BCAT2 molda um microambiente tumoral não inflamado e induz resistência à imunoterapia anti-PD-1/PD-L1, regulando negativamente as quimiocinas pró-inflamatórias e a imunidade anticâncer
Oct 25, 2023
Para melhorar a taxa de resposta da monoterapia do bloqueio do ponto de verificação imunológico (ICB), é necessário encontrar um alvo emergente na terapia combinada. Através da análise de indicadores relacionados ao microambiente tumoral (TME), é validado que o BCAT2 molda um TME não inflamado no câncer de bexiga. Os resultados da multiômica indicam que o BCAT2 tem um efeito inibitório no recrutamento de linfócitos citotóxicos, restringindo as atividades das vias pró-inflamatórias relacionadas às citocinas / quimiocinas e à via da quimiotaxia das células T. Os imunoensaios revelam que a secreção de quimiocinas relacionadas às células T CD8+ mantém uma correlação negativa robusta com BCAT2, gerando uma tendência decrescente de células T CD8+T ao redor das células tumorais BCAT2+ de longe a aproximar. O cotratamento da deficiência de BCAT2 e do anticorpo anti-PD-1 tem um efeito sinérgico in vivo, implicando no potencial do BCAT2 na terapia combinada. Além disso, o valor do BCAT2 na previsão da eficácia da imunoterapia é validado em múltiplas coortes de imunoterapia. Juntos, como molécula-chave no TME, o BCAT2 é um alvo emergente em combinação com o ICB e um biomarcador para orientar a terapia de precisão.
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1. Introdução
O câncer de bexiga (BLCA) é uma das doenças malignas mais comuns no sistema urinário.[1] Estima-se que mais de 430{2}} pacientes sejam diagnosticados em todo o mundo todos os anos.[2] Apesar do tratamento cirúrgico radical, quase metade dos pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo apresenta metástase.[3] Portanto, a terapia sistêmica desempenha um papel importante no câncer de bexiga avançado. Com o desenvolvimento da imunoterapia, especialmente do bloqueio do ponto de controle imunológico (ICB), o acúmulo de evidências indicou que o ICB tem um excelente desempenho na eliminação da carga tumoral.[4] No entanto, ainda há um grande número de pacientes que não respondem à monoterapia com ICB devido à resistência primária ou resistência adquirida.[5] Para resolver a necessidade clínica não satisfeita, a combinação de outras terapias racionais com ICB proporciona uma visão totalmente nova sobre a resistência à monoterapia. O microambiente tumoral (TME) é um sistema complicado e tem um impacto profundo na eficácia da imunoterapia.[6] Com nível de infiltração insuficiente de linfócitos T citotóxicos (CTLs), o TME não inflamado foi considerado um fator crítico na falha em gerar uma resposta imune antitumoral potente durante a imunoterapia.[7] Portanto, é vital encontrar uma molécula-chave que possa remodelar o TME não inflamado em TME inflamado e que tenha potencial para ser um alvo de terapia combinada. A aminotransferase 2 de cadeia ramificada (BCAT2) é uma enzima essencial no processo de metabolismo dos aminoácidos sulfurados.[8] Li et al. descobriram que o BCAT2 era essencial para o desenvolvimento do câncer de pâncreas, mediando o catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs).[9] Lee et al. demonstraram que a deficiência de BCAT2 inibiu o crescimento tumoral do adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) regulando o metabolismo lipídico.[10] Embora existam várias pesquisas documentadas de que o BCAT2 influenciou diretamente o processo biológico dos tumores, regulando as vias relacionadas ao metabolismo, seu papel na regulação do estado imunológico do TME nunca foi explorado. Em nosso estudo, através de uma análise abrangente de indicadores relacionados ao TME na coorte Xiangya BLCA e em múltiplas coortes públicas de BLCA, verificamos que o BCAT2 provavelmente molda um TME imunossupressor no BLCA. Para explorar mecanismos moleculares, realizamos ainda sequenciamento de RNA unicelular (siRNA seq) e seq de RNA em massa, revelando que BCAT2 desempenha um papel repressivo no recrutamento de CTLs para TME, inibindo atividades de vias de sinalização associadas a citocinas/quimiocinas e Vias de sinal de quimiotaxia de células T. In vitro, multiimunoensaios demonstraram que a secreção de quimiocinas relacionadas com CTL tem correlações negativas estáveis com a expressão de BCAT2. De acordo com a análise panorâmica do microarray tecidual (TMA), encontramos uma relação mutuamente exclusiva entre CTLs e células tumorais BCAT 2+ na distribuição espacial. In vivo, um efeito cooperativo foi revelado na terapia combinada de perda de BCAT2 e ICB. Mais importante ainda, o seu papel na previsão do efeito curativo da imunoterapia foi validado na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA.
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2. Resultados
2.1. BCAT2 correlaciona-se negativamente com a imunidade anticâncer de TME em BLCA
Na maioria dos tipos de câncer, a expressão de BCAT2 é maior em tecidos cancerígenos do que em tecidos normais (Figura S1A, Informações de Apoio) e seu padrão de expressão em BLCA foi validado na Coorte Xiangya BLCA (Figura S1B, Informações de Apoio). Além disso, o BCAT2 é amplamente expresso em várias linhas celulares de câncer (Figura S1C, Informações de Apoio). Além disso, os resultados da análise abrangente do pan-câncer no sistema de quimiocinas, MHCs, imunoestimuladores e TIICs indicaram que o BCAT2 tem efeitos imunossupressores significativos em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de bexiga (BLCA), câncer de mama (BRCA), câncer de células papilares renais renais carcinoma (KIRP), adenocarcinoma pancreático (PAAD), sarcoma (SARC) e carcinoma de tireoide (THCA) (Figura S2A, B, informações de apoio). Além disso, correlações negativas entre BCAT2 e pontos de controle imunológico inibitório comuns (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 e LAG-3) também foram encontradas (Figura S2C-F, Informações de Apoio ). Através de uma análise abrangente do pan-câncer, descobrimos que o BCAT2 tem o efeito imunossupressor mais profundo no BLCA. Assim, exploramos ainda mais seu papel imunológico no BLCA. Com base no valor mediano da expressão de BCAT2, dividimos os indivíduos no grupo com alto BCAT2 e no grupo com baixo BCAT2 na coorte TCGA-BLCA. Obviamente, uma série de quimiocinas, receptores de quimiocinas, moléculas relacionadas ao MHC e imunoestimuladores foram expressos negativamente no grupo com alto BCAT2 e superexpressos no grupo com baixo BCAT2 (Figura 1A). Um resultado semelhante foi encontrado no ciclo de imunidade ao câncer, que abrange várias etapas essenciais no recrutamento e infiltração de células imunológicas (Figura 1B). Além disso, demonstramos conexões negativas robustas entre os níveis de infiltração de células imunológicas (células CD8+T, células CD4+T, células Nature Killer (NK) e células dendríticas (DC)) e BCAT2 em diferentes algoritmos (Figura 1C). Da mesma forma, menor expressão de genes efetores de células imunes (células T CD8+, células NK, macrófagos, células T auxiliares 1 (Th1) e células DC) foram encontradas no grupo com alto BCAT2 em comparação com o grupo com baixo BCAT2. grupo (Figura 1D). Mais importante ainda, quando correlacionado BCAT2 com pontuação TIS (Figura S3, Informações de Apoio) e pontos de controle imunológico inibitório (Figura 1E), foram reveladas relações negativas óbvias entre eles. Portanto, especulamos que o BCAT2 pode regular negativamente a resposta imune do TME e afetar profundamente a eficácia da imunoterapia. Além disso, os resultados acima foram bem validados em nove coortes BLCA independentes (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 e GSE128702) (Figuras S4-S12, Informações de Apoio). Por fim, verificamos novamente a associação entre BCAT2 e TME na coorte Xiangya BLCA. Consistentemente, a expressão de BCAT2 tem relações negativas com a atividade do ciclo de imunidade ao câncer, níveis de infiltração de TIICs, pontuação TIS e níveis de expressão de pontos de controle imunológico (Figura 2A-C). Coletivamente, revelamos que a alta expressão de BCAT2 forma um TME não inflamado no BLCA e a baixa expressão de BCAT2 forma um TME inflamado no BLCA.
2.2. Explorando o mecanismo de BCAT2 na modelagem de TME por Bulk RNA-seq e siRNA-seq
Na coorte TCGA-BLCA, DEGs entre grupos de alto/baixo BCAT2, grupos de alto/baixo escore imunológico e grupos de alto/baixo escore estromal foram identificados e intersecionados (Figura S13A, Informações de Apoio). Curiosamente, os DEGs relacionados com BCAT2 positivos não tiveram interseção com DEGs relacionados com resultados positivos imunológicos e estromais (Figura 2D). Enquanto isso, o mesmo fenômeno ocorreu em EGs relacionados com negativos entre eles (Figura S13B, Informações de Apoio). Estas descobertas indicaram que o BCAT2 provavelmente regula negativamente as vias imunológicas relacionadas. Coincidentemente, os resultados das análises GO e KEGG revelaram que os DEGs relacionados ao BCAT foram mais significativamente enriquecidos nas vias de migração de leucócitos, ativação de células T e interação citocina-receptor de citocina (Figura 2E, F). Assim, especulamos que o BCAT2 molda um TME não inflamado no BLCA, inibindo as atividades das vias relacionadas às citocinas / quimiocinas. Porém, a característica do sequenciamento bulk NA determina sua limitação, cujo nível de expressão do gene é calculado pelo valor médio de todas as células do tecido. Para superar a limitação, o siRNA foi realizado em três amostras de BLCA. Mais de 19 000 células foram analisadas e classificadas em seis categorias: células epiteliais, células fibroblásticas, células T/NK, células endoteliais, células B e células mieloides (Figura 3A), referem-se a biomarcadores reconhecidos (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 e VWF).[11] Surpreendentemente, o BCAT2 foi expresso principalmente em células epiteliais (EPCAM +), em vez de células endoteliais e células do sistema imunológico. Com base na acumulação de CNV, as células epiteliais EPCAM + foram consideradas células uroteliais malignas. Para validar o padrão de expressão do BCAT2, duas coortes externas de siRNA foram incluídas no estudo. Na coorte de scRNA GSE135337, mais de 36,{31}} células foram processadas e divididas em cinco grupos. O subtipo celular expresso principalmente de BCAT2 ainda era uma célula urotelial da bexiga maligna (Figura 3B). Um padrão de expressão semelhante reapareceu na coorte de siRNA GSE145137 (Figura 3C). Portanto, o padrão de expressão majoritária nas células malignas inferiu que o BCAT2 atua como uma parte imunorreguladora na TME, principalmente por meio de características variadas das células cancerígenas. Com base no nível de expressão de BCAT2, as células uroteliais malignas foram divididas em um grupo com alto BCAT2 e um grupo com baixo BCAT2. A análise GSEA dos termos GO nas coortes de siRNA GSE135337 e GSE145137 revelou que um conjunto de vias relacionadas a citocinas/quimiocinas foram significativamente reguladas negativamente no grupo com alto BCAT2, incluindo produção de quimiocinas, secreção de quimiocinas, regulação da via de sinalização mediada por quimiocinas, resposta à quimiocina, ligação ao receptor de quimiocinas, atividade de citocinas, ligação de citocinas e ligação ao receptor de citocinas (Figura 3D-G; Figura S14B, Informações de Apoio). Enquanto isso, a quimiotaxia de leucócitos, a quimiotaxia de linfócitos, a quimiotaxia de células T e suas vias regulatórias tiveram correlações significativamente negativas com BCAT2 (Figura 3E-I; Figura S14A, Informações de Apoio). A análise GSEA dos termos KEGG indicou que as vias de interação citocina-receptor de citocina e processamento e apresentação de antígenos foram obviamente reguladas negativamente no grupo com alto BCAT2 (Figura 3F). Juntas, a alta expressão de BCAT2 reprime as atividades de citocinas pró-inflamatórias e vias relacionadas às quimiocinas, levando a uma diminuição do nível de infiltração de TIICs, o que, em última análise, molda um TME não inflamado.
Figura 1. BCAT2 correlaciona-se negativamente com imunidade anticâncer em TME de BLCA. A) Padrão de expressão de quimiocinas, receptores de quimiocinas, moléculas de MHC e imunoestimuladores em grupos de alto e baixo BCAT2. B) Atividade do ciclo de imunidade ao câncer em grupos BCAT2 alto e baixo. Sete cores representam sete etapas do ciclo. *p < 0.05; **p <0.01; ***p < 0,001. C) Correlações entre BCAT2 e vários tipos de células imunológicas (células CD8+T, células CD4+T, células DC e células NK) em seis algoritmos independentes. D) Padrões de expressão de múltiplos subtipos de células imunes (células T CD8+, células NK, macrófagos, células Th1 e células DC) genes efetores relacionados em grupos BCAT2 altos e baixos. E) Correlações entre genes efetores relacionados a BCAT2 e ICB. O número no círculo significa coeficiente de correlação.
Figura 2. Validação da função do BCAT2 pela coorte Xiangya BLCA. A) Correlações entre BCAT2/ciclo de imunidade ao câncer (esquerda) e BCAT2/TIICs (direita). As linhas sólidas e pontilhadas significam relações positivas e negativas, a espessura das linhas significa o coeficiente de correlações, as linhas com cores diferentes representam o valor p das correlações. B) Correlações entre genes efetores relacionados a BCAT2 e ICB. C) Correlações entre genes efetores relacionados ao escore BCAT2 e TIS. O número no círculo representa o coeficiente de correlação. D) Intersecção de genes relacionados com BCAT2, escore imunológico e escore estromal positivo. E,F) As 20 principais vias de sinalização de enriquecimento das análises GO e KEGG nos genes2-relacionados ao BCAT.
Figura 3. Explorando o mecanismo do BCAT2 na formação de TME por granel RNA-seq e scRNA-seq. A, B) Gráficos tSNE do padrão de expressão unicelular de BCAT2 na coorte de siRNA Xiangya e na coorte GSE135337. C) Gráfico de violino do padrão de expressão unicelular de BCAT2 na coorte GSE145137. D, E) A análise GSEA do termo GO indica atividades de vias relacionadas a citocinas/quimiocinas e vias relacionadas à quimiotaxia de células imunes entre diferentes grupos BCAT2 na coorte GSE135337. F) A análise GSEA do termo KEGG indica atividades de apresentação de antígeno e interação da via de citocinas e receptores de citocinas entre diferentes grupos BCAT2 na coorte GSE145137. G – I) A análise GSEA do termo GO indica atividades de vias relacionadas a citocinas / quimiocinas, vias relacionadas à quimiotaxia de células imunes e vias relacionadas à migração de células imunes entre diferentes grupos BCAT2 na coorte GSE145137. J, K) Análise GO e KEGG de DEGs entre linhas celulares BCAT2 OE e BCAT2 KD.
2.3. BCAT2 varia padrões de expressão de quimiocinas relacionadas a células T CD8+ e inibe a capacidade citotóxica de CTLs
Para validar as vias de enriquecimento mencionadas acima, linhas celulares de câncer de bexiga humana (T24)/murina (MB49) com superexpressão de BCAT2 (BCAT2 OE) e knockdown de BCAT2 (BCAT2 KD) foram construídas com sucesso (Figura S15A-D, Informações de Apoio) e foram testadas com sequenciamento de RNA de alto rendimento. Expectedgy, a análise GO das linhas celulares T24 revelou que os DEGs foram significativamente enriquecidos nas vias de sinalização mediada por quimiocina, resposta à quimiocina, migração de leucócitos e migração de leucócitos (Figura 3J). A análise da via KEGG das linhagens celulares T24 mostrou que a via de sinalização da quimiocina, a via de interação citocina-receptor de citocina e a via do câncer de bexiga foram significativamente enriquecidas (Figura 3K). Da mesma forma, várias vias críticas relacionadas a citocinas / quimiocinas foram encontradas nas análises GO e KEGG de linhas celulares MB49 (Figura S16A, B, Informações de Apoio). Evidentemente, várias citocinas e quimiocinas desempenham papéis críticos na regulação da TME. Portanto, é necessário rastrear citocinas/quimiocinas que são especificamente reguladas pelo BCAT2. Assim, vários imunoensaios ProcartaPlex foram aplicados para identificar a variação da secreção de citocinas / quimiocinas em linhas celulares de cancro da bexiga humanas e de ratinho. Surpreendentemente, os níveis de secreção de CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL10 foram regulados positivamente em linhas celulares BCAT2-KD humanas e murinas e regulados negativamente em linhas celulares BCAT{24}}OE humanas e murinas (Figura 4A, B; Figura S16C , D, Informações de Apoio). Em estudos anteriores, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 foram consideradas quimiocinas cruciais para o recrutamento de células T CD8+ para TME.[12] Consequentemente, para uma melhor análise abrangente das quimiocinas relacionadas às células T CD8+, todas elas foram incluídas para validação adicional. Surpreendentemente, os níveis de expressão de RNA de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 foram significativamente regulados negativamente nas células BCAT2 OE e significativamente regulados positivamente nas células BCAT2 KD (Figura 4C). Da mesma forma, os resultados do ELISA mostraram que os níveis de proteína secretada também tiveram correlações negativas com a expressão de BCAT2 (Figura 4D). Essas descobertas indicaram que a superexpressão de BCAT2 inibe os níveis de transcriptoma e proteína de quimiocinas relacionadas às células T CD8+, incluindo CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10. Mais importante ainda, o ensaio de quimiotaxia revelou que a linhagem celular BCAT2 OE inibiu significativamente a capacidade de quimiotaxia das células T CD 8+ (Figura 4E, à esquerda). Por outro lado, os sobrenadantes celulares da linhagem celular BCAT2 KD foram capazes de atrair mais células T CD8+ do que seu controle negativo (Figura 4E, à direita). Essas descobertas indicaram que o BCAT2 pode afetar a capacidade de quimiotaxia das células T CD8+, regulando os níveis de mRNA e proteína de quimiocinas relacionadas. Além disso, um ensaio de morte de células cancerígenas mediado por células T foi utilizado para explorar a variação da citotoxicidade das células T após contacto direto com células tumorais que expressam um nível diferente de BCAT2. Como mostrado na Figura 4F e na Figura S17A, B (Informações de Apoio), a superexpressão de BCAT2 nas células tumorais suprimiu diretamente a função citotóxica das células T e o knockdown de BCAT2 nas células tumorais reverteu significativamente a tendência. A análise de citometria de fluxo das células T coletadas descobriu que as proporções de células T CD8+TNF-𝛼+ e células T CD8+IFN-𝛾+ tinham diferenças significativas em diferentes sistemas de cocultura, o que significou uma grande mudança na a atividade das células T CD 8+ (Figura 4G; Figura S17C, D, Informações de Apoio). Coletivamente, o BCAT2 é capaz de inibir a capacidade de recrutamento de células T CD8+, regulando os níveis de quimiocinas relacionadas, bem como suprimindo atividades de CTLs por contato direto. Além disso, o resultado do ensaio de morte de células cancerosas mediado por células T (sem grupo de células T) pode inferir que o BCAT2 desempenha um papel oncogênico no câncer de bexiga. Portanto, o ensaio de colônia de placas e o ensaio de migração/invasão transwell foram utilizados para validar esta hipótese. Como previsto, a superexpressão de BCAT2 aumentou significativamente a proliferação, migração e capacidade de invasão de células tumorais, e o knockdown de BCAT2 suprimiu acentuadamente esses comportamentos (Figura S18A-F, Informações de Apoio).
2.4. Validação da relação espacial exclusiva entre células tumorais BCAT2+ e células T CD8+ por TMA da coorte Xiangya BLCA
De acordo com os resultados de experimentos em massa de RNA-seq, scRNA-seq e vitro, demonstramos que BCAT2 desempenha um papel imunossupressor no BLCA, suprimindo o recrutamento e a citotoxicidade de células T CD8+. No entanto, a interação de células tumorais BCAT2+ e células T CD8+ ainda é desconhecida no nível do tecido humano. Na coorte Xiangya BLCA, imagens representativas e uma pontuação geral de IHC revelaram uma correlação negativa entre BCAT2 e CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Figura 5A, B). A coloração IF multicolorida de células tumorais BCAT2+ (BCAT2+CK19+) e células T BCAT2+CD8+ foi realizada em TMA e analisada semiautomática usando o Plataforma de quantificação panorâmica TissueFAXS. Como mostrado na Figura 5C, o escopo de expressão de BCAT2 e CK19 foi amplamente sobreposto. Por outro lado, o escopo de expressão de BCAT2 e CD8 era distinto e separado. As proporções detalhadas de coexpressão de células BCAT2+CK19+ e células BCAT2+CD8+T foram 87,29% e 5,09% (Figura 5D, E), o que foi consistente com o padrão de expressão de BCAT2 em scRNA-seq. No TMA geral, ainda havia uma diferença significativa na proporção de coexpressão entre eles (Figura S19A, Informações de Apoio). Mais importante ainda, na análise de gradiente de distância multidimensional (0–25, 25–50, 50–100 e 100–150 μm) em torno das células tumorais BCAT2+, as contagens de células T CD8+ aumentaram gradualmente de perto para longe (Figura 5F; Figura S19B, Informações de Apoio). Juntos, demonstramos que, no nível do tecido humano, o BCAT2 também é expresso principalmente em células tumorais, e a célula tumoral BCAT2+ tem uma relação espacial exclusiva com a célula T CD8+.
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2.5. Perda de BCAT2 aumenta a eficácia da terapia anti-PD-1
Com um impacto adverso proeminente no TME e uma estreita correlação negativa com o bloqueio inibitório do checkpoint, desperta grande interesse explorar o efeito sinérgico da perda de BCAT2 e do tratamento anti-PD- 1. Antes da imunoterapia, um modelo de câncer de bexiga subcutâneo foi construído por BCAT2 KD e controlou linhas celulares murinas. Em seguida, a terapia anti-PD-1 e a terapia de controle foram aplicadas a camundongos portadores de tumor (Figura 6A). Consistentemente com seu papel oncogênico e mecanismo de regulação de quimiocinas in vitro, a deficiência de BCAT2 inibiu o crescimento do tumor e prolongou o tempo de sobrevivência in vivo, regulando positivamente as quimiocinas relacionadas ao CD8+T (Figura 6B-E; Figura S20A, Informações de Apoio). No aspecto da eficácia da imunoterapia, embora a monoterapia anti-PD-1 pudesse diminuir parcialmente a carga tumoral, o cotratamento de BCAT2 KD e anticorpo monoclonal anti-PD-1 (mab) indicou um melhor efeito de supressão tumoral e ganhou mais benefício de sobrevivência. No dia agendado, os tumores foram colhidos e preparados para análise posterior. Uma parte deles foi digerida em suspensão unicelular e realizada análise de citometria de fluxo. Com uma população semelhante de leucócitos e células T (Figura S20B-E, Informações de Apoio) no tumor, uma proporção maior de células T CD8+ foi demonstrada no grupo com deficiência de BCAT2 do que no grupo de controle negativo. Da mesma forma, o grupo de terapia combinada teve uma infiltração mais massiva de CTLs do que o grupo de monoterapia (Figura 6F-H). Mais importante ainda, os indicadores de citotoxicidade (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 e Perforin) de CTLs também foram reforçados em tumores murinos com perda de BCAT2 e tratamento combinado em comparação com o controle correspondente (Figura 6G, I – L). As outras partes dos tumores foram transformadas em secções congeladas e implementadas coloração IF. Como esperado, a densidade de células T CD8+ na região de interesse (ROI) mostrou a mesma tendência com a análise de citometria de fluxo (Figura 6M, N). Esses achados indicaram que a deficiência de BCAT2 nas células tumorais pode moldar um TME inflamado e ter grande eficácia no tratamento da imunoterapia. Para descobrir o papel das células T CD8+ no efeito sinérgico do co-tratamento, CD8𝛼 mab foi aplicado para antagonizá-los em camundongos imunocompetentes (Figura S21A, Informações de Apoio) e validou seu efeito de depleção por citometria de fluxo e IF (Figura S21B, C, Informações de Apoio). Obviamente, após a depleção, a carga tumoral e o tempo de sobrevivência foram significativamente revertidos (Figura S21D-G, Informações de Apoio). Essas descobertas indicaram que as células T CD8+ desempenham um papel indispensável no efeito sinérgico da terapia combinada.
Figura 4. BCAT2 varia os padrões de expressão de quimiocinas relacionadas às células T CD8+ e inibe a capacidade citotóxica dos CTLs. A,B) Mapas de calor de múltiplos imunoensaios ProcartaPlex exibem variação de secreção de citocinas e quimiocinas comuns em BCAT2 OE, BCAT2 KD e grupos de controle negativo (n=3 por grupo). C,D) Os histogramas mostram níveis normalizados de expressão de mRNA e concentrações de secreção de proteínas de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 em BCAT2 OE (esquerda), BCAT2 KD (direita) e grupos de controle negativo (n {{ 15}} por grupo). *p < 0.{{20}}5; **p <0.01; ***p < 0,001. E) O ensaio de quimiotaxia indica diferentes capacidades de quimiotaxia de CTLs em BCAT2 OE, BCAT2 KD e grupos de controle negativo (n=3 por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01. F) O ensaio de morte de células cancerosas mediado por células T indica diferentes habilidades de morte de células T cocultivadas com BCAT2 OE, BCAT2 KD e linhas celulares de controle negativo (n=3 por grupo). G) A análise de citometria de fluxo indica diferentes atividades de células T CD8+ em diferentes grupos de cocultura (n=3 por grupo).
Figura 5. Validação de relações espaciais exclusivas de células tumorais BCAT2+ e células T CD8+ por TMA da coorte Xiangya BLCA. A) Imagem IHC de BCAT2 e CD8 em tipos de EMT inflamados e não inflamados. Barra de escala: 50 μm. B) Correlação entre BCAT2 e CD8 com base nas pontuações IHC deles no TMA geral. C) Imagem IF multicolorida de BCAT2, CK19, CD8 e índice de combinação em tipos de TME inflamados e não inflamados. Célula BCAT2+ (rosa), célula CK19+ (ciano), célula CD8+T (laranja) e núcleo da célula (azul). Barra de escala: 50 μm. D,E) Taxas de coexpressão detalhadas de células BCAT2+CK19+ e BCAT2+CD8+ na amostra típica. F) Análise de gradiente de distância (0–25, 25–50, 50–100 e 100–150 μm) de células T CD8+T ao redor de células BCAT2+CK19+ no típico amostra.
Figura 6. A perda de BCAT2 aumenta a eficácia da terapia anti-PD-1. A) Fluxograma do plano de tratamento. B) Tumores colhidos de diferentes regimes terapêuticos (n=5 por grupo). C – E) Quantificação do volume tumoral, peso corporal e tempo de sobrevivência em diferentes regimes terapêuticos (n=5 por grupo). ns: sem significância; *p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Além disso, juntamente com as células tumorais, uma pequena proporção de BCAT2 também é expressa em células T CD8+. Portanto, exploramos ainda mais se os diferentes níveis de expressão de BCAT2 em células T CD8+ podem afetar suas atividades. Após a coloração da suspensão unicelular do baço murino com BCAT2 e anticorpos fluorescentes relacionados a células T, comparamos proporções de células CD8+ TNF-𝛼+T e CD8+ IFN-𝛾+T entre BCAT Grupos 2+CD8+ e BCAT2-CD8+. Curiosamente, descobrimos que as proporções eram semelhantes entre os dois grupos, revelando que a atividade da célula T CD8+é independente do seu nível de expressão de BCAT2 (Figura S22A-C, Informações de Apoio).
2.6. BCAT2 prevê resposta à imunoterapia em várias coortes de imunoterapia do mundo real
As descobertas acima demonstraram um papel imunossupressor do BCAT2 na EMT e o efeito sinérgico da combinação da perda de BCAT2 com terapia anti-PD-1. No entanto, o seu potencial preditivo sobre a eficácia da imunoterapia não é claro. Portanto, na coorte TCGA-BLCA, os escores de enriquecimento das vias relacionadas à imunoterapia foram comparados entre grupos de BCAT2 alto e baixo. Como mostrado na Figura S23A (Informações de Apoio), o grupo com baixo BCAT2 tinha genes mais ativos nas vias relacionadas à imunoterapia, o que pode inferir que a baixa expressão de BCAT2 representa um estado mais sensível à imunoterapia. Para validação adicional, 58 pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo (MIBC) que aceitaram terapia neoadjuvante anti-PD -1 em nosso hospital foram incluídos na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. Imagens representativas de IHC, IF e CT do respondedor e do não respondedor implicaram que o nível de expressão de BCAT2 tem uma relação estreita com a eficácia da imunoterapia – um indivíduo com um baixo nível de expressão de BCAT2 tem maior probabilidade de responder à imunoterapia do que um indivíduo com um baixo nível de expressão de BCAT2. alto nível de expressão de BCAT2 (Figura 7A-C). Além disso, a pontuação IHC da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA e a matriz de expressão de mRNA da coorte IMvigor210 indicaram uma correlação negativa robusta entre BCAT2 e PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0,41, p < 0,001) (Figura S23B, C, Informações de Apoio). Portanto, comparamos diretamente a eficácia da imunoterapia entre grupos de BCAT2 alto e baixo na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA e descobrimos que o grupo de BCAT2 baixo teve uma proporção significativamente maior de respondedores do que o grupo de BCAT2 alto (p=0.001) (Figura 7D). Além disso, avaliamos os valores de predição de BCAT2, PD-L1 e índice de combinação (BCAT2+PD-L1) na resposta patológica à imunoterapia e encontramos o ótimo desempenho do índice de combinação (BCAT2+PD- L1) na precisão da previsão (Figura 7E). Inspiradoramente, no aspecto do resultado de sobrevivência, o grupo com baixo BCAT2 teve uma sobrevida livre de doença (SLD) mais longa do que o grupo com alto BCAT2 (p=0 0,032) (Figura 7F), demonstrando o valor prognóstico do BCAT2 em Imunoterapia com BLCA. Na clínica, os indivíduos com ETM no deserto têm maior probabilidade de ter uma eficácia imunoterápica limitada do que os indivíduos com ETM inflamada, destacando ainda mais a importância dos indicadores de previsão. Consequentemente, selecionamos todos os indivíduos com EMT no deserto na coorte IMvigor210 e conduzimos a avaliação abrangente. Numa comparação direta do nível de expressão de BCAT2 entre diferentes grupos de resposta, o grupo CR (respondedor) apresentou um nível de expressão de BCAT2 significativamente menor do que os grupos SD e PD (não respondedores) (Figura 7G). Mais importante ainda, o índice de combinação (BCAT2+PD-L1) também teve um excelente desempenho na precisão da previsão (Figura 7H). Embora não tenha havido diferença significativa na sobrevida global (SG) entre grupos de BCAT2 alto e baixo no tipo deserto da coorte IMvigor210, a tendência do prognóstico ainda foi semelhante ao resultado da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA (Figura 7I). Além do PD-L1, a instabilidade de microssatélites (MSI) é outro preditor essencial da eficácia da imunoterapia. O status de reparo de incompatibilidade (MMR) – MMR proficiente (pMMR) e MMR deficiente (dMMR) mantêm alta conformidade com MSI de baixa frequência (MSI-L) e MSI de alta frequência (MSI-H).[13] Portanto, conduzimos uma avaliação abrangente de todos os indivíduos da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA com base nos resultados de coloração de quatro genes marcadores MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). O resultado revelou uma proporção significativamente maior de dMMR (MSI-H) no grupo com baixo BCAT2 em comparação com o grupo com alto BCAT2 (p=0 0,02) (Figura S23D, E, Informações de Apoio). Além disso, avaliamos os valores preditivos de MMR, BCAT2 e índice de combinação (MMR + BCAT2) na eficácia da imunoterapia e descobrimos que o índice de combinação (MMR + BCAT2) teve um desempenho elegível na precisão da predição (Figura S23F, Informações de Apoio). Juntos, esses achados demonstraram que o BCAT2 está qualificado para atuar como um preditor complementar da eficácia da imunoterapia com BLCA. Finalmente, o valor preditivo do BCAT2 em resposta à imunoterapia foi explorado em vários tipos de cancro. Descobrimos que indivíduos com alta expressão de BCAT2 apresentaram uma taxa de resposta significativamente pior (p=0 0,04) na coorte GSE35640 (melanoma) (Figura 7J). Embora não tenha havido diferenças significativas na taxa de resposta entre grupos de BCAT2 alto e baixo em GSE173839 (câncer de mama), GSE135222 (NSCLC) e coorte Gide 2019 (melanoma), os pacientes com baixa expressão de BCAT2 ainda tinham maior probabilidade de ter uma resposta positiva à imunoterapia (Figura 7K-M).
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2.7. O valor do BCAT2 na previsão do subtipo molecular e na orientação da terapia de precisão
Com a grande heterogeneidade existente na classificação histológica tradicional, evidências crescentes mostram que o subtipo molecular é capaz de fornecer uma classificação mais precisa com base no perfil do transcriptoma em BLCA.[14] Além disso, com características imunológicas semelhantes no mesmo subtipo, a classificação molecular tem grande potencial para prever ETM e orientar a terapia de precisão na clínica.[15] Através de uma análise abrangente de diferentes sistemas de subtipos moleculares na coorte TCGA-BLCA, descobrimos que indivíduos com baixa expressão de BCAT2 são mais provavelmente classificados em um subtipo basal, acompanhado por vias ativadas de diferenciação basal, diferenciação EMT, diferenciação imunológica, resposta de interferon, e assim por diante. Indivíduos com alta expressão de BCAT2 são classificados principalmente em subtipos luminais, acompanhados por vias ativas de diferenciação luminal, diferenciação urotelial e Ta (Figura S24A, Informações de Apoio). De acordo com o consenso do subtipo molecular, o subtipo basal tem maior nível de infiltração de linfócitos efetores e uma via de sinalização de IFN-𝛾 mais ativa do que o subtipo luminal,[16] o que implica uma melhor eficácia da imunoterapia. Em seguida, a AUC foi utilizada para avaliar a precisão da previsão. Surpreendentemente, exceto o sistema de subtipo Baylor (AUC=0 0,76), a maior parte da AUC estava além de 0 0,90 em outros sistemas (Figura S24B, Informações de Apoio), o que significa uma precisão robusta de previsão de BCAT2 em o subtipo molecular. Para explorar ainda mais o seu papel na previsão da eficácia de outras terapias, comparamos a atividade da terapia alvo do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e as vias relacionadas à radioterapia entre grupos de alto e baixo BCAT2. Com atividades obviamente reguladas positivamente, os pacientes no grupo com baixo BCAT2 têm maior probabilidade de ter uma resposta positiva à terapia e radioterapia com alvo de EGFR (Figura S24C, Informações de Apoio). Para aumentar a confiabilidade da previsão sobre subtipo molecular e sensibilidade ao tratamento, oito coortes de BLCA (coorte Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 e E-MTAB-1803) e uma coorte de imunoterapia BLCA (IMvigor210) foram aplicado para validação externa. Juntamente com a excelente precisão da previsão, resultados semelhantes foram encontrados nessas coortes (Figuras S25 a S27, Informações de Apoio). A doença hiperprogressiva (HPD) é um estado extremamente insensível à imunoterapia. Para explorar a influência do BCAT2 no HPD, biomarcadores associados ao HPD foram coletados de estudos anteriores [17] e o CNV dos biomarcadores foi comparado entre grupos de BCAT2 baixo e alto. Exceto para EGFR, as taxas de amplificação de CNV de outros biomarcadores associados a HPD positivos (símbolo vermelho) foram maiores no grupo com alto BCAT2, especialmente MDM2 (p=00,0116). As taxas de deleção de CNV de biomarcadores associados a HPD negativos (símbolo verde) foram mais baixas no grupo com alto BCAT2 (Figura S24D, Informações de Apoio). O resultado indicou que pacientes com alta expressão de BCAT2 apresentam risco potencial de HPD durante a imunoterapia. A quimioterapia neoadjuvante (NAC) é uma terapia crucial na BLCA. Os marcadores que preveem a resposta ao NAC no BLCA foram coletados de uma revisão de Buttigliero et al.[18] e suas taxas de mutação foram comparadas entre os dois grupos. Com base em taxas gerais de mutação mais altas de biomarcadores e mutação mais frequente de RB1 no grupo com baixo BCAT2, especulamos que o indivíduo com baixa expressão de BCAT2 tem uma melhor eficácia de NAC na clínica (Figura S24E, Informações de Apoio). Assim, a base de dados Drugbank foi utilizada para comparar as eficácias de vários regimes de quimioterapia comuns entre dois grupos e descobriu que indivíduos com baixa expressão de BCAT2 têm maior probabilidade de responder à quimioterapia. Além disso, o grupo com baixo BCAT2 também apresentou melhores eficácias em regimes comuns de imunoterapia e terapia com ERBB. Inesperadamente, pacientes com alta expressão de BCAT2 provavelmente obtêm melhores efeitos curativos na terapia antiangiogênica (Figura S24F, Informações de Apoio). Coletivamente, os indivíduos com baixa expressão de BCAT2 pertencem a um subtipo molecular inflamado, o subtipo basal, o que significa uma resposta mais positiva à imunoterapia, quimioterapia, radioterapia, terapia alvo de EGFR e terapia ERBB. Infelizmente, os pacientes com alta expressão de BCAT2 apresentam uma resposta fraca a estes tratamentos. No entanto, a terapia antiangiogênica pode ser um raio de luz para eles.
Figura 7. BCAT2 prevê resposta à imunoterapia em várias coortes de imunoterapia do mundo real. A) Imagem IHC de BCAT2 e PD-L1 entre respondedores e não respondedores na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. Barra de escala: 50 μm. B) Imagem IF multicolorida de BCAT2 e PD-L1 entre respondedores e não respondedores na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. Barra de escala: 50 μm. Célula BCAT2+(verde), célula PD-L1+(amarelo) e núcleo celular (azul). C) Imagem tomográfica da diferença na eficácia da imunoterapia entre indivíduos com altos e baixos níveis de expressão de BCAT2. A seta vermelha aponta para a área do tumor. D) Diferença geral na taxa de resposta entre grupos de BCAT2 alto e baixo na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. E) Precisão de previsão de BCAT2, PD-L1 e índice de combinação (BCAT2+PD-L1) na resposta à imunoterapia na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. F) Diferença na sobrevida livre de doença (SLD) entre grupos de alto e baixo BCAT2 na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA. G) Diferenças no nível de expressão de BCAT2 entre os grupos CR, PR, SD e PD no tipo deserto da coorte IMvigor210. *p < 0,05; ns: sem significado. H) Precisão de previsão de BCAT2, PD-L1 e índice de combinação (BCAT2+PD-L1) na resposta à imunoterapia em um tipo de deserto da coorte IMvigor210. I) Diferença na sobrevida global (SG) entre grupos de alto e baixo BCAT2 em um tipo de deserto da coorte IMvigor210. J – M) Diferenças na resposta à imunoterapia entre grupos de BCAT2 alto e baixo nas coortes GSE35640, GSE173839, GSE135222 e Gide2019.
3. Discussão
Como uma enzima chave no processo de catabolismo dos BCAAs, pesquisas anteriores focaram principalmente no papel relacionado ao metabolismo do BCAT2 em doenças como obesidade, diabetes e arritmia. Ma et al. demonstraram que a eliminação do BCAT2 no tecido adiposo pode acelerar o escurecimento do tecido adiposo e a termogênese, o que leva a uma taxa reduzida de obesidade em camundongos.[19] Através da detecção de amostras de sangue de mais de 2.000 indivíduos, Gerszten et al. retrataram um perfil metabólico relacionado ao diabetes e descobriram que BCAT2-os BCAAs transformados desempenham um papel crucial no desenvolvimento da doença.[20] Portero et al. revelaram que mutações sem sentido de BCAT2p.Q300*/p.Q300* resultam em níveis elevados de BCAAs e induzem arritmias em camundongos.[21] Recentemente, alguns estudos descobriram que o BCAT2 tem uma relação estreita com o cancro. Lei et al. revelaram que a degradação do BCAT2 mediada pela acetilação pode retardar o desenvolvimento do adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) ao regular negativamente o nível de metabolismo dos BCAAs.[22] Wang et al. consideraram que o nível de transcrição restrito de BCAT2 leva a uma diminuição do nível de glutamato intracelular, o que estimula a ferroptose das células do hepatoma.[23] No entanto, todas as pesquisas existentes enfatizaram a influência do catabolismo de BCAA mediado por BCAT no processo biológico do câncer, em vez de explorar um mecanismo totalmente novo. Neste estudo, revelamos pela primeira vez o papel imunossupressor do BCAT2 no TME. A aplicação da imunoterapia redefine o tratamento do câncer, com excelente qualidade de vida e tempo de sobrevivência prolongado. No entanto, devido à heterogeneidade do sistema ecológico imunológico tumoral, apenas uma parcela dos indivíduos obtém eficácia satisfatória. O TME é um sistema complicado, composto de células tumorais, células imunológicas, células estromais e capilares.[24] De acordo com o nível de infiltração dos CTLs, o TME pode ser classificado em tipos inflamados e não inflamados em geral.[25] Evidências crescentes indicam que o ETM inflamado desempenha um papel positivo na indução de respostas imunes antitumorais eficazes durante a terapia.[26] Assim, analisamos exaustivamente vários indicadores relacionados ao TME e descobrimos que a alta expressão de BCAT2 molda um TME não inflamado, com ciclo de imunidade ao câncer impedido, padrão de expressão repressiva do perfil de quimiocinas, moléculas de MHC e nível de infiltração insuficiente de TIICs. Além disso, o BCAT2 está negativamente relacionado ao TIS e aos genes efetores do ICB, o que implica que indivíduos com alta expressão de BCAT2 têm maior probabilidade de não responder à imunoterapia. Para validar nossa hipótese, comparamos a taxa de resposta entre os grupos de alto e baixo BCAT2 na coorte de imunoterapia Xiangya BLCA e outras coortes de imunoterapia. Surpreendentemente, houve diferenças significativas em múltiplas coortes, o que indicou que o BCAT2 também é capaz de desempenhar um papel preditor da eficácia da imunoterapia, especialmente no BLCA. Além disso, scRNA-seq foi usado para explorar o mecanismo regulador de BCAT2 em TME e indicou que a atividade das vias de sinalização relacionadas a citocinas / quimiocinas, a via de sinalização de quimiotaxia de células T e a via de sinalização de migração de células T têm correlações negativas significativas com BCAT2. Como uma rede de regulação crítica, as citocinas e quimiocinas são indispensáveis para o tráfego de várias células do sistema imunológico para o TME. O sistema de quimiocinas tem quatro superfamílias: C, CC, CXC e CX3C, com redundância considerável no emparelhamento de ligantes e receptores.[27] As citocinas podem ser divididas nas subfamílias Th1, Th2 e Th17 com base em sua função biológica.[28] Através da secreção de diferentes níveis deles, a luta entre células tumorais e células imunológicas é suficiente para reprogramar as características do TME.[29] No entanto, entre uma grande quantidade de citocinas e quimiocinas, é necessário filtrar o cluster mais valioso. Usando um painel de imunoensaio de 34-citocinas e quimiocinas, revelamos que as quimiocinas, incluindo CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10, estão fortemente correlacionadas negativamente com a expressão de BCAT2 na célula de câncer de bexiga humana e murina. É bem sabido que CXCL9 e CXCL10 são responsáveis pelo recrutamento de células T CD8+ para o TME.[30] Para verificar a função de CCL3, CCL4 e CCL5, consultamos pesquisas anteriores. Harlin et al. fez uso de matrizes de proteínas e qPCR para revelar que a regulação positiva de CCL3, CCL4 e CCL5 é capaz de promover a migração de células T CD8+ para o melanoma.[31] Noman et al. descobriram que um aumento da população de secreção de CCL5 auxilia no estabelecimento de um TME pró-inflamatório ao trafegar CTLs para o tecido do câncer colorretal.[32] Através de IHC e RNA-seq do perfil de quimiocinas em múltiplas coortes, Romero et al. demonstraram que CCL4 e CCL5 têm uma forte associação com o nível de infiltração de células T CD8+ no câncer de pâncreas.[33] Portanto, consideramos que as quimiocinas relacionadas às células T CD8+ são as principais quimiocinas reguladas pelo BCAT2 no câncer de bexiga. Embora tenhamos demonstrado as correlações negativas robustas entre BCAT2 e quimiocinas relacionadas às células T CD8+, o mecanismo regulador subjacente entre elas ainda precisa ser mais explorado. O estudo de Peterson et al. demonstraram que a ativação da via de sinalização da MAP quinase (MAPK) pode induzir a produção de CX3CL1.[34] Xu et al. revelaram que a via de sinalização JAK-STAT regulou a secreção de quimiocinas relacionadas a Th1-, causando uma diminuição do nível de infiltração de TILs.[35] Recentemente, Peng et al. descobriram que a desmetilase JMJD3 pode inibir a expressão de quimiocinas relacionadas às células CD4+T e reduzir o nível de infiltração de células T de citotoxicidade no TME, representando um papel crucial da modificação epigenética na regulação da expressão de quimiocinas.[36] Mayo et al. também revelou que um inibidor epigenético, a histona desacetilase 1, tem uma grande capacidade de suprimir a expressão de CXCL8 por meio da ativação da via de sinalização do fator nuclear-𝜅B (NF-𝜅B).[37] Além disso, como símbolos do metabolismo das células tumorais, a glicólise aeróbica e as espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando ótimo desempenho na indução da expressão de CXCL8 e CXCL14, elevando as atividades das vias de sinalização do NF-𝜅B e da proteína ativadora do fator de transcrição 1 (AP{{93 }}).[38] Curiosamente, em nosso estudo, as vias de sinalização de NF-𝜅B, STAT e MAPK foram significativamente enriquecidas entre linhas celulares BCAT2 altas e baixas (Figura 3K; Figura S16A, B, Informações de Apoio). Portanto, combinando com os estudos acima, exploraremos ainda mais a molécula-chave no mecanismo de regulação das quimiocinas relacionadas ao BCAT2 e ao CD{100}}T. A taxa de resposta objetiva limitada da monoterapia com ICB estimula o advento de uma estratégia de terapia combinada. Para converter TME não imunológico em TME imunológico, Wolchok et al. aplicou o co-tratamento de nivolumabe (terapia anti-PD-1) e ipilimumabe (terapia anti-CTLA-4) em pacientes com melanoma e encontrou um efeito curativo encorajador, atribuindo ao priming, ativação e morte síncrona e aprimorada de CTLs .[39] Mais do que combinar com outro tipo de ICB, a quimioterapia mais imunoterapia é uma opção terapêutica alternativa. Como regime de tratamento de primeira linha para carcinoma urotelial avançado, alguns estudos descobriram que a quimioterapia à base de cisplatina é capaz de moldar um TME pró-inflamatório, aumentando o nível de expressão do MHC classe I em células dendríticas e danificando MDSCs e Tregs.[40] Coincidentemente, Homma et al. revelaram que outro medicamento quimioterápico comum para câncer de bexiga, a gencitabina, pode melhorar a quantidade de infiltração de células T CD8+ e prejudicar as células imunossupressoras no TME.[41] Em nosso experimento pré-clínico com animais, o co-tratamento da perda de BCAT2 e mab anti-PD-1 apresentou uma eficácia antitumoral mais distinta em comparação com a monoterapia de mab anti-PD-1 em camundongos imunocompetentes, o que fornece um tratamento inovador estratégia para pacientes com resistência a ICB. Enquanto isso, através da análise de citometria de fluxo e IF, demonstramos que a derrubada do BCAT2 não apenas recruta mais população de CTLs para o TME, mas também aumenta a atividade de morte dos CTLs. Da mesma forma, Peng et al. descobriram que a superexpressão de LGALS2 diminui a quantidade de CTLs infiltrantes, bem como de biomarcadores citotóxicos em camundongos portadores de câncer de mama.[42] Yang et al. ilustrou que o CXCL13 é capaz de aumentar a resposta à imunoterapia em modelos de camundongos com câncer de ovário, aumentando o nível de infiltração de células T CD8+ e o nível de secreção de GZMB, IFN-𝛾 e IL-2.[43] Acompanhando uma resposta anticâncer mais forte, a terapia combinada perturba ainda mais o ciclo de feedback imunológico existente, o que provavelmente leva a efeitos colaterais graves. De acordo com o padrão de expressão de BCAT2 ao nível de siRNA, expresso especificamente em células tumorais e não em células imunitárias e células endoteliais, podemos inferir preliminarmente que a perda de BCAT2 ou o inibidor de BCAT2 têm menos probabilidade de resultar em efeitos adversos terríveis. No entanto, a dosagem ideal e o tempo de intervalo do inibidor de BCAT2 e do mab anti-PD -1 na terapia combinada ainda precisam ser explorados.
Para orientar a terapia de precisão em indivíduos, correlacionamos o BCAT2 ao subtipo molecular do BLCA e aos biomarcadores críticos de diversas terapias. Com base em previsões confiáveis em múltiplas coortes, descobrimos que imunoterapia, quimioterapia, radioterapia e terapia alvo de EFGR são adequadas para pacientes com baixa expressão de BCAT2. A terapia antiangiogênica é recomendada para pacientes com alta expressão de BCAT2. Diferente do complicado processo de detecção de subtipos moleculares, o BCAT2 é um preditor portátil para terapia de precisão. Inevitavelmente, existem algumas limitações em nossos estudos. Primeiro, o tamanho das amostras e o tempo de acompanhamento da coorte Xiangya BLCA e da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA foram limitados. Precisamos ampliar ainda mais o tamanho da amostra e continuar o acompanhamento padronizado. Em segundo lugar, como uma coorte do mundo real, a coorte de imunoterapia Xiangya BLCA continha diferentes opções cirúrgicas que provavelmente causaram um viés potencial. Ampliaremos ainda mais nossa coorte e conduziremos análises de subgrupos com base na mesma opção cirúrgica. Terceiro, o efeito cooperativo da terapia combinada in vivo precisa ser ainda mais validado utilizando a aplicação sistêmica do inibidor de BCAT2. Em resumo, como um papel imunossupressor no TME do BLCA, o BCAT2 é um alvo emergente na terapia combinada de ICB e um biomarcador preciso da terapia de precisão.
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4. Seção Experimental
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 e o valor p ajustado < 0.05. As análises da Gene Ontology (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) foram conduzidas em DEGs identificados pelo pacote ClusterProfiler R.[51] O pacote Seurat R com algoritmo Findmarker foi aplicado para calcular o nível de expressão de BCAT2 em células epiteliais em scRNA-seq. Com base na classificação variada da expressão gênica por valor de mudança de dobra (FC), a análise de enriquecimento do conjunto de genes (GSEA) foi implementada para julgar correlações positivas e negativas. Identificação de DEGs relacionados ao sistema imunológico: O pacote ESTIMATE R foi empregado para calcular pontuações imunológicas e estromais na coorte TCGA-BLCA. De acordo com o valor mediano de duas pontuações e o nível de expressão de BCAT2, o pacote Limma R foi aplicado para identificar DEGs positivos/negativos relacionados ao sistema imunológico e relacionados ao estroma. O pacote R do diagrama de Venn foi usado para fazer a interseção de vários grupos e garantir os DEGs comuns. Classificação de indivíduos usando subtipos moleculares de BLCA: Sete subtipos moleculares de BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT e Consensus) foram amplamente aplicados na clínica para avaliar características de TME e eficácia de diversas terapias.[52] Considerando a complexa interação de vários subtipos, nós os dividimos coletivamente em duas categorias principais: subtipos basais e luminais.[16] Pacotes R de subtipagem Consensus MIBC e BLCA foram empregados para classificar indivíduos em subtipos específicos. Após a normalização, a área sob a curva ROC (AUC) foi utilizada para avaliar a confiabilidade do BCAT2 na predição da classificação. Avaliação terapêutica de precisão dos pacientes: conforme ilustrado em nosso estudo anterior,[53] uma série de assinaturas genéticas críticas, que podem prever a eficácia da quimioterapia, radioterapia, terapia direcionada e imunoterapia, foram coletadas de diferentes estudos e bancos de dados.[16, 54] O algoritmo ssGSEA foi usado para calcular as pontuações de enriquecimento de assinaturas genéticas.[55] Linhas Celulares: Células de câncer de bexiga humana (T24) e células de câncer de bexiga murina (MB49) foram adquiridas da Procell Life Science & Technology (Wuhan, China) e Meisen CTCC (Jinhua, China), respectivamente. Eles foram mantidos em meio DMEM (BasalMedia, China) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (BI, Israel), 1% de penicilina e estreptomicina (NCM Biotech, China) e cultivados em uma incubadora a 37 temperatura de graus contendo 5% de CO2. Construção e RNA-seq de células de transfecção estáveis: vetor lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromicina (GV341) foi projetado e construído pela GeneChem (Xangai, China) para superexpressão estável de BCAT2-(BCAT2 OE) linhagem celular e seu controle negativo (oe-vetor). Além disso, BCAT2- RNA em gancho curto (shRNA) foi clonado no vetor lentiviral GV112- pela GeneChem (Xangai, China) para uma linha celular estável BCAT2-knock down (BCAT2 KD) . As sequências alvo de shRNA foram listadas na Tabela S3 (Informações de Apoio). Em seguida, os lentivírus BCAT2 recombinantes foram transfectados em células objetivas de acordo com as instruções do fabricante. 2 ug mL-1 de puromicina (Amersco, EUA) foram empregados para filtrar células de transfecção estáveis por três dias. Western blot e PCR quantitativo de transcrição reversa (qRT-PCR) foram aplicados para validar a eficácia da transfecção. Eventualmente, uma célula de transfecção estável com a melhor eficácia foi escolhida para RNA-seq e outros experimentos. Três amostras duplicadas de cada linhagem celular foram enviadas para a plataforma BGI RNA-seq (Shenzhen, China). Os critérios para seleção de DEGs e análise das vias de enriquecimento foram os mesmos descritos em 2.3 (análises das vias de enriquecimento). Imunoensaios múltiplos ProcartaPlex para detecção do nível de secreção de quimiocinas e citocinas de linhas celulares de câncer: painel de imunoensaio ProcartaPlex humano (Cat: EPX340-12167-901) e painel de imunoensaio ProcartaPlex de camundongo (Cat: EPX{{50}}) foram adquiridos da ThermoFisher Scientific (Massachusetts, EUA) para detectar níveis de expressão proteica de mais de 3 0 quimiocinas e citocinas cruciais em células cancerígenas de transfecção estável. Em resumo, os sobrenadantes da cultura celular foram coletados de uma placa de 24-poços e centrifugados para remover células e detritos celulares. Em seguida, os sobrenadantes clarificadores foram incubados com esferas no painel seguindo as instruções do fabricante. A plataforma de detecção Luminex (ThermoFisher Scientific, EUA) foi utilizada para realizar análises quantitativas em cada amostra. Indicadores não detectados foram excluídos da análise. qRT-PCR: O RNA total foi isolado de células com Cell Total RNA Isolation Kit e Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene, China) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc foi sintetizado utilizando o sistema UeIris II RTPCR para síntese de cDNA de primeira cadeia (US Everbright, China). O qRTPCR foi realizado usando SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, China) no CFX Connect System (Bio-Rad, EUA). GAPDH foi utilizado como controle padrão interno. Os primers foram projetados e sintetizados pela Sangon Biotech (Xangai, China) e sequências detalhadas de primers foram listadas na Tabela S4 (Informações de Apoio). ELISA: As concentrações de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) e CXCL10 (IP10) em sobrenadantes de cultura de células de câncer de bexiga humano foram determinadas por kits de ELISA humano seguindo o protocolo do fabricante (Proteintech, EUA). Um leitor de microplacas biotecnológico (ThermoFisher Scientific, EUA) foi empregado para medir os valores de densidade óptica (DO). Tendo em vista a enorme diversidade de níveis de secreção entre diferentes citocinas e quimiocinas, realizamos a padronização dos dados (transformação log 2) antes da análise. Western Blot: tampão RIPA (NCM biotech, China) adicionado com um coquetel inibidor de protease a 1% (NCM biotech, China) foi usado para lisar células. O kit BCA Protein Assay (NCM biotech, China) foi empregado para determinar as concentrações de proteína. Após serem transferidas para membranas de PVDF, as proteínas celulares foram incubadas sucessivamente com anticorpos primários e anticorpos secundários específicos conjugados com HRP. Os sinais foram capturados pelo sistema de imagem XRS (Bio-Rad, EUA). Os anticorpos primários incluem um anticorpo anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EUA) e um anticorpo anti-GAPDH (Cat: ab8245, Abcam, EUA). Os anticorpos secundários incluem IgG de cabra anti-coelho HRP (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, EUA) e IgG de cabra anti-murganho HRP (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, EUA). Ensaio de morte de células cancerígenas mediadas por linfócitos T e ensaio de cocultura: Amostras de sangue foram coletadas de 10 doadores saudáveis em nosso hospital. De acordo com as instruções do fabricante, a centrifugação em gradiente foi empregada para extrair células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) pela Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, EUA). Além disso, utilizou-se tampão de lise de glóbulos vermelhos (Solarbio, China) para eliminar glóbulos vermelhos misturados com PBMCs. Para ativar as células T, as PBMCs foram cultivadas em meio DMEM (Gibco, EUA), complementando IL Humana Recombinante- 2 (10 ng mL-1, Cat: 202-1L-050, R&D , EUA) e ativador de células T ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 (25 μL mL−1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, EUA) por 1 semana. Na proporção de 1:5, células de câncer de bexiga humano (BCAT2-OE, BCAT2-KD e seus controles negativos) foram cocultivadas com células T ativadas em meio DMEM com anticorpo anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, EUA) e IL-2 (10 ng mL−1) de um doador em 12- placa de poços por 72 h. Em seguida, as células T foram coletadas para análise por citometria de fluxo. A estratégia detalhada da análise de fluxo é mostrada na Figura S28 (Informações de Apoio). As restantes células cancerígenas foram coradas com violeta de cristal e mediram o valor de DO a 570 nm por um leitor de microplacas. Os anticorpos para análise de citometria de fluxo incluem Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, EUA), APC/Cy7 CD45 anti-humano (Cat: 368516, Biolegend, EUA), Anticorpo CD3 anti-humano Pacific Blue (Cat: 300329, Biolegend, EUA), Anticorpo CD4 anti-humano PerCP/Cy5.5 (Cat: 317427, Biolegend, EUA), Anticorpo CD8a anti-humano FITC (Cat: 301006, Biolegend, EUA), PE/Dazzle 594 anti-TNF-humano 𝛼 Anticorpo (Cat: 502946, Biolegend, EUA) e Brilliant Violet 711 anti-IFN- 𝛾 Anticorpo (Cat: 502540, Biolegend, EUA). Ensaio de quimiotaxia: O ensaio de quimiotaxia foi implementado em uma placa transwell de 24-poços com diâmetro central de 3 μm (Corning, EUA). Um kit de isolamento de células T CD8+humanas (Cat: 480012, Biolegend, EUA) foi usado para extrair células T CD8+de PBMC. 1 × 105 células isoladas em volume de 200 μL foram adicionadas à câmara superior e 600 μL de sobrenadantes de diferentes linhas celulares de transfecção estáveis foram adicionados à câmara inferior. Após incubação durante 6 horas a 37 graus, as células migraram para a câmara inferior e foram colhidas e contadas por citometria de fluxo. Ensaios de Proliferação, Migração e Invasão Celular: Um ensaio de formação de colónias em placas foi utilizado para avaliar a capacidade de proliferação celular. BCAT2-OE, BCAT2-KD e células de câncer de bexiga humano de controle negativo foram cultivadas em 6-placas de poços por poço. Após incubação numa atmosfera humidificada a 37 graus durante 2 semanas, as colónias foram fixadas e coradas com paraformaldeído e cristal violeta, respectivamente. Câmaras Transwell com inserções de membrana de policarbonato com poros de 8,0 μm (Corning, EUA) foram empregadas para avaliar a capacidade de migração e invasão celular in vitro. 1 x 105 células transfectadas estáveis foram suspensas em meio isento de soro e semeadas na câmara superior com ou sem Matrigel (Corning, EUA), para ensaio de invasão e migração separadamente. Após incubação durante 24 h (ensaio de migração) e 48 h (ensaio de invasão), as células aderidas à superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas. As células que permaneceram na câmara superior foram removidas por swabs. Cinco campos aleatórios foram selecionados sob um microscópio para calcular o número de células. Imunofluorescência (IF) e Imunohistoquímica (IHC): O IF multicolorido em TMAs da coorte Xiangya BLCA e da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA foi implementado por kit de coloração imuno-histoquímica fluorescente múltipla (Absin, China). Em resumo, após desparafinação, reidratação e renovação do antígeno, o TMA foi incubado com anticorpos primários e anticorpos secundários que estimulam a ligação de diferentes luciferinas por amplificação do sinal de tiramida (TSA). Após a eliminação dos anticorpos não ligados com tampão citrato, o processo de incubação foi repetido duas vezes. O DAPI foi empregado para contrastar os núcleos celulares e as imagens foram digitalizadas pela plataforma Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Hungria). Os anticorpos primários no TMA da coorte Xiangya BLCA incluem anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EUA), anti-Citoqueratina 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, EUA), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, EUA). ) e DAPI (Invitrogen, EUA). Anticorpos secundários e fluorocromo no TMA da coorte Xiangya BLCA incluem IgG anti-coelho/rato de cabra HRP, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Os anticorpos primários no TMA da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA incluem anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EUA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, EUA) e DAPI (Invitrogen, EUA). Anticorpos secundários e fluorocromo no TMA da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA incluem HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus e Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). O IF em tecidos tumorais murinos foi incubado com anticorpo primário - anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, EUA) - e anticorpo secundário - conjugado de corante Alexa Fluor 488 anti-camundongo (Invitrogen, EUA) sequencialmente. DAPI foi aplicado ao núcleo celular visualizado. Cinco campos aleatórios foram selecionados sob um microscópio para calcular o número de células com coloração positiva. A IHC em TMAs da coorte Xiangya BLCA e da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA foi conduzida pelo SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, China). Após a recuperação e bloqueio do antígeno, os anticorpos primários e os anticorpos secundários foram incubados com tecidos tumorais, por sua vez. Em seguida, a diaminobenzidina (DAB) foi aplicada para colorir os antígenos alvo. O sinal marrom foi considerado como coloração positiva. Pontuação de intensidade de coloração (ausente=0, fraca=1, moderada=2 e forte=3) multiplicando a pontuação de porcentagem positiva (sem coloração=0, células com coloração menos de 25%=1, 25%–50% de células com coloração=2, 50%–75% de células com coloração=3 e células com coloração superior a 75%=4) foi pontuação IHC final das amostras. Os escores de BCAT2/CD8/PD-L1 menores que seis pontos foram classificados como de baixa expressão, os escores deles maiores ou iguais a seis pontos foram classificados como de alta expressão. Para avaliar o status de um indivíduo na MMR, todas as amostras da coorte de imunoterapia Xiangya BLCA foram avaliadas com base nos resultados de coloração de quatro genes marcadores MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Conforme descrito em estudos anteriores,[56] quando todos os quatro genes marcadores apresentavam coloração positiva, o indivíduo era marcado como MMR. Quando qualquer um dos quatro genes marcadores apresentou coloração negativa, o indivíduo foi marcado como dMMR. Dois patologistas independentes foram convidados para conduzir a avaliação. Os anticorpos incluem: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EUA), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, EUA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, EUA), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, China), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, China), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, China), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, China) e HRP Goat Anti -IgG de coelho/camundongo (ZSGB-BIO, China). Análises Panorâmicas TissueFAXS de Interação Espacial em TME: Para avaliar a interação espacial de células malignas BCAT2+ e células T efetoras, a plataforma panorâmica TissueFAXS (Tissue Gnostics, Áustria) foi utilizada para escanear e analisar semiautomaticamente células objetivas coradas por IF multicolorido em TMA da coorte Xiangya BLCA. O TMA foi constituído por biópsias centrais de 1,5 mm de amostras de tecidos tumorais embebidas em parafina. Em detalhes, células BCAT2+, células malignas e células T CD8+ foram coradas por anticorpos primários específicos e anticorpos secundários. DAPI (Invitrogen, EUA) foi usado para corar o núcleo celular. Etapas detalhadas foram descritas no estudo de Makarevic et al.[57] Em resumo, de acordo com as intensidades de fluorescência de diferentes indicadores e propriedades físicas das células, as células positivas foram marcadas e quantificadas. Mais importante, as distribuições espaciais de células T CD8+ em torno das células BCAT2+CK19+ foram representadas por gráficos de dispersão com base na distância espacial (0–25, 25–50, 50– 100 e 100–150 μm). Dois patologistas experientes foram convidados para verificar o resultado da decisão da plataforma panorâmica TissueFAXS. Experimentos com Animais: Camundongos fêmeas C57BL/6 (6–7 semanas) foram obtidos do Departamento de Animais de Laboratório da Central South University. Todas as operações em ratos foram verificadas e aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Xiangya, Universidade Central do Sul (número do item: 2021101175). Acima de tudo, para investigar o papel do BCAT2 no crescimento tumoral in vivo, células BCAT2 KD MB49 (5 × 105) e suas células controle em volume médio de 100 μL foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos. Além disso, após a construção bem-sucedida de um modelo de tumor subcutâneo (volume de tumor de até 100 mm3), 100 ug de InVivomAb anti-mouse PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, EUA) e controle de isotipo IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, EUA) EUA) foram injetados intraperitonealmente em cada camundongo, para avaliar o efeito sinérgico da perda de BCAT2 e da terapia anti-PD-1. A terapia anti-PD-1 foi implementada em ratos a cada 3 dias e durou até cinco ciclos. Além disso, para julgar se o efeito cooperativo do co-tratamento dependia de células T CD8+. Acompanhando a terapia combinada, 100 ug InVivoPlus anti-mouse CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, EUA) e controle de isotipo IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, EUA) foram empregados para esgotar células T CD8+ em camundongos. Os pesos corporais dos ratos foram registrados a cada três dias. Na data agendada, os tumores foram colhidos, medidos e preparados para análise de citometria de fluxo, coloração IF e qRT-PCR. Para explorar a interação entre o nível de expressão de BCAT2 em células T CD8+ e a atividade de células T CD8+, baços de camundongos fêmeas C57BL/6 (6–7 semanas) sem tumor foram dissociado e preparado para suspensão unicelular para análise posterior. Análise de Citometria de Fluxo: Tumores murinos foram moídos e digeridos em suspensão unicelular por Colagenase IV (Cat: C5138, Sigma, EUA), hialuronidase (Cat: H3506, Sigma, EUA) e DNase I (Cat: DN25, Sigma, EUA). ). Filtros de células de 70 μm (BIOFIL, China) foram usados para filtrar impurezas e um contador de células (Countstar, China) foi empregado para ganhar (3–5) × 106 células em cada amostra. Depois de identificar células vivas usando Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, EUA) e bloquear o receptor Fc com anticorpo anti-mouse CD16/32 (Cat: 156603, Biolegend, EUA), os antígenos da membrana celular foram corados por APC-Cy7 CD45 anti-camundongo (Cat: 103116, Biolegend, EUA), CD3 anti-camundongo BV421 (Cat: 100341, Biolegend, EUA), CD8a anti-camundongo BV605 (Cat: 100744, Biolegend, EUA) e PerCPCy5.5 anti-camundongo CD4 (Gato: 100540, Biolegend, EUA). Em seguida, o conjunto de tampão de coloração Foxp3 / fator de transcrição da biociência (Cat: 2400632, Invitrogen, EUA) foi utilizado para fixar e permeabilizar a membrana celular e nuclear. Antígenos relacionados ao efeito citotóxico foram corados por PE anti-humano/camundongo Granzyme B (Cat: 372208, Biolegend, EUA), PE-Cy7 anti-camundongo TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, EUA), PE-Dazzle 594 anti- IFN-𝛾 de camundongo (Cat: 505846, Biolegend, EUA), Perforina anti-camundongo APC (Cat: 154304, Biolegend, EUA). A estratégia de gating da análise de citometria de fluxo é mostrada na Figura S29 (Informações de Apoio). BCAT2 anti-humano/camundongo (Cat: A7426, Abclonal, China) foi incubado com kit de rotulagem de anticorpo flexível 488 (Cat: KFA001, Proteintech, EUA) para sintetizar anticorpo fluorescente BCAT2 personalizado para análise de citometria de fluxo. Em seguida, o anticorpo BCAT2 e os anticorpos relacionados às células T foram misturados e adicionados em uma suspensão unicelular de baço murino para explorar a interação entre o nível de expressão de BCAT2 em células T CD8+ e a atividade de CD{{357} } Célula T. A estratégia de gating da análise de citometria de fluxo é mostrada na Figura S30 (Informações de Apoio). Amostras coradas foram detectadas na citometria Cytek DxpAthena Flow (Cytek Biosciences, EUA) e os dados foram analisados pelo software versão Flowjo (BD Biosciences, EUA). Análise Estatística: Os dados foram apresentados como média ± DP. O teste t com ou sem correção de Welch foi utilizado para comparar variáveis contínuas entre dois grupos. A análise ANOVA unidirecional com ou sem testes de Brown-Forsythe e Welch foi usada para comparar variáveis contínuas entre múltiplos grupos. O teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher foi aplicado para comparar variáveis dicotômicas. O teste dos coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman foi empregado para estimar a intensidade de correlação entre diferentes variáveis. A curva de sobrevida de Kaplan-Meier foi empregada para mostrar análises prognósticas de variáveis dicotômicas, e o teste log-rank foi utilizado para julgar diferenças estatísticas. P bilateral <0,05 foi definido como o limiar de significância. O software R (versão 4.0) e o GraphPad Prism8 foram aplicados para processar os dados do estudo.
Referência
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Câncer J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Tratamento do Câncer. Rev. 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3º, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N .Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Ir. J. Câncer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Câncer Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Câncer 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Câncer 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Ciência 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Biol celular. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.
[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Câncer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.
