grupos, computamos o agrupamento hierárquico nos dois componentes principais. No dendrograma, os grupos jovens e tratados com plasma foram agrupados em um nível de dissimilaridade mais baixo (ou um nível de similaridade mais alto, 1120,9) do que o grupo não tratado (3162,5) (Fig. S2). Esses resultados indicam que características selecionadas (variáveis ​​ou linhas na Fig. 2a) podem ser usadas para inferir biomarcadores metabólitos relevantes para o envelhecimento eanti-envelhecimento. Nós anotamos as características com metabólitos conhecidos usando um banco de dados de domínio público [9].

Avaliamos ainda as funções e interconectividade dos metabólitos identificados, aplicando o mapeamento KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Para uma determinada via, medimos i) a representação excessiva de um metabólito candidato e ii) sua importância (ou seja, centralidade de intermediação) [11] como um nó intermediário chave entre pares de outros metabólitos (consulte Métodos para obter detalhes). Descobrimos que o metabolismo do ácido araquidônico (AA) era a via mais representada (o maior valor de y na Fig. 2c), e os metabólitos nessa via tendiam a se localizar nas vias de comunicação (valores de x mais altos na Fig. 2c) e regem o fluxo de informações. Dentre muitos metabólitos do metabolismo do AA, selecionamos o próprio AA como biomarcador; como entrada inicial na via, o AA sozinho pode ser um representante de outros metabólitos perturbados.

Sensor magneto-eletroquímico competitivo (cMES) para detecção de AA em plasma

Em seguida, nos propusemos a desenvolver um sistema de ensaio rápido no local para detecção de AA. Optamos por usar a tecnologia de detecção magneto-eletroquímica [12-17]. Ele combina enriquecimento e detecção de alvos em uma única plataforma: esferas magnéticas (MBs) são usadas para capturar e rotular alvos moleculares, e alvos ligados a esferas são detectados por meio de detecção eletroquímica. Esta abordagem tem muitas vantagens práticas: i) amostras nativas (plasma ou sangue) podem ser usadas diretamente sem a necessidade de purificação da amostra; ii) o ensaio atinge alta sensibilidade de detecção por meio de enriquecimento magnético e amplificação de sinal enzimático; iii) com base no esquema de detecção elétrica, os sensores podem ser facilmente miniaturizados como um dispositivo portátil (Fig. 3a).

A detecção de AA por meio do sensoriamento magneto-eletroquímico, no entanto, representou um desafio técnico; uma vez que o AA é uma molécula pequena (~304,5 Da), os imunoensaios usando um par de anticorpos AA foram difíceis de aplicar. Assim, exploramos um formato de ensaio competitivo (cMES; sensor magneto-eletroquímico competitivo) que exigia apenas um único anticorpo AA (Fig. 3b). Para a captura do alvo, revestimos MBs com anticorpos AA (MBAb). Também preparamos um agente concorrente (AA-HRP) conjugando AA com uma enzima oxidante (peroxidase de rábano, HRP). Especificamente, usamos uma forma de hapteno; AA conjugado em albumina de soro bovino (BSA) e HRP adicionalmente conjugado ao transportador BSA (Fig. S3). Para o ensaio cMES, as amostras de sangue foram misturadas com MBAb e AA-HRP. A quantidade de AA-HRP foi suficiente para saturar os sítios de ligação de AA em MBAb (Métodos). Isso levaria ao carregamento diferencial de HRP em MBs, dependendo das quantidades endógenas de AA nas amostras. A adição sequencial de um mediador de elétrons cromogênico (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, TMB) gerou uma corrente elétrica que foi lida por um eletrodo planar. O tempo de reação para captura de AA e incubação de TMB foi otimizado para maximizar o nível de sinal (Fig. S4).

Figura 3. Sensor magneto-eletroquímico competitivo (cMES) para ensaio de AA. (A) Esquema do dispositivo. O dispositivo cMES ocupa pouco espaço e permite

operações no local. (B) Desenvolvemos um ensaio eletroquímico competitivo para detecção de AA. Esferas magnéticas (MBAb) foram conjugadas com anticorpos contra AA.

As amostras de controle continham apenas AA-HRP e foram misturadas com esferas magnéticas. As amostras de teste foram misturadas com esferas magnéticas e AA-HRP. (C) Correntes elétricas

medido pelo leitor CMES portátil. No ensaio cMES, a magnitude da corrente diminui com o aumento da concentração de AA [AA]. O sinal do controle

amostra definir a linha de base para [AA]=0 ng/mL. A diferença de corrente (∆I) entre as amostras de plasma de controle e alvo foi usada como uma métrica analítica. (D)

Quantidades conhecidas de AA foram adicionadas no soro e medidas pelo cMES. O limite de detecção foi ~ 126 ng/mL. (E) cMES e ELISA foram comparados para

concordância. Os resultados de ambas as modalidades mostraram uma boa concordância (R2=0.959). Os dados são exibidos como média ± SEM de medições em triplicado.

Figura 4. Medições de AA em amostras de plasma. (A) Análise ao longo do tempo do nível de AA de camundongo após a injeção de plasma. Injetamos 13{{10}} μL de plasma (concentração de AA=7,2 µg/mL) em camundongos (n=6) e coletamos sangue de camundongos após 3, 7 e 14 dias. Os níveis de AA de sangue de camundongos foram então monitorados. Os níveis de AA aumentaram significativamente no dia 3 e retornaram ao nível normal após 7 dias. *p <0.05; **p=""><0.01; ***p=""><0.001. (b)="" amostras="" de="" plasma="" de="" camundongo="" foram="" analisadas.="" no="" grupo="" controle="" (n="5)," camundongos="" jovens="" (idades,="" 5="" e="" 8="" meses)="" apresentaram="" níveis="" de="" aa="" mais="" elevados="" do="" que="" camundongos="" velhos="" tratados="" com="" simulação="" (idades,="" 20="" e="" 23="" meses;="" n="8)." para="" o="" grupo="" tratado="" com="" plasma="" (n="5)," foi="" observado="" aumento="" sustentado="" em="" aa.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (c)="" amostras="" de="" plasma="" das="" mesmas="" coortes="" que="" em="" (b)="" foram="" analisadas="" por="" espectrometria="" de="" massa.="" os="" níveis="" de="" aa="" mostraram="" uma="" tendência="" semelhante="" à="" medida="" por="" cmes.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" os="" dados="" são="" exibidos="" como="" média="" ±="">

Como resultado do ensaio competitivo, a magnitude da corrente elétrica diminuiu com concentrações mais altas de AA no plasma ([AA]). Portanto, preparamos uma amostra de controle incubando MBAb apenas com AA-HRP. A amostra de controle foi usada para definir a linha de base superior (ou seja, [AA]=0 ng/mL) para calcular as diferenças de sinal; correntes elétricas de controle e amostra de plasma foram medidas, e a diferença líquida |∆I |=|Icontrol - Iplasma|foi obtido (Fig. 3c). Tal

as medições diferenciais também compensavam o sinal de fundo comum.

O experimento de titulação (Fig. 3d) usando amostras enriquecidas com quantidades variadas de AA revelou o limite de detecção (LOD) como ~ 125,9 ng/mL. O LOD do ensaio foi ~300-vezes inferior à concentração típica de AA de (38 µg/ml) no plasma de camundongos jovens (5 meses, n=2). Com base nesses resultados, diluímos as amostras de plasma iniciais (100-vezes) adicionando uma solução tampão (consulte Métodos). O sinal da ligação não específica estava próximo de um nível de fundo intrínseco (~43 nA), potencialmente se beneficiando do fator de alta diluição. Também confirmamos que os resultados do ensaio coincidiram com os do ELISA convencional (R2=0.961, Fig. 3e). O ensaio cMES, no entanto, foi mais rápido (1 hora) do que o ELISA (4 horas), principalmente devido à cinética de ligação rápida; no cMES, os MBs capturam AA em todo o volume da amostra (3-difusão dimensional), enquanto a captura AA depende da 1-difusão dimensional no ELISA baseado em placa.

Monitoramento de AA em camundongos tratados com plasma

Aplicamos cMES para analisar os níveis de AA em camundongos após um único tratamento com plasma. Como o AA está naturalmente presente no sangue do cordão umbilical humano, a injeção de plasma aumentaria aditivamente os níveis de AA do camundongo. A concentração média de AA de seis plasmas de sangue do cordão umbilical humano diferentes foi de 7,2 ± 0,5 µg/mL (média ± SEM). Injetamos 130 µL de plasma de sangue do cordão umbilical humano em camundongos (n=6) e monitoramos seus níveis de AA (Fig. 4a). A injeção de plasma aumentou imediatamente os níveis de AA no sangue (dia 3; p < 0,01,="" comparado="" a="" todos="" os="" outros="" pontos="" de="" tempo),="" mas="" o="" efeito="" foi="" temporário;="" os="" níveis="" de="" aa="" voltaram="" ao="" normal="" 7="" dias="" após="" o="" tratamento="" (p="0.34," em="" comparação="" com="" o="" ponto="" de="" tempo="" antes="" da="" injeção="" de="">

Em seguida, monitoramos os níveis plasmáticos de AA após o esquema completo de tratamento (Fig. S1). Três coortes de camundongos diferentes foram usadas: um grupo de idade tratado com plasma (n=8) e um simulado (n=8) (20-23 meses de idade) e um grupo de controle jovem (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Tratamento com plasma levando a melhora cognitiva e comportamental em camundongos idosos

Nós avaliamos ainda os fenótipos comportamentais de coortes de animais, particularmente avaliando suas funções de aprendizagem motora e memória. Realizamos {{0}} testes de rotarod experimental em 1 e 4 meses após o tratamento com plasma ou simulado (Fig. 5a); a latência (tempo de corrida) de um camundongo antes de cair em uma haste rotativa foi usada para avaliar o desempenho motor do animal. Em 1 mês após o tratamento (20-mês de idade), a latência de ambos os grupos placebo e tratado com plasma foi significativamente menor (p < 0,0001)="" do="" que="" a="" dos="" jovens="" (5-mês="" de="" idade="" )="" (fig.="" 5b).="" o="" grupo="" tratado="" com="" plasma,="" no="" entanto,="" mostrou="" uma="" melhora="" gradual="" no="" aprendizado="" motor="" e="" na="" memória,="" enquanto="" a="" mesma="" faculdade="" diminuiu="" no="" grupo="" simulado.="" mudanças="" nos="" níveis="" de="" aa="" seguiram="" mudanças="" de="" comportamento,="" que="" poderiam="" servir="" como="" um="" indicador="" precoce="">anti-envelhecimentoefeito do tratamento (Fig. 5c).

Análises de tecido cerebral (Figs. 5d, 5e) mostraram que camundongos idosos (o grupo simulado) tinham uma área menor de células DCX-positivas na zona subventricular do que camundongos jovens. Por outro lado, a área de células DCX-positivas aumentou no animal tratado com plasma e permaneceu inalterada (p=0.04) indicando que plasma de sangue de cordão injetado estimulou a neurogênese do cérebro velho. Os resultados sugerem o benefício potencial do tratamento com plasma na neurogênese sustentada que resultou em melhora da função motora no grupo tratado.

Discussão

Os avanços nas terapias de rejuvenescimento aumentam concomitantemente a necessidade de uma medida objetiva e quantitativa para ler a eficácia do tratamento. Assim, projetamos nosso estudo para identificar biomarcadores moleculares que podem explicar melhor as características fenotípicas do envelhecimento eanti-envelhecimentotratamento. Nossos experimentos com animais levaram às seguintes observações: i) perfis de metabólitos de coortes de camundongos jovens e adultos são evidentemente diferentes; e ii) injetar plasma de cordão humano em camundongos idosos altera seus padrões de metabólitos mais próximos aos de camundongos jovens. Curiosamente, encontramos o ácido araquidônico (AA) como o biomarcador substituto mais eficaz paraanti-envelhecimentotratamento; O metabolismo do AA foi altamente desregulado em camundongos jovens e tratados com plasma, e foi encontrado desempenhando papéis importantes na interação com outras vias metabólicas, como o metabolismo do ácido linoleico [10, 18].

Desenvolvemos ainda um sistema de sensor rápido e portátil (cMES) para facilitar a detecção de AA em pesquisas de rotina e ambientes clínicos. Integramos especificamente um esquema de ensaio competitivo com enriquecimento imunomagnético em uma tentativa de detectar pequenos alvos moleculares (ou seja, metabólitos) diretamente de amostras de plasma. Esta combinação traz as seguintes vantagens. (i) O ensaio se beneficia da cinética de ligação rápida, pois as esferas magnéticas capturam AA em todo o volume da amostra (3-difusão dimensional). (ii) Os processos de ensaio (por exemplo, etapas de lavagem) são simplificados com ímãs externos usados ​​para coleta de grânulos. (iii) Concentrando magneticamente esferas ligadas a AA perto do eletrodo de detecção, o sinal analítico geral pode ser melhorado (~72 por cento) [12]. De fato, mostramos que o ensaio cMES usa<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Figura 5. Ensaios comportamentais e moleculares. (A) 2-testes de ensaio Rotarod foram realizados em 1 e 4 meses após a injeção de plasma. (B) O grupo tratado com plasma

apresentaram melhora progressiva da coordenação motora; o desempenho foi próximo ao do grupo jovem no final (a segunda tentativa aos 3 meses). O tempo de corrida do grupo sham diminuiu com o envelhecimento. *p <0.05; **p="">< 0.01.="" (c)="" para="" o="" grupo="" tratado="" com="" plasma,="" o="" aumento="" dos="" níveis="" de="" aa="" precedeu="" a="" melhora="" da="" função="" motora.="" *p=""><0.05; **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (d)="" células="" cerebrais="" na="" zona="" subventricular="" foram="" imunomarcadas="" para="" um="" marcador="" de="" neurogênese,="" doublecortin="">

A barra de escala é de 50 µm. Observe que o grupo sham teve uma área significativamente menor de células DCX-positivas na zona subventricular do que os camundongos jovens, enquanto a área aumentou no animal tratado com plasma e permaneceu inalterada. (E) A área de células DCX-positivas na imagem (D) foi medida. *p <0.05; ***p=""><>

Demonstrou-se que o AA promove o crescimento muscular e o desenvolvimento do cérebro [19, 20]. Outros relatórios também destacaram os benefícios potenciais do AA emanti-envelhecimento[21, 22]. O presente estudo está de acordo com esses achados, mas seu escopo se limitou a estabelecer uma relação correlativa entre os níveis de AA eanti-envelhecimentofenótipos. O monitoramento em série de AA, no entanto, indicou que os aumentos de AA em camundongos tratados com plasma eram provavelmente de fontes endógenas, não de plasma transfundido. Além disso, sustentadoanti-envelhecimentoefeitos foram observados em camundongos receptores mesmo 4 meses após o término do tratamento com plasma. A aprendizagem motora e as funções de memória melhoraram; e o número de células precursoras neuronais aumentou no cérebro. Estas observações sugerem fortemente mudanças fisiológicas em camundongos tratados com plasma; o mecanismo exato ainda não foi elucidado.

Várias outras limitações deste estudo devem ser abordadas em pesquisas futuras. Primeiro, o ensaio cMES precisa ser refinado para maior precisão. Em particular, com a falta de amostras verdadeiramente negativas (isto é, amostras de sangue sem qualquer AA endógeno), era difícil contabilizar sinais de ligação não específica. É concebível que o efeito das matrizes de sangue pode ser insignificante à medida que diluímos as amostras em 100- vezes. Tal suposição, no entanto, deve ser validada usando amostras de plasma deletadas de AA que podem ser preparadas a partir de um modelo de camundongo deficiente em AA [23] ou através de imunodepleção de AA. Em segundo lugar, focamos na detecção de um único metabólito no metabolismo de AA por simplicidade, mas essa abordagem pode ignorar o contexto biológico, como interações entre metabólitos em uma determinada via. A inclusão de um painel de metabólitos capturaria melhor as perturbações metabólicas e também aumentaria a precisão do diagnóstico. O cMES pode ser facilmente dimensionado para detectar diversos marcadores enquanto consome pequenas quantidades de amostra. Terceiro, interpolar as descobertas atuais para humanos seria um desafio. Embora camundongos e humanos compartilhem vias metabólicas semelhantes, camundongos têm uma taxa metabólica 7-vezes maior do que os humanos [24]. Ensaios em humanos são necessários para determinar as doses plasmáticas ideais para infusão e estabelecer linhas de base para biomarcadores; informados por estudos em animais, estamos planejando esses estudos em humanos. Esses esforços irão acelerar o desenvolvimento deanti-envelhecimentoterapias, melhorando a qualidade de vida dos indivíduos, bem como reduzindo os encargos sociais.

Métodos

Design experimental

O plasma foi separado do sangue do cordão umbilical humano coletado no momento do parto. O plasma do sangue do cordão umbilical foi administrado por infusão intravenosa em camundongos velhos (18-mês de idade), e controle simulado (18-mês de idade) e camundongos jovens (3-mês de idade como positivo controle) foi injetado com solução salina. Em 1 e 4 meses após o transplante, 2-testes de teste de rotarod foram realizados para avaliar a coordenação motora e a memória de longo prazo (Fig. S1). O perfil do metabólito não direcionado foi realizado no sangue dos três grupos e a análise bioinformática determinou oanti-envelhecimentovia relevante (metabolismo do ácido araquidônico). O biossensor foi desenvolvido para detectar o ácido araquidônico circulante no sangue de forma fácil e eficiente.

Preparação da amostra de sangue do cordão umbilical

O sangue do cordão umbilical humano foi coletado sob o Conselho de Revisão Institucional do Hospital Geral CHA (Seul, Coréia, IRB No. CHAMC-2015- 08-130-009). Sangue de cordão humano foi doado de 4 doadores e tratado com anticoagulante citrato-fasfato-dextrose com adenina (CPDA-1). O plasma de sangue do cordão umbilical humano foi isolado por centrifugação a 2,000 g durante 15 min à temperatura ambiente. As amostras de plasma isoladas foram armazenadas a -80 graus e usadas com um único ciclo de congelamento-descongelamento à temperatura ambiente.

Experimentos com animais

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da CHA University (IACUC). Usamos 18-camundongos C57BL/6 fêmeas de um mês de idade para avaliar perturbações metabólicas e fenótipos comportamentais que se correlacionam com o envelhecimento eanti-envelhecimento. Os controles positivos foram 3-camundongos C57BL/6 fêmeas de um mês de idade. Todos os camundongos foram criados em temperatura ambiente em ciclo claro-escuro padrão de 12 horas. Para os camundongos adultos, o plasma do sangue do cordão umbilical ou solução salina (130 µL) foi injetado por via intravenosa 12 vezes durante 4 semanas. O plasma de sangue de cordão umbilical isolado não foi reunido e um determinado animal recebeu plasma de sangue de cordão umbilical do mesmo doador. O número de animais usados ​​em cada experimento é descrito nas seções de método correspondentes. O plasma foi coletado por centrifugação (3,{10}} g, 15 min em temperatura ambiente).

Aquisição de metabólitos e análise de dados

Para o perfil de metabólitos transmitidos pelo sangue, o sangue foi coletado dos camundongos por punção cardíaca nos pontos de tempo designados: o grupo jovem (3-mês de idade, n=10), o grupo simulado ({{ 4}}meses de idade, n=10; 23-meses de idade, n=12), o grupo tratado com plasma (20-meses de idade, n {{13 }}; 23-mês de idade, n=5). As amostras de sangue foram analisadas em sistema de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) (Agilent). Convertemos arquivos LC/MS em um formato mzXML padrão (ProteoWizard) [25] e os processamos usando MAIT (kit de ferramentas de identificação automática de metabólitos) [26] para detecção de recursos, análise estatística e identificação de metabólitos. Características estatisticamente significativas (ou seja, metabólitos ionizados e/ou fragmentados) foram identificadas por meio de análise de variância (ANOVA). Esses recursos foram combinados com todos os metabólitos putativos possíveis no banco de dados do metaboloma [9] com base na razão massa/carga do íon espectral de massa (tolerância m/z de 0.005). Caracterizamos alterações metabólitos globais por meio de análise de agrupamento hierárquico e as estruturas inerentes de dados metabolômicos por meio de análise de componentes principais (PCA). Duas ou três réplicas técnicas (garantindo que a variação técnica é muito menor do que a variação biológica) por camundongo foram incluídas no aprendizado não supervisionado, como PCA e agrupamento hierárquico. O agrupamento hierárquico em componentes principais (HCPC) foi realizado pelo FactoMineR, um pacote R [27]. Para uma análise funcional, as vias metabólicas mais prováveis ​​de serem perturbadas pelo envelhecimento e tratamento com plasma foram determinadas através da análise da via KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. A distribuição hipergeométrica foi usada para medir a sobre-representação dos metabólitos combinados em vias KEGG específicas.

Preparação de esferas imunomagnéticas

Grânulos magnéticos (5 mg) revestidos com grupos epóxi (Dynabeads M-270 Epóxi, Invitrogen) foram suspensos em 100 µL de solução de fosfato de sódio 0,1 M. Cem microgramas de anticorpo contra o ácido araquidônico (Biomatik) foram adicionados e misturados completamente. Cem microlitros de solução de sulfato de amônio 3 M foram adicionados e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 2 horas e depois incubada a 4 graus durante a noite com rotação de inclinação lenta. A reação de conjugação foi realizada em pH=7.4. Esses processos induzem a formação de ligações covalentes entre grupos epóxi (esferas) e aminas (anticorpos), que confirmamos anteriormente submetendo conjugados anticorpo-contas a desafios de pH [29]. Em média, 2,4×104 anticorpos foram imobilizados por grânulo. As esferas magnéticas conjugadas com anticorpo foram separadas com um ímã permanente, lavadas duas vezes com solução de PBS e ressuspensas em 200 µL de PBS com 1% de BSA. As contas foram armazenadas em 4 graus até um mês.

Conjugação de HRP com ácido araquidônico

HRP foi então conjugado com BSA via química de aminação redutiva. Especificamente, 100 µg de AA conjugado com BSA (RPU51089, Biomatik) foi dissolvido em 0,5 mL de tampão carbonato-biocarbonato 0,2 M (pH 9,4), adicionado a um miligrama de EZ-link liofilizado Plus Ativada Peroxidase (Thermo Scientific), e incubada por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 10 µL de cianoborohidreto de sódio (Thermo Scientific) e a mistura foi incubada por 15 min à temperatura ambiente. Finalmente, 20 µL de tampão de extinção (Thermo Scientific) foram adicionados, seguidos por 15 min de incubação à temperatura ambiente. A eletroforese em gel e a análise da banda de proteína confirmaram a conjugação de HPR com BSA-AA (Fig. S3a). Os AA conjugados com HRP foram coletados e concentrados com filtro centrífugo Amicon Ultra 100K (Millipore). A peroxidase restante e BSA-AA foram lavados com PBS por quatro vezes.

Detecção eletroquímica de AA em amostras de plasma

Para detecção eletroquímica de AA, o sangue foi coletado dos grupos jovens (n ​​{0}}), sham (n=8) e tratados com plasma (n=5 por 1 mês e n=5 por 3 meses). Amostras de plasma de camundongo (0,5 µL) foram diluídas em 50 µL de 1% de BSA em PBS (diluição ×100-vezes) e misturadas com solução de esfera imunomagnética (50 µL) e solução AA conjugada com HRP (50 µL). A quantidade de AA-HRP foi grande o suficiente para saturar os sítios de ligação em esferas magnéticas. Usamos cerca de 8,4 × 107 esferas por teste, o que disponibilizou 2,0 × 1012 sítios de ligação AA. A quantidade de AA-HRP foi ~1,7×1013; a razão entre AA-HRP e sítios de ligação foi de ~8:1. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora com rotação de inclinação lenta. A pérola de controle foi preparada misturando 1 por cento de BSA em PBS (50 µL) com solução de pérola imunomagnética (50 µL) e solução de AA conjugada com HRP (50 µL). Todas as esferas reagidas foram separadas com um ímã permanente e lavadas duas vezes com 80 µL de PBS (1 por cento BSA). Finalmente, as esferas foram ressuspensas em 7 µL de PBS. A solução de esfera preparada e 20 µL de solução de TMB (Biomatik) foram carregados no topo do eletrodo. Após 6 minutos, iniciou-se a medição da cronoamperometria. Usamos um sensor eletroquímico miniaturizado (um sistema protótipo desenvolvido pela AcurreHealth Inc.). Os níveis atuais no intervalo de 40-45 s foram calculados em média. Usamos o fator de conversão (×100) para relatar as concentrações originais estimadas de AA no plasma.

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

Os experimentos de ELISA foram realizados usando o kit ELISA de ácido araquidônico (AA) de camundongo (Biomatik) de acordo com as diretrizes de fabricação. AA diluído em série foi adicionado em cada poço e incubado com AA conjugado com HRP a 37 graus por 40 min. Após lavagem com tampão de lavagem por quatro vezes, a solução de TMB foi adicionada e incubada por 20 min. O desenvolvimento de cor foi interrompido pela adição de solução de parada. A absorbância foi lida a 450 nm usando um leitor de microplacas (Tecan).

Teste Rotarod

Modificamos o teste Rotarod de Kong et al. [30] para avaliar a coordenação locomotora. O rotarod com uma haste de 3-cm de diâmetro começou a 4 rpm e acelerou em 4 rpm por 30 segundos por 5 min. Os camundongos foram colocados na haste e o tempo necessário para que os camundongos caíssem da haste foi medido. Cada camundongo recebeu 3 tentativas por dia e os tempos de corrida de cada dia foram calculados como a média dos tempos de treinamento. O primeiro teste de rotarod foi realizado 1-mês após o tratamento com plasma: o grupo jovem (n=29), o grupo simulado (n=17), o grupo tratado com plasma (n {{ 11}}). Uma sessão de retreinamento foi iniciada 4-meses após o tratamento com plasma. Para evitar o excesso de treinamento, o retreinamento foi realizado por 2 dias. O outro procedimento foi o mesmo da primeira sessão.

Imagem do tecido cerebral

Em 1 mês (n=4) e 4 meses (n=3) após a injeção de plasma de sangue do cordão umbilical humano ou injeção de solução salina, os animais foram sacrificados e então perfundidos com 4% de paraformaldeído (PFA) e PBS através do Ventrículo esquerdo. Os grupos jovem (n=5) e sham (n=4) foram usados ​​como controles. Seus cérebros foram

extraído e crioprotegido. Cada cérebro foi seccionado em um criótomo com uma espessura de 30 μm. Para

realizar a imuno-histoquímica, a ligação não específica foi bloqueada com 5 por cento de soro de cabra normal em 0,3 por cento de Triton X-100 por 40 min. Anticorpo primário contra Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) foi aplicado durante a noite a 4 graus e, em seguida, PBS foi usado para lavagem [31]. O anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) foi usado para detecção de DCX. As imagens foram tiradas usando um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 80i) e analisadas usando Image J [32].

Análise estatística

A análise estatística foi realizada usando funções básicas do R e lme4, um pacote R para Linear

Modelos de Efeitos Mistos ou Modelo Linear Generalizado

(GLM) seguido por um teste post-hoc de LSD [33]. Os dados são apresentados como média ± erro padrão e um valor de p < 0,05="" foi="" considerado="">

Material suplementar

Figuras suplementares.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Agradecimentos

Agradecemos à AccuraHealth Inc. por fornecer o sensor eletroquímico miniaturizado. Este estudo foi apoiado em parte pelo Instituto de Promoção de Tecnologia da Informação e Comunicação (IITP) financiado pelo Governo da Coreia (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Interesses competitivos

Os autores declararam que não existe interesse concorrente.