Efeitos benéficos da fração glicosídica de feniletanóide total isolada de Cistanche Deserticola na microestrutura óssea de ratas ovariectomizadas

O presente estudo foi desenhado para estimar a atividade antiosteoporótica da fração total de glicosídeo feniletanóide isolada de C. deserticola (CDP) em ratas induzidas por ovariectomia (OVX), bem como os mecanismos relacionados. Após 3 meses de administração oral, a diminuição da densidade mineral óssea, Ca sérico e P em ratos OVX foram recuperados e a microarquitetura óssea trabecular deteriorada foi parcialmente melhorada pela intervenção CDP (60, 120 e 240 mg/kg), as atividades de marcadores de reabsorção óssea foram regulados para baixo, e o bioativo do índice de formação óssea foi regulado para cima; enquanto isso, o conteúdo de MDA diminuiu e o GSH aumentou com o tratamento com CDP. Composicionalmente, 8 compostos glicosídeos feniletanóides foram identificados em CDP, com o conteúdo total quantificado em 50,3 por cento usando o método de HPLC. Mecanicamente, o CDP diminuiu os níveis de TRAF6, RANKL e RANK, suprimindo assim a ativação induzida por RANKL/RANK/TRAF6-das vias de sinalização downstream NF-κB e PI3K/AKT e, por fim, impedindo as atividades das principais proteínas osteoclastogênicas do NFAT2 e c-Fos. Todos os dados acima implicam que o CDP exibiu efeitos benéficos na microestrutura óssea em ratos ovariectomizados, e esses efeitos podem estar relacionados às vias de sinalização NF-κB e PI3K/AKT que foram desencadeadas pela ligação de RANKL, RANK e TRAF6.

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1. Introdução

A osteoporose pós-menopáusica, onde 1 em cada 3 mulheres com mais de 50 anos sofrerá, está se tornando um dos principais riscos à saúde, afetando mais de 200 milhões de mulheres em todo o mundo [1]. Na menopausa, o declínio acentuado do nível de estrogênio geralmente leva a uma reabsorção óssea excessiva causada pelo aumento da osteoclastogênese; então, o equilíbrio entre a formação óssea induzida por osteoblastos e a reabsorção óssea induzida por osteoclastos foi interrompido, e a reabsorção óssea acelerada finalmente causou osteoporose e até mesmo fratura de quadril ou coluna [2]. Acreditava-se que a diferenciação do osteoclasto era desencadeada quando o ativador do receptor do fator nuclear kappa B (RANK) se ligava ao RANKL, o ligante do RANK. No entanto, a combinação de RANK para RANKL não pode ser ativada a menos que o fator 6 associado ao receptor do fator de necrose tumoral proteico (TRAF6) esteja associado a ele [3], seguido pela estimulação de vias de sinalização a jusante, incluindo PI3K/AKT e NF-κB. E finalmente, as expressões do fator nuclear das células T ativadas c2 (NFAT2) e c-Fos foram reguladas [4] para modular a diferenciação do osteoclasto, bem como a reabsorção óssea. Assim, os fatores e reguladores que estão direta ou indiretamente relacionados à ativação e diferenciação de osteoclastos foram considerados alvos cruciais para prevenir a perda óssea.

De fato, existem algumas drogas de terapia de reposição hormonal sintética e clínica, como o valerato de estradiol, que são eficazes no tratamento da osteoporose pós-menopáusica. Infelizmente, alguns deles aumentaram o risco de cânceres graves, incluindo câncer de mama e endometrial [5], o que limitou suas aplicações clínicas.

Portanto, é necessário selecionar outras alternativas com eficácia e efeitos colaterais mínimos. Os medicamentos tradicionais chineses (MTC), bem como os compostos bioativos isolados e frações [6-9], provaram ser eficazes em várias doenças, incluindo a osteoporose pós-menopáusica. Entre esses componentes e frações bioativos, os glicosídeos feniletanóides (PhG) compostos com potencial eficácia foram considerados agentes promissores para o tratamento da osteoporose [10-12]. As estruturas dos PhGs consistem em aglicona de ácido cinâmico, um grupo hidroxil feniletil que é combinado com -glucopiranose, apiose, galactose, ramnose ou xilose por meio de uma ligação glicosídica. Eles existem amplamente em espécies medicinais do gênero Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma é um TCM oficial registrado na farmacopeia chinesa e, além de ser um importante TCM [14], C deserticola também é uma erva tônica antienvelhecimento com poucos efeitos colaterais que foi desenvolvida em licor medicinal e líquido nutricional aprovado pelo Administração Estatal de Alimentos e Medicamentos.

Com base no registro da farmacopeia chinesa, a C. deserticola era tradicionalmente usada pelos nativos para lidar com problemas de deficiência de essência renal, como debilidade muscular e fraqueza lombar, e os compostos glicosídeos feniletanóides, incluindo equinacosídeo e acteosídeo, são os principais constituintes bioativos desta erva. De acordo com a teoria da MTC de "rim-governo-osso", o sistema ósseo é governado pela essência do rim [15], e problemas relacionados aos ossos, como a osteoporose, podem ser recuperados por ervas ou compostos que possuem a atividade de nutrir a essência do rim. Portanto, levantamos a hipótese de que a fração total de glicosídeo feniletanóide isolada de C. deserticola, pelo menos em parte, foi benéfica no tratamento da osteoporose. O experimento atual foi, portanto, planejado para validar nossa hipótese usando um modelo de rato ovariectomizado (OVX); além dos marcadores de reabsorção e formação óssea que devem ser estimados, o índice de antioxidação, bem como as vias de sinalização PI3K/AKT e NF-κB induzidas por RANKL/RANK/TRAF6- também foram empregados para investigar os principais mecanismos da bioatividade antiosteoporótica

2. Materiais e Método

2.1. Materiais Vegetais e Preparação. Um total de 30 kg de caules de Cistanche deserticola YC Ma foram coletados no condado de Yongning em setembro de 2015 com as coordenadas 106.026597 e 38.262816, província de Ningxia, China. A erva foi identificada pelo Dr. Lin Dong (Departamento de Farmacognosia, Ningxia Medical University), e uma amostra correspondente (# 20150901) foi preservada no Departamento de Análise Farmacêutica.

Primeiramente, 30.0 kg de C. deserticola em pó foram extraídos usando o método de refluxo com 70 por cento de etanol como solvente; a proporção de material para solvente foi definida como 1:10, e o tempo de refluxo foi de 2 h por 3 vezes. Em seguida, todos os filtrados foram combinados e condensados ​​sob pressão reduzida a 60 graus C. Em segundo lugar, AB-8 colunas de resina macroporosa foram usadas para a separação preliminar e diferentes proporções de etanol em água ({ {34}} por cento , 20 por cento , 30 por cento , 40 por cento , 50 por cento e 60 por cento , cada 60 L) foram empregados para eluição. Em terceiro lugar, os eluentes de 40 por cento e 50 por cento foram combinados e posteriormente purificados usando colunas de resina macroporosa AB-8 repetidas com os eluentes de 0 por cento, 20 por cento, 30 por cento, 40 por cento e 50 por cento de etanol em água, e cada eluente foi de 12 L. Finalmente, a fração de 40 por cento foi coletada e condensada sob pressão reduzida para obter 150 g de sedimento amarelo pálido da fração feniletanóide glicosídica de C. deserticola (CDP, o rendimento foi de 0,5 por cento). Para experimentos in vivo, 0,5 por cento de solvente CMC-Na foi empregado para dissolver CDP; a administração oral aos animais foi fixada em 1 mL/100 g de peso corporal; para análise de Western blot in vitro, CDP foi dissolvido com DMSO e depois diluído com DMEM para obter as concentrações finais de 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL e 0,001 mg/mL.

2.2. Químicos e Solventes. O valerato de estradiol (EV) era da Delpharm Lille SAS, França; fosfatase alcalina (ALP), proteína gla óssea (BGP), fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) e kits ELISA de reticulação de desoxipiridinolina (DPD) da Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Xangai, China, 201605; kits de reagentes de malondialdeído (MDA, 20181221), superóxido dismutase (SOD, 20121218) e glutationa (GSH, 20181221) do Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, China; Kits ELISA de paratormônio intacto (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) e receptor alfa relacionado ao estrogênio (ERR, Y3AY8QEWB3) da Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; kit de reagente catepsina K ELISA da BioVision, América, 11300141; anticorpos primários de RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 quinase p85 alfa (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) e anticorpos secundários de IgG anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre de ZSGB-BIO, China, 136080; kit de ensaio de proteína BCA total e kit comercial para detecção de formação de osteoclastos e soro fetal bovino e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) da HyClone, Logan, UT, EUA; membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) da Millipore Life Sciences, Billerica, MA, EUA; penicilina e estreptomicina de Gibco, Rockville, MD, EUA. Todos os outros agentes químicos utilizados eram de grau AR.

2.3. Quantificação HPLC de CDP. Um instrumento Agilent 1220 HPLC foi empregado para identificar e quantificar a composição do CDP. As condições de cromatografia foram as seguintes: coluna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); a eluição gradiente continha os solventes A (acetonitrila) e B (água contendo 0,5 por cento de ácido acético) (0-10 min: 17-20 por cento A; 10-30 min: 20-25 por cento A; e 30-40 min: 25-30 por cento A); o comprimento de onda de detecção foi de 333 nm; temperatura ambiente; a taxa de fluxo foi de 1,0 mL/min; volume de injeção da amostra foi de 5 μL. Oito compostos PhG, ou seja, cistanoside F, echinacoside, 6'-acetilacteoside, cistanoside C, cistanoside A, acteoside, 2'-acetilacteoside e isoacteoside, foram identificados; usando as substâncias de referência correspondentes e um método de padrão externo, os conteúdos dos 8 PhGs acima foram quantificados por análise HPLC (Figura 1).

2.4. Protocolo Experimental Animal. Um total de 6 0 ratos Sprague-Dawley adultos fêmeas com idade de 3 meses foram propostos no centro de testes em animais da Ningxia Medical University, com um peso corporal inicial médio de cerca de 234 ± 25 g. Os ratos foram alojados em um ambiente padrão específico livre de patógenos para se aclimatar por 1 semana. Em seguida, todos os ratos foram anestesiados (hidrato de cloral, 100 mg/kg, ip) apenas ou ovariectomizados simulados (SHAM), ou dois ovários foram ambos removidos e então divididos aleatoriamente em 5 subgrupos: tratados por via oral com veículo (0,5 por cento CMC- Na) foi definido como o grupo modelo (OVX), valerato de estradiol (1 mg/kg/dia) como o grupo positivo (EV) e 60, 120 e 240 mg/kg/dia de CDP como baixo (CDPL), grupos de dosagem moderada (CDPM) e alta (CDPH), respectivamente. Todos os ratos foram administrados por via oral diariamente e duraram 3 meses com a dosagem ajustada a cada 2 semanas, dependendo da mudança dos pesos corporais totais. No último dia do experimento animal, urina de 24-hora foi obtida usando gaiolas metabólicas; o soro foi coletado da artéria femoral de ratos anestesiados; o fêmur direito, a tíbia e todos os órgãos foram dissecados e armazenados a -80 graus C para análise posterior. Os experimentos com animais que conduzimos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ningxia Medical University.

2.5. Determinação da Densidade Mineral Óssea e Análise Micro-CT. Primeiramente, uma máquina de absorciometria de raios X de dupla energia (Lunar, EUA) foi usada para estimar a densidade mineral óssea total do fêmur direito de cada rato; em segundo lugar, o mesmo fêmur foi usado para estimar a imagem 3D da microarquitetura do osso trabecular, empregando um aparelho de micro-CT (GE, América). A resolução isotrópica foi definida como 14 μm para obter uma imagem 3D ideal; a região de interesse (ROI) foi escolhida definindo as mesmas coordenadas na placa de crescimento do fêmur de cada amostra; e os parâmetros morfométricos ósseos, incluindo separação trabecular (Tb. Sp), número trabecular (Tb. N), espessura trabecular (Tb. Th), conteúdo mineral ósseo (BMC), densidade mineral tecidual (TMD) e conteúdo mineral tecidual (TMC ) foram obtidos por meio da análise do ROI.

2.6. Ensaio Bioquímico de Soro e Urina. As atividades da catepsina K sérica, TRAP, SOD e GSH, bem como os conteúdos séricos de PTH, calcitonina, ERR , MDA, BGP e DPD na urina foram determinados empregando kits de reagentes correspondentes de acordo com as instruções do fabricante, e o nível de fosfatase alcalina (ALP) e os teores de cálcio (Ca) e fósforo (P) séricos e urinários foram estimados por meio de uma máquina automática (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, EUA).

2.7. Análise de Western Blot. Os osteoclastos foram induzidos usando células RAW 264.7 adicionadas de fator estimulador de colônia de macrófagos (MCSF) e RANKL. Resumidamente, 1 × 107 células RAW 264.7 foram cultivadas em uma placa de 6-poços na presença de 30 ng/mL de MCSF e 25 ng/mL de RANKL. Após 6 dias de indução, as células osteoclásticas maturadas foram identificadas usando o método de coloração TRAP com o kit correspondente e, em seguida, tratadas com CDP (0.1, 0.01 e 0,001 mg/mL , respectivamente) por 24 h; em seguida, as células foram lisadas com um tampão de lise contendo 0,5 mmol de fluoreto de fenilmetilsulfonil, protease e inibidores de fosfatase. O lisado foi então separado usando 10% de SDS-PAGE e transferido para uma membrana de PVDF, que foi sondada com AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85 , RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos e -actina (1 : 400) após bloqueio com 5% de leite desnatado por 2 h. As mesmas membranas foram removidas e sondadas novamente com os 9 anticorpos correspondentes acima, respectivamente, e então foram detectadas pelo software Image Lab no final. Os experimentos foram repetidos três vezes.

2.8. Análise Estatística. Todos os dados obtidos dos experimentos in vivo e in vitro, descritos como média ± DP, foram analisados ​​por ANOVA one-way seguida do teste de Dunnett (SPSS 22.0 software, SPSS, EUA); p < 0 05 foi estatisticamente significativo.

2.7. Análise de Western Blot. Os osteoclastos foram induzidos usando células RAW 264.7 adicionadas de fator estimulador de colônia de macrófagos (MCSF) e RANKL. Resumidamente, 1 × 107 células RAW 264.7 foram cultivadas em uma placa de 6-poços na presença de 30 ng/mL de MCSF e 25 ng/mL de RANKL. Após 6 dias de indução, as células osteoclásticas maturadas foram identificadas usando o método de coloração TRAP com o kit correspondente e, em seguida, tratadas com CDP (0.1, 0.01 e 0,001 mg/mL , respectivamente) por 24 h; em seguida, as células foram lisadas com um tampão de lise contendo 0,5 mmol de fluoreto de fenilmetilsulfonil, protease e inibidores de fosfatase. O lisado foi então separado usando 10% de SDS-PAGE e transferido para uma membrana de PVDF, que foi sondada com AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85 , RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos e -actina (1 : 400) após bloqueio com 5% de leite desnatado por 2 h. As mesmas membranas foram removidas e sondadas novamente com os 9 anticorpos correspondentes acima, respectivamente, e então foram detectadas pelo software Image Lab no final. Os experimentos foram repetidos três vezes.

2.8. Análise Estatística. Todos os dados obtidos dos experimentos in vivo e in vitro, descritos como média ± DP, foram analisados ​​por ANOVA one-way seguida do teste de Dunnett (SPSS 22.0 software, SPSS, EUA); p < 0 05 foi estatisticamente significativo.

3. Resultados

3.1. Composição Química do CDP. Usando o método de HPLC, oito compostos glicosídeos feniletanóides foram encontrados nesta fração, como mostra a Figura 1. Usando referências padrão e um método padrão externo, os compostos e seus conteúdos foram identificados e quantificados da seguinte forma: (1) acteoside F (3,6 por cento), (2) echinacoside (8,8 por cento), (3) cistanoside A (5.{ {11}} por cento), (4) acteoside (13,3 por cento), (5) isoacteoside (3,3 por cento), (6) acteoside C (3,6 por cento), (7) 2'-acetilacteoside (9,9 por cento) e (8 ) 6'-acetilacteosídeo (3,2 por cento). O conteúdo total desses oito componentes foi quantificado em 50,7%.

3.2. Efeitos do CDP na Densidade Mineral Óssea e na Microarquitetura das Trabéculas. A densidade mineral óssea total dos ratos em diferentes subgrupos foi mostrada na Figura 2. Uma tendência decrescente no conteúdo da densidade mineral óssea foi observada em ratos do grupo modelo OVX, que diminuiu em quase 12,0 por cento após 12 semanas da operação em comparação com os ratos do grupo SHAM (p < 0 001). Todos os ratos tratados com CDP exibiram densidade mineral óssea significativamente aumentada em 11,2 por cento, 12,0 por cento e 10,7 por cento (p <0 01), respectivamente, em comparação com os ratos do grupo modelo OVX .

Além disso, consistente com os dados de densidade mineral óssea total, a reconstrução micro-TC, bem como a determinação histomorfométrica do fêmur, mostrou que os ratos do grupo OVX mostraram deterioração óbvia na arquitetura trabecular evidenciada pelo número e área notavelmente reduzidos das trabéculas bem como Tb acentuadamente aumentada. Assim, quando comparado com os ratos do grupo SHAM. O tratamento com CDP preveniu a deterioração induzida por OVX na arquitetura trabecular; como mostra a Figura 3, o BMC, TMC e Tb. Os valores de N foram significativamente aumentados, e a área de Tb. A Sp diminuiu notavelmente, enquanto os valores de DTM e Tb. Eles não pareciam significativamente afetados pela operação OVX e nossa intervenção CDP.

3.3. Efeitos do CDP nos parâmetros bioquímicos da urina e do soro. Como mostra a Figura 4, foram detectadas tendências de diminuição significativa do nível urinário de P e do conteúdo sérico de calcitonina em ratos do grupo modelo OVX, que foi quase 30 por cento e 60 por cento menor do que os ratos SHAM (p < 0 001 ), respectivamente, enquanto nenhuma tendência óbvia de aumento ou diminuição nos níveis urinários de Ca e Ca sérico, bem como PTH sérico e PTH sérico foi observada entre os grupos OVX e SHAM. O tratamento com CDP preveniu significativamente a perda de P e Ca sérico em ratos OVX, evidenciado pelos níveis de P e Ca sérico notavelmente regulados positivamente (p <{6}}) em comparação com os ratos do grupo modelo OVX. Além disso, tendências aumentadas, mas não estatisticamente significativas, de calcitonina foram observadas nos grupos de baixa e alta dosagem de CDP em comparação com o grupo modelo OVX.

3.4. Efeitos do CDP na formação óssea e nos marcadores de reabsorção óssea. Os efeitos benéficos da CDP no índice de formação óssea, bem como as influências inibidoras nos marcadores de reabsorção óssea, foram descritos na Figura 5. Com relação aos marcadores de formação óssea, os níveis séricos de BGP quase não foram influenciados pela cirurgia ovariectomizada evidenciada por alterações não significativas observadas em todos os grupos tratados, enquanto melhorias estatisticamente significativas de ALP sérica foram obtidas em dosagens baixas (60 mg/kg) e moderadas (120 mg/kg) dos grupos de intervenção CDP quando comparados com os ratos do grupo SHAM (p < 0 01). Com relação ao índice de reabsorção óssea, os níveis séricos de catepsina K e DPD, bem como TRAP em ratos do grupo modelo OVX, foram significativamente aumentados em cerca de 75,0 por cento, 41,4 por cento e 21,0 por cento, respectivamente, em comparação com os ratos SHAM, e quando tratado com CDP, especialmente a baixa dosagem de 60 mg/kg, as propriedades da catepsina K e DPD, bem como TRAP no grupo modelo OVX foram notavelmente inibidas em 67,3 por cento, 41,4 por cento e 25,9 por cento, respectivamente, em comparação com os ratos no grupo modelo OVX.

3.5. Efeitos do CDP na Vagina e no Uterino, bem como nos Pesos Corporais Inteiros. Diferenças não significativas nos pesos iniciais de todo o corpo dos ratos foram observadas antes do tratamento em seis grupos (Figura 6). No entanto, a operação de ovariectomização levou a um aumento significativo no peso corporal final dos ratos no grupo modelo OVX, que é de quase 36,0 por cento, enquanto os pesos úmidos do útero e da vagina diminuíram drasticamente em quase 9{{6} },0 por cento e 60,0 por cento, respectivamente, em comparação com os ratos SHAM (p < 0 001). Embora o conteúdo de ERR não tenha apresentado diferença significativa entre os grupos OVX e SHAM, todos os grupos de tratamento, incluindo CDP e EV, aumentaram significativamente o nível de ERR. Além disso, quando tratados com EV, os pesos corporais inteiros acima, bem como a perda de pesos vaginais e uterinos de ratos OVX foram parcialmente revertidos (p <0 001), mas não afetados pela intervenção CDP.

3.6. Efeitos do CDP nos níveis séricos de MDA, SOD e GSH. Não houve diferença estatisticamente significativa nas propriedades de soro SOD e GSH entre os grupos modelo SHAM e OVX; como a Figura 7 descreve, uma tendência crescente em GSH pode ser observada entre os dois grupos acima. Além disso, o nível sérico de MDA foi acentuadamente aumentado em quase 50 por cento nos ratos do grupo modelo OVX quando comparado com os ratos SHAM. A atividade do SOD não foi influenciada pelo tratamento com CDP, enquanto a propriedade do GSH foi significativamente melhorada pela intervenção do CDP, e o CDP diminuiu notavelmente o nível de MDA em 33,9% e 42,4% nas doses de 60 e 240 mg/kg, respectivamente ( p < 0 001).

3.7. Efeitos do CDP nos Níveis de Expressão de Proteínas. Nossos dados, mostrados na Figura 8, sugeriram que o tratamento com CDP diminuiu significativamente os níveis de proteína de TRAF6, RANK e RANKL em comparação com o controle. As vias de sinal a jusante, incluindo NF-κB, foram suprimidas e PI3K/AKT foram estimuladas pela intervenção do CDP, evidenciado pela expressão de regulação negativa de NF-κB-p65, enquanto PI3Kp85 e AKT1 foram regulados positivamente. Consequentemente, a expressão de NFAT2 diminuiu significativamente e cFos aumentou após o tratamento com CDP na concentração de 0.001-0,1 mg/mL. Um mecanismo sugerido é descrito na Figura 9, onde CDP downregulated os níveis de RANKL e RANK, levando à redução das quantidades de ligação deste ligante com seu receptor, e a conexão de RANKL com RANK foi ainda diminuída pela downregulation de TRAF6, seguido pela supressão das vias a jusante, incluindo a via NF-κB, enquanto a via de sinal PI3K/AKT foi estimulada, o que finalmente levou à diminuição da expressão de NFAT2 e aumento do nível de c-Fos.

4. Discussão

Os glicosídeos feniletanóides são componentes solúveis em água de ocorrência natural que existem amplamente no reino das plantas medicinais [11]. Até agora, os compostos de glicosídeos feniletanóides atraíram cada vez mais pesquisadores devido ao seu papel evidente no tratamento de várias doenças e anormalidades humanas [13]. Várias frações e compostos bioativos antiosteoporóticos, incluindo polifenóis e glicosídeos feniletanóides, foram identificados e isolados de dezenas de ervas medicinais naturais [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola é bem conhecido como o "ginseng do deserto", o que implica o perfil de segurança deste TCM comestível [18, 19]. Como uma erva tônica geral e um alimento natural para a saúde que há muito é usado nos países asiáticos, a C. deserticola exibiu uma função benéfica para o aumento da força dos rins.

Verificou-se que o TCM, tradicionalmente usado para revigorar e manter a essência do rim, era geralmente usado para tratar a osteoporose, tanto in vitro quanto in vivo, dados publicados provaram a atividade antiosteoporótica de C. deserticola [20–23], e os constituintes glicosídeos feniletanóides, incluindo equinacosídeo e acteosídeo, são os principais componentes bioativos existentes nesta planta medicinal comestível; tudo isso sugeria que não apenas o equinacosídeo e o acteosídeo propriamente ditos, mas também outros componentes glicosídeos feniletanóides contidos em C. deserticola eram considerados responsáveis ​​pela propriedade antiosteoporótica dessa erva. Em nosso presente estudo, uma resina macroporosa de segurança favorável foi usada para isolar e enriquecer a fração glicosídeo feniletanóide de C. deserticola e, usando o método HPLC, oito principais componentes glicosídeos feniletanóides, a saber, acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2'-acetilacteoside e 6'-acetilacteoside, foram encontrados na fração glicosídica feniletanóide isolada, e os conteúdos foram 3,6 por cento, 8,8 por cento, 5,0 por cento, 13,3 por cento, 3,3 por cento, 3,6 por cento, 9,9 por cento, e 3,2%, respectivamente. Echinacoside, um dos principais compostos de atividade registrados em C. deserticola [14], provou possuir atividade antiosteoporótica; no entanto, a dosagem de 270 mg/kg era tão alta que limitava sua aplicação clínica posterior [24]. Nos experimentos atuais, a fração glicosídica feniletanóide total com uma dosagem mais baixa de 60-240 mg/kg de peso corporal/dia foi usada em ratos OVX, e os conteúdos dos constituintes identificados eram quase 50 por cento puros nesta fração usando o método HPLC.

Era bem conhecido que o OVX pode causar osteoporose, e um rato OVX era considerado um modelo clássico e adequado para simular a osteoporose pós-menopáusica humana. Ao mesmo tempo, uma diminuição significativa na densidade mineral óssea, microarquitetura óssea trabecular, pesos úmidos uterinos e vaginais e nível de estrogênio, bem como o aumento óbvio na reabsorção óssea e peso corporal, foram observados após a cirurgia de ovariectomia, dos quais estavam em parte devido à perda de estrogênio [25]. Nossos dados, até agora, demonstraram claramente que a OVX de fato induziu a osteoporose pós-menopausa e é sempre acompanhada por um declínio acentuado na qualidade óssea, microarquitetura óssea e pesos úmidos do útero e da vagina. Como o EV é um agente de reposição hormonal geral que tem sido usado na prática clínica, ele foi usado como um controle positivo em nosso experimento in vivo, e o ganho de peso corporal e o peso do útero atrofiado, bem como a densidade mineral óssea deteriorada e a microarquitetura óssea trabecular foram esperadamente revertida pela suplementação de EV.

Diferente do controle positivo, a diminuição dos pesos da vagina e do útero, bem como o ganho de peso corporal total dos ratos no grupo modelo OVX não foram afetados pelo tratamento com CDP, o que implicava que o CDP poderia aumentar a formação óssea sem induzir os efeitos colaterais no corpo e tecidos orgânicos uterinos. Embora os níveis de ERR tenham sido significativamente aumentados pelo tratamento com CDP, foi exatamente como um efeito de fitoestrogênio, pois não foram observados efeitos colaterais nos tecidos orgânicos uterinos e vaginais. Além disso, o tratamento de CDP fortaleceu significativamente a qualidade do osso em ratos OVX que havia se deteriorado pela cirurgia de ovariectomia.

Além disso, os níveis de P e Ca na urina e no soro de ratas OVX também foram usados ​​para refletir o efeito antiosteoporótico, e as concentrações de Ca e P inorgânico eram geralmente dependentes dos níveis de calcitonina e PTH [26]. No presente estudo, embora não tenham sido obtidas tendências significativas de declínio ou aumento no nível de excreção urinária de Ca, P sérico, Ca sérico e PTH em ratos do grupo modelo OVX, os níveis urinários significativos de P e calcitonina (p < { {1}}) foram observados. Consistente com os dados publicados de que a deficiência de estrogênio causada pela cirurgia de ovariectomia sempre levou a uma diminuição do nível de calcitonina no sangue, esta diminuição da calcitonina sérica finalmente levou a um aumento do nível de PTH, onde o Ca era considerado o principal regulador da secreção de PTH. Como a concentração de PTH não mostrou diferença significativa entre os grupos OVX e SHAM no presente estudo, o nível de Ca no soro e na urina também não exibiu alterações óbvias entre os dois grupos acima.

No entanto, foi obtida uma tendência de queda significativa no nível de calcitonina entre os grupos OVX e SHAM e, consequentemente, o conteúdo de P na urina de OVX foi fortemente diminuído. Acreditamos que os dados acima podem explicar o fenômeno contraditório de por que a excreção urinária do nível de Ca em ratos OVX não mostrou nenhuma mudança óbvia em comparação com ratos SHAM, e esse fenômeno também pode estar relacionado ao aumento da taxa de remodelação óssea [27] . Após o tratamento com CDP, os níveis de P e Ca no soro foram notavelmente aumentados, e o conteúdo de P na urina foi diminuído em ratos OVX, o que refletiu que o CDP poderia não apenas prevenir a excreção de elementos minerais ósseos, mas também aumentar o conteúdo sérico desses elementos, suprimindo indiretamente a perda óssea.

Além disso, os marcadores de formação e reabsorção óssea, bem como as enzimas antioxidantes, incluindo SOD e GSH, também foram empregados para explicar os mecanismos antiosteoporóticos subjacentes da CDP. Semelhante aos dados publicados, o nível de ALP em ratos do grupo modelo OVX exibiu uma tendência de aumento não estatisticamente significativa que indica uma taxa acelerada de remodelação óssea na osteoporose pós-menopausa [10]. No entanto, após o tratamento com o CDP (60, 120 e 240 mg/kg/dia), a propriedade de ALP foi significativamente aumentada. Era bem conhecido que o OVX causava um declínio acentuado dos níveis de estrogênio, o que geralmente leva a uma reabsorção óssea excedida e estresse oxidativo [28], evidenciado pelos níveis de TRAP, catepsina K e DPD, bem como MDA notavelmente regulados positivamente em ratos do Grupo de modelos OVX.

No entanto, essas deteriorações foram parcialmente melhoradas pela intervenção do CDP. Além disso, o tratamento de ratos OVX com CDP (60 e 240 mg/kg) demonstrou um aumento significativo na atividade de GSH (p < 0 05). Os resultados acima implicaram que o CDP exibiu um efeito terapêutico na osteoporose induzida por OVX, e esses efeitos foram ambos aumentando a formação óssea e suprimindo a reabsorção óssea, bem como melhorando o sistema antioxidante ósseo.

A ativação de RANK por seu ligante RANKL estimulou a expressão de NFAT2 e c-Fos via PI3K/AKT e sinalização de NF-κB [29]. O NF-κB provou ser essencial para a osteoclastogênese, pois a interrupção do NF-κB pode levar a uma diferenciação prejudicada dos osteoclastos com um fenótipo osteoporótico, e as expressões de c-Fos reguladas positivamente por NF-κB e NFAT2 reguladas negativamente durante a osteoclastogênese induzida por RANKL/RANK/TRAF. Para estimar a influência benéfica do CDP na osteoclastogênese mediada por NFAT2 e c-Fos, os níveis de expressão de RANKL e RANK foram analisados. Esperava-se que o CDP inibisse significativamente os níveis de NFAT2 e estimulasse os níveis de c-Fos ao regular negativamente as expressões de RANKL e RANK.

Enquanto isso, o próprio RANK carecia de propriedade intrínseca de quinase, a menos que fosse acompanhado por TRAF6 para acionar a sinalização downstream [3]. O CDP também regulou negativamente a expressão de TRAF6, o que levou à redução significativa das quantidades de ligação de RANKL e RANK. Um mecanismo antiosteoporótico hipotético de CDP em ratos OVX cobriu as vias de sinalização acima, e os reguladores foram descritos na Figura 9. Concisamente, CDP diminuiu os níveis de TRAF6, RANKL e RANK, suprimindo assim as vias de sinalização a jusante, incluindo PI3K/AKT e NF-κB, que são desencadeados por RANKL/RANK e, finalmente, reduziram as expressões e atividades das principais proteínas osteoclastogênicas NFAT2 e c-Fos. Portanto, vários indícios de dados implicam o efeito benéfico do CDP no metabolismo ósseo de ratos OVX, principalmente por meio das vias PI3K/AKT e NF-κB mediadas por RANKL/RANK/TRAF6-.

5. Conclusão

Em resumo, os glicosídeos feniletanóides totais, isolados de C. deserticola, exibiram efeitos benéficos significativos na osteoporose pós-menopausa de ratas OVX, e o potencial terapêutico na supressão da perda óssea foi principalmente através da estimulação da formação óssea e inibição da reabsorção óssea, bem como melhorando o antioxidante ósseo sistema; os mecanismos podem estar relacionados à ativação de NF-κB induzida por RANKL/RANK/TRAF6-e inativação de PI3K/AKT, bem como estimulação de c-Fos e supressão de NFAT2 e, finalmente, a diferenciação de osteoclastos foi inibida.

Abreviaturas

AKT: proteína quinase B

ALP: fosfatase alcalina

BGP: proteína gla óssea

BMC: conteúdo mineral ósseo

CDP: Fração glicosídica feniletanóide de C. deserticola

CK: Catepsina K

TC: Calcitonina

DPD: Desoxipiridinolina

ERR: Receptor alfa relacionado ao estrogênio

EV: valerato de estradiol

GSH: Glutationa

l-PTH: paratormônio intacto

MCSF: Fator estimulador de colônia de macrófagos

MDA: Malondialdeído

NFAT2: Fator nuclear de células T ativadas c2

NF-κB: Fator nuclear kappa B

OPG: Osteoprotegerina

OVX: Ovariectomizada

PhGs: glicosídeos feniletanóides

PI3K: Fosfoinositídeo 3-quinase

RANK: Ativador do receptor do fator nuclear kappa B

RANKL: Receptor ativador do ligante do fator nuclear kappa B

ROI: região de interesse

SOD: Superóxido dismutase

Tb. N: número trabecular

Tb.Sp: separação trabecular

Tb.Th: Espessura trabecular

MTC: Medicina Tradicional Chinesa

TMC: conteúdo mineral tecidual

DTM: Densidade mineral tecidual

TNF: Fator de necrose tumoral

TRAF6: fator 6 associado ao receptor do fator de necrose tumoral

TRAP: Fosfatase ácida resistente ao tartarato.

Disponibilidade de dados

Os dados usados ​​para apoiar as descobertas deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação.

Conflitos de interesse

Os autores não tiveram nenhum conflito de interesse.

Contribuições dos Autores

XM projetou e supervisionou os experimentos; SD e LY realizaram a maioria dos experimentos e redigiram o manuscrito; BZ e JL realizaram a análise de Western blot e participaram de experimentos com animais; YD analisou os dados; QT e PY revisaram o manuscrito. Todos os autores revisaram o manuscrito. Lingling Yang e Shuqin Ding contribuíram igualmente para o manuscrito.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), National Natural Science Foundation of China (No. 81560684), Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), Ningxia Key Research and Programa de Invenção de Cooperação Científica e Tecnológica do Oriente e do Ocidente (Nos. 2017BY084 e 2017BY079) e a Fundação West Light da Academia Chinesa de Ciências-Jovens Cientistas do Ocidente 2017.

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