Efeitos benéficos da fração glicosídica feniletanóide total isolada de Cistanche Deserticola na microestrutura óssea em ratas ovariectomizadas Ⅰ

O presente estudo foi desenhado para estimar a atividade antiosteoporótica da fração glicosídica feniletanóide total isolada deC. deserticola(CDP) em ratos induzidos por ovariectomia (OVX), bem como os mecanismos relacionados. Após 3 meses de administração oral, odiminuição da densidade mineral óssea, Ca e P séricos em ratos OVX foram recuperados e o tecido trabecular deterioradomicroarquitetura ósseafoi parcialmente melhorado pela intervenção de CDP (60, 120 e 240 mg/kg), as atividades dos marcadores de reabsorção óssea foram reguladas negativamente e o bioativo do índice de formação óssea foi regulado positivamente; entretanto, o conteúdo de MDA diminuiu e o GSH aumentou com o tratamento com CDP. Em termos de composição, 8 compostos glicosídeos feniletanóides foram idênticosFieditado em CDP, com o conteúdo total quantiFicalculado como 50,3% usando o método HPLC. Mecanisticamente, o CDP diminuiu os níveis de TRAF6, RANKL e RANK, suprimindo assim a ativação induzida por RANKL/RANK/TRAF6-de NF-κVias de sinalização B e PI3K/AKT e, em última análise, prevenindo atividades das principais proteínas osteoclastogênicas de NFAT2 e c-Fos. Todos os dados acima implicaram que o CDP exibiu benefíciosFie-cialaffafeta a microestrutura óssea em ratas ovariectomizadas, e esses efeitosaffefeitos podem estar relacionados com a NF-κVias de sinalização B e PI3K/AKT que foram desencadeadas pela ligação de RANKL, RANK e TRAF6.

CISTANCHE ORGÂNICA NATURAL PARA CRESCIMENTO ÓSSEO

1. Introdução

A osteoporose pós-menopausa, que afecta 1 em cada 3 mulheres com mais de 50 anos, está a tornar-se um dos principais riscos para a saúde, afectando mais de 200 milhões de mulheres em todo o mundo [1]. Na menopausa, o declínio acentuado do nível de estrogênio geralmente leva a uma reabsorção óssea excessiva causada pelo aumento da osteoclastogênese; então, o equilíbrio entre a formação óssea induzida por osteoblastos e a formação óssea induzida por osteoclastosreabsorção ósseaé interrompido, e a reabsorção óssea acelerada finalmente causou osteoporose e até mesmo fratura de quadril ou coluna [2]. Acreditava-se que a diferenciação dos osteoclastos era desencadeada quando o ativador do receptor do fator nuclear kappa B (RANK) se ligava ao RANKL, o ligante do RANK. No entanto, a combinação de RANK com RANKL não pode ser ativada a menos que o fator 6 associado ao receptor do fator de necrose tumoral proteico (TRAF6) seja unido a ela [3], seguido pela estimulação das vias de sinalização a jusante, incluindo PI3K / AKT e NF-κB . Finalmente, as expressões do fator nuclear das células T ativadas c2 (NFAT2) e c-Fos foram reguladas [4] para modular a diferenciação dos osteoclastos, bem como a reabsorção óssea. Assim, os fatores e reguladores que estão direta ou indiretamente relacionados à ativação e diferenciação dos osteoclastos foram considerados alvos cruciais para a prevenção da perda óssea.

Na verdade, existem alguns medicamentos clínicos e sintéticos para terapia de reposição hormonal, como o valerato de estradiol, que são eficazes no tratamento da osteoporose pós-menopausa. Infelizmente, alguns deles aumentaram o risco de cancros graves, incluindo cancro da mama e do endométrio [5], o que limitou as suas aplicações clínicas. Portanto, é necessário selecionar outras alternativas com eficácia e efeitos colaterais mínimos. Os medicamentos tradicionais chineses (MTC), bem como os compostos e frações bioativas isoladas [6–9], foram comprovadamente eficazes em várias doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa. Entre esses componentes e frações bioativos, os compostos glicosídeos feniletanóides (PhG) com eficácia potencial foram considerados agentes promissores para o tratamento da osteoporose [10–12]. As estruturas dos PhGs consistem em aglicona de ácido cinâmico, um grupo hidroxila fenil etil que é combinado com -glucopiranose, apiose, galactose, ramnose ou xilose por meio de uma ligação glicosídica. Eles existem amplamente em espécies medicinais do gênero Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma é uma MTC oficial registrada na farmacopeia chinesa e, além de ser uma importante MTC [14], C deserticola também é uma erva tônica antienvelhecimento com poucos efeitos colaterais que foi desenvolvida em licor medicinal e líquido nutricional aprovado por a Administração Estatal de Alimentos e Medicamentos. Com base no registro da farmacopeia chinesa, C. deserticola tem sido tradicionalmente usada pelos nativos para lidar com problemas de deficiência de essência renal, como debilidade muscular e fraqueza lombar, e compostos glicosídeos feniletanóides, incluindo equinacosídeo e acetonido, são os principais constituintes bioativos desta erva. De acordo com a teoria da MTC do “rim-governa-osso”, o sistema ósseo é governado pela essência do rim [15], e problemas relacionados aos ossos, como a osteoporose, podem ser recuperados por ervas ou compostos que possuem a atividade de nutrir a essência do rim. Portanto, levantamos a hipótese de que a fração glicosídica feniletanóide total isolada de C. deserticola, pelo menos parcialmente, era benéfica no tratamento da osteoporose. O experimento atual foi, portanto, planejado para validar nossa hipótese usando um modelo de rato ovariectomizado (OVX); além dos marcadores de reabsorção e formação óssea que devem ser estimados, o índice de antioxidação e as vias de sinalização PI3K/AKT e NF-κB induzidas por RANKL/RANK/TRAF6- também foram empregados para investigar os principais mecanismos da bioatividade antiosteoporótica .

2. Materiais e Método

2.1. Materiais Vegetais e Preparação.

Um total de 30 kg de caules de Cistanche deserticola YC Ma foram coletados no condado de Yongning em 2 de setembro015 com as coordenadas 106.026597 e 38.262816, Província de Ningxia, China. A erva foi identificada pelo Dr. Lin Dong (Departamento de Farmacognosia, Ningxia Medical University), e um espécime correspondente (#20150901) foi preservado no Departamento de Análise Farmacêutica. Primeiramente, 30,0 kg de C. deserticola em pó foram extraídos pelo método de refluxo com etanol 70% como solvente; a proporção de material para solvente foi definida como 1:10 e o tempo de refluxo foi de 2 horas por 3 vezes. Em seguida, todos os filtrados foram combinados e condensados ​​sob pressão reduzida a 60 graus C. Em segundo lugar, colunas de resina macroporosa AB-8 foram utilizadas para a separação preliminar e diferentes proporções de etanol em água (0%, 20%, 30%, 40%, 50% e 60%, cada 60 L) foram empregados para eluição. Em terceiro lugar, os eluentes de 40% e 50% foram combinados e posteriormente purificados usando colunas repetidas de resina macroporosa AB-8 com os eluentes de 0%, 20%, 30%, 40% e 50% de etanol em água, e cada eluente foi de 12 L. Finalmente, a fração de 40% foi coletada e condensada sob pressão reduzida para obter 150 g de fração de glicosídeo feniletanóide de sedimento amarelo claro de C. deserticola (CDP, o rendimento foi de 0,5%). Para experiências in vivo, utilizou-se solvente CMC-Na a 0,5% para dissolver o CDP; a administração oral aos animais foi fixada em 1 mL/100 g de peso corporal; para análise de Western blot in vitro, o CDP foi dissolvido com DMSO e depois diluído com DMEM para obter as concentrações finais de 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL e 0,001 mg/mL.

2.2. Produtos Químicos e Solventes.

O valerato de estradiol (EV) foi da Delpharm Lille SAS, França; fosfatase alcalina (ALP),gla-proteína óssea(BGP), kits ELISA de reticulação de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) e desoxipiridinolina (DPD) da Xinyu Biological Engineering Co. kits de reagentes malondialdeído (MDA, 20181221), superóxido dismutase (SOD, 20121218) e glutationa (GSH, 20181221) do Instituto de Engenharia Biológica Jiancheng de Nanjing, Nanjing, China; Paratormônio intacto (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) e receptor alfa relacionado ao estrogênio (ERR, Y3AY8QEWB3) reticulam kits ELISA da Elabscience Biotechnology Co. kit de reagentes catepsina K ELISA da BioVision, America, 1l300141; anticorpos primários de RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 quinase p85 alfa (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) e anticorpos secundários de IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre de ZSGB-BIO, China, 136080; kit de ensaio de proteína BCA total e kit comercial para detecção de formação de osteoclastos e soro fetal bovino e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) da HyClone, Logan, UT, EUA; membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) da Millipore Life Sciences, Billerica, MA, EUA; penicilina e estreptomicina de Gibco, Rockville, MD, EUA. Todos os outros agentes químicos utilizados eram de grau AR.

2.3. Quantificação por HPLC de CDP.

Um instrumento HPLC Agilent 1220 foi empregado para identificar e quantificar a composição do CDP. As condições cromatográficas foram as seguintes: coluna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); a eluição gradiente continha os solventes A (acetonitrila) e B (água contendo 0,5% de ácido acético) (0-10 min: 17-20% A; 10-30 min: 20-25% A; e 30-40 min: 25-30%A); o comprimento de onda de detecção foi de 333 nm; temperatura ambiente; a vazão foi de 1,0 mL/min; o volume de injeção da amostra foi de 5 μL. Foram identificados oito compostos PhG, nomeadamente cistanosídeo F, equinacosídeo, 6'-acetilacteosídeo, cistanosídeo C, cistanosídeo A, acteosídeo, 2'-acetilacteosídeo e isoacteosídeo; utilizando as substâncias de referência correspondentes e um método padrão externo, os conteúdos dos 8 PhGs acima foram quantificados por análise de HPLC (Figura 1).

Figura 1: impressão digital HPLC do CDP. Oito compostos glicosídeos feniletanóides foram encontrados nesta fração, e o conteúdo total foi quantificado como 50,7%. Os compostos e seus conteúdos foram os seguintes: (1) acteosídeo F (3,6%), (2) equinacosídeo (8,8%), (3) cistanósido A (5,0%), (4) acteosídeo (13,3%), (5) isoacteosídeo (3,3%), (6) acteosídeo C (3,6%), (7) 2'-acetilacteosídeo (9,9%) e (8) 6'-acetilacteosídeo (3,2%).

2.4. Protocolo Experimental Animal.

Um total de 6 0 ratos Sprague-Dawley adultos fêmeas com idade de 3 meses foram utilizados no centro de testes em animais da Ningxia Medical University, com um peso corporal inicial médio de cerca de 234 ± 25 g. Os ratos foram alojados num ambiente isento de patogénios específico padrão destinado a aclimatação durante 1 semana. Em seguida, todas as ratas foram anestesiadas (hidrato de cloral, 100 mg/kg, ip) apenas ou ovariectomizadas simuladas (SHAM), ou dois ovários foram removidos e depois divididos aleatoriamente em 5 subgrupos: tratados oralmente com veículo (0,5% CMC- Na) foi definido como grupo modelo (OVX), valerato de estradiol (1 mg/kg/dia) como grupo positivo (EV) e 60, 120 e 240 mg/kg/dia de CDP como baixo (CDPL), grupos de dosagem moderada (CDPM) e alta (CDPH), respectivamente. Todos os ratos foram administrados por via oral diariamente e duraram 3 meses com a dosagem ajustada a cada 2 semanas, o que dependia da alteração do peso corporal total. No último dia do experimento animal, a urina de 24-horas foi obtida usando gaiolas metabólicas; soro foi coletado da artéria femoral de ratos anestesiados; o fêmur direito, a tíbia e todos os órgãos foram dissecados e armazenados a -80 grau C para análise posterior. Os experimentos com animais que conduzimos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Médica de Ningxia.

2.5. Determinação da Densidade Mineral Óssea e Análise Micro-CT.

Primeiramente, um aparelho de absorciometria de raios X de dupla energia (Lunar, EUA) foi utilizado para estimar a densidade mineral óssea total do fêmur direito de cada rato; em segundo lugar, o mesmo fêmur foi utilizado para estimar a imagem 3D da microarquitetura óssea trabecular, empregando um aparelho de micro-TC (GE, América). A resolução isotrópica foi definida em 14 μm para obter uma imagem 3D ideal; a região de interesse (ROI) foi escolhida fixando-se as mesmas coordenadas na placa de crescimento do fêmur de cada amostra; e os parâmetros morfométricos ósseos, incluindo separação trabecular (Tb.Sp), número trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb. Th), conteúdo mineral ósseo (BMC), densidade mineral tecidual (TMD) e conteúdo mineral tecidual (TMC). ) foram obtidos por meio da análise do ROI.

2.6. Ensaio Bioquímico de Soro e Urina.

As atividades da catepsina K sérica, TRAP, SOD e GSH, bem como os conteúdos séricos de PTH, calcitonina, ERR, MDA, BGP e DPD na urina, foram determinados empregando kits de reagentes correspondentes de acordo com as instruções do fabricante, e o o nível de fosfatase alcalina (FA) e os conteúdos séricos e urinários de cálcio (Ca) e fósforo (P) foram estimados por meio de uma máquina automática (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, EUA).

2.7. Análise de Western Blot.

Os osteoclastos foram induzidos usando células RAW 264.7 adicionadas com fator estimulador de colônias de macrófagos (MCSF) e RANKL. Resumidamente, 1 × 107 células RAW 264.7 foram cultivadas em uma placa de 6-poços na presença de 30 ng/mL de MCSF e 25 ng/mL de RANKL. Após 6 dias de indução, as células osteoclásticas maduras foram identificadas usando o método corado com TRAP com o kit correspondente e depois tratadas com CDP (0,1, 0,01 e 0,001 mg/mL , respectivamente) por 24 horas; em seguida, as células foram lisadas com um tampão de lise contendo 0,5 mmol de fluoreto de fenilmetilsulfonil, inibidores de protease e fosfatase. O lisado foi então separado usando SDS-PAGE a 10% e transferido para uma membrana PVDF, que foi sondada com AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos e -actina ( 1:400) após bloqueio com leite desnatado a 5% por 2 horas. As mesmas membranas foram removidas e sondadas novamente com os 9 anticorpos correspondentes acima, respectivamente, e depois foram detectadas pelo software Image Lab no final. Os experimentos foram repetidos três vezes.

2.8. Análise Estatística.

Todos os dados obtidos de experimentos in vivo e in vitro, descritos como média ± DP, foram analisados ​​por meio de ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Dunnett (software SPSS 22.0, SPSS, EUA); p <{3}} foi estatisticamente significativo.

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