Com base na farmacologia de rede e em experimentos com animais para explorar o efeito do glicosídeo feniletanóide de Cistanche Tubulosa no efeito da nefropatia diabética

Resumo: Objetivo Explorar o efeito deCistancheglicosídeos feniletanol(CPhG) emdoença renal diabética(DKD) baseado em farmacologia de rede e experimentos com animais. Métodos O método UHPLC-QE-MS foi utilizado para analisar ocomponentes químicos de CPhGs. Os bancos de dados TCMSP e Swiss Target Prediction foram usados ​​para rastrear os componentes principais. Os bancos de dados OMIM e GeneCards foram usados ​​para obter alvos relacionados ao DKD. Após a obtenção de alvos comuns, o site STRING foi utilizado para construir uma rede de interação proteica. O banco de dados DAVID foi usado para análise da via GO, KEGG e o software Cytoscape foi usado para construir a rede "CPhGs core component-target-pathway". Dez ratos foram selecionados aleatoriamente como o grupo normal, e os ratos restantes foram alimentados com ração rica em açúcar e gordura e receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ para estabelecer um modelo DKD. Eles foram divididos em grupo modelo, grupo dapagliflozina (1 mg/kg) e CPhGs de dose alta e média e baixa (500, 25{{40}}, 125 mg/kg), 10 animal em cada grupo, intervenção medicamentosa por 6 semanas, condições gerais foram observadas, peso corporal foi determinado e glicemia foi testada toda semana; A urina de 24 horas foi coletada após a última dose. Detectar proteína total na urina em 24-hora (24-UTP); coletar sangue da aorta abdominal e sacrificá-lo, separar o soro e detectar nitrogênio ureico (BUN), ácido úrico (UA), colesterol total (TC), triglicerídeos (TG) e hipertensão. Níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL), coloração HE e coloração Masson foram usados ​​para observar alterações patológicas no tecido renal, ELISA foi usado para detectar IL-1 sérico, IL{{17} } e níveis de TNF-, e Western blot foi usado para detectar tecido renal. Expressão da proteína JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. Resultados Um total de 699 componentes foram detectados pela tecnologia UHPLC-QE-MS. Após a triagem, foram obtidos 16 componentes principais dos CPhGs e 323 alvos relacionados. CPhGs e DKD partilharam 99 alvos. Os principais alvos foram STAT3, SRC, EGFR, etc. A análise da via KEGG rastreou 151 vias de sinalização, mostrando que a via de sinalização IL-17, a via de sinalização PI3K/Akt, a via de sinalização TNF, etc. o tratamento de DKD por CPhGs. Os CPhGs podem aumentar o peso corporal de ratos DKD (P<0,01), reduzir o consumo de água (P<0,01), regular o metabolismo da glicose e dos lipídios, reduzir os níveis de 24-UTP e BUN (P<0,01) e melhorar o tecido renal . O dano patológico reduziu a expressão proteica de p-JAK2/JAK2 e p-STAT3/STAT3 no tecido renal (P<0,01) e aumentou a expressão proteica de SOCS3 (P<0,01). Conclusão Os CPhGs intervêm na DKD através de múltiplos componentes, múltiplos alvos e múltiplas vias, possivelmente inibindo JAK2/

Via de sinalização STAT3.

Palavras-chave: Cistanche feniletanol glicosídeo; nefropatia diabética; UHPLC-QE-MS; farmacologia de rede; experimento animal; Via de sinalização JAK2 /STAT3

QUANTO TEMPO DEMORA PARA O CISTANCHE FUNCIONAR PARA PACIENTES RENAIS?

Doença renal diabética (DKD), como uma das complicações microvasculares mais importantes do diabetes, não é apenas o principal fator que leva àdoença renal crônicamas também a principal causa de doença renal terminal (DRT) em todo o mundo. Motivo [1-2]. O tratamento clínico da DKD envolve principalmente o controle do açúcar no sangue, da pressão arterial e dos lipídios no sangue e, em segundo lugar, a proteção da função renal, evitando o uso de drogas nefrotóxicas e melhorando o estilo de vida [3-4]. No entanto, devido à complexa patogénese da DRD e à falta de alvos de intervenção específicos, as opções de tratamento atuais têm limitações e não são eficazes. A incidência de DKD em estágio terminal ainda está aumentando. Portanto, é de grande importância encontrar medicamentos naturais eficazes.

Cistanche Deserticola Y． C． Mãe ouCistanche C.Os caules carnudos e secos deCistanche tubulosa (Schenk) Wightcom folhas escamosas [5] foram registrados pela primeira vez na "Shen Nong's Materia Medica" e foram listados como de primeira qualidade. Eles são conhecidos como "ginseng do deserto" [6]. Eles são doces, salgados e quentes. , retorna aos meridianos do rim e do intestino grosso e tem os efeitos de nutrir o yang do rim, reabastecer a essência e o sangue, umedecer os intestinos e laxar. Pesquisas mostram que os glicosídeos feniletanóides (CPhGs) são um de seus principais ingredientes ativos e são responsáveis ​​pelo seu desenvolvimento.

A base material para exercer efeitos farmacológicos; O extrato de Cistanche tem efeitos antidiabéticos [7-8], anti-câncer de fígado [9], proteção renal [10-11], neuroprotetores [12-13] e outros farmacológicos, mas atualmente, CPhGs não são eficazes no tratamento da DKD. Seus efeitos e mecanismos não são claros.

Este estudo utilizou farmacologia de rede e métodos de docking molecular [14], tomando CPhGs como objeto de pesquisa, prevendo e analisando seus principais ingredientes ativos e potenciais alvos para o tratamento de DKD, e então estabelecendo uma combinação de alta induzida por estreptozocina (STZ). O modelo de rato DKD alimentado com ração lipídica foi utilizado como objeto de pesquisa in vivo, para fornecer referência para a expansão clínica e aplicação de tratamentos relacionados e pesquisas adicionais sobre o mecanismo de ação.

1 material

1.1 Animais

70-ratos SD machos com semanas de idade e nível de FPS, peso corporal (240±20) g, foram adquiridos do Centro de Experimentação Animal da Universidade Médica de Xinjiang [Licença de Uso de Animais Experimentais No. SYXK (novo) {{4} }], em Os animais foram criados adaptativamente por 1 semana a uma temperatura de (22 ± 2) graus, uma umidade relativa de 50% a 70% e um ciclo alternado de luz e escuridão de 12 h/12 ​​h. O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Centro Médico Experimental de Animais da Universidade Médica de Xinjiang (número de ética IACUC-20220127-19).

1.2 Reagentes e medicamentos

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) foram fornecidos pela Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. A dapagliflozina (número de lote NB2248) foi adquirida da AstraZeneca, Reino Unido. Alimentos com alto teor de açúcar e gordura (Cat. No. Boaigang-B1135DM) e STZ (Lote No. 2021110307) foram adquiridos da Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; microalbumina na urina (lote n.º 20220611), azoto ureico (lote n.º 20220626), ácido úrico (lote n.º 20220613), colesterol total (número de lote 20220615), triglicéridos (número de lote 20220616), lipoproteína de alta densidade (número de lote 20220614). ) e lipoproteína de baixa densidade (número de lote 20220615) foram adquiridas do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleucina-6 (IL-6, número de lote JL20896), interleucina-1 (IL-1, número de lote JL20884) e fator de necrose tumoral- (TNF-, número de lote 13202 ) foram adquiridos da Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Anticorpo policlonal de coelho JAK2 (número de lote 22v9316), anticorpo policlonal de coelho p-JAK2 (número de lote 78g9360), anticorpo policlonal de coelho STAT3 (número de lote 15x8824), anticorpo policlonal de coelho p-STAT3 (número de lote 74m1478), anticorpo policlonal de coelho SOCS3 (lote número 31d4841) foram todos adquiridos da Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; O anticorpo policlonal IgG de cabra anti-coelho marcado com HRP (número de lote 20000758) foi adquirido à Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; Anticorpo monoclonal de coelho -actina (número de lote AC230205001), tampão de lise RIPA (número de lote 20220416), kits de determinação de concentração de proteína BCA (número de lote 20230401) foram adquiridos da Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 instrumentos

Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência Vanquish, espectrômetro de massa de alta resolução Q Exactive Focus, centrífuga Heraeus Fresco17, leitor automático de microplacas FC (Thermo Fisher Scientific, EUA); Moedor JXFSTPRP-24 (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Medidor de água pura UV Mingche D24 (Alemanha Merck Millipore Company); Coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); medidor de glicemia Accu Chek Performa (Swiss Roche Company); Criostato CM1850UV, microscópio de fluorescência vertical DM300 (Leica Company, Alemanha); Medidor de vórtice GL-88B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); balança analítica eletrônica (Bio-Rad Company, EUA).

2 métodos

2. 1 análise UHPLC-QE-MS

2.1.1 Preparação da solução de teste

Pesar 100 mg de CPhGs, adicionar 500 μL de metanol a 80%, vórtice por 30 s, ultrassonicar em banho de água gelada por 1 h, deixar repousar a -40 graus por 1 h, centrifugar a 4 graus , 12 000 r/min por 15 min, aspirar o sobrenadante, 0. Filtrar através de uma membrana microporosa de 22μm e armazenar em geladeira de -80 graus.

2.1.2 Condições cromatográficas

Coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); acetonitrila de fase móvel (A) -1% de ácido fórmico (B), eluição gradiente (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 a 12 min, 75% a 98% A; 12 a 14 min, 98% de A; 14 a 14,1 min, 98% a 15% de A; Taxa de fluxo volumétrico 0 . 5 mL/min; temperatura da coluna 35 graus; volume de injeção 5 μL.

2.1.3 Condições de espectrometria de massa

modo de varredura completa ddMS2 de varredura completa; vazão volumétrica de gás de bainha 45 arb; vazão volumétrica de gás auxiliar 15 arb; temperatura capilar 400 graus; energia de colisão no modo NCE ciclo de 15% ~ 30% ~ 45%; tensão de pulverização ± 4,0 kV.

2.2 Pesquisa Farmacológica em Rede

2. 2. 1 CPhGs

Triagem de componentes-alvo: Classifique os componentes químicos analisados ​​por UHPLC-QE-MS de acordo com o conteúdo relativo e exclua aqueles cujas estruturas químicas ainda não foram determinadas. Insira o número de série InChIKey dos ingredientes selecionados no banco de dados TCMSP para obter os parâmetros farmacocinéticos de cada ingrediente. Com base nas condições de biodisponibilidade oral (OB) > 30% e semelhança ao medicamento (DL) > 0,18, serão selecionados os candidatos que atenderem aos requisitos. Insira o número SMILES de cada componente no banco de dados Swiss Target Prediction para prever o alvo e obter o alvo do componente químico CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Triagem de alvos de doenças Use "nefropatia diabética" como termo de pesquisa para procurar alvos de doenças nos bancos de dados OMIM, GeneCards e NCBI.

2. 2. 3 Construção da rede componente-alvo-doença

Os alvos cruzados dos componentes e doenças dos CPhGs foram obtidos através do mapeamento do software R, e o software Cytoscape 3.7.2 foi usado para construir um sistema de rede componente-alvo, no qual o plug-in de análise detectou alvos centrais.

2. 2. 4 Construção de rede de interação proteína-proteína (PPI)

Importe as proteínas alvo de interseção de componentes e doenças para o banco de dados STRING, construa uma rede de interação proteína-proteína (PPI), exclua proteínas sem nós conectados na rede e defina o nível de confiança da pontuação de interação de proteína mais baixa como {{1} }.700. Construa uma rede PPI, baixe seus resultados no formato TSV, importe-os para o software Cytoscape 3.7.2 e use o plug-in de análise para rastrear ainda mais os alvos principais.

2. 2. 5 GO, análise KEGG

Use a seção Anotação Funcional no banco de dados DAVID para realizar análises de enriquecimento nos alvos de interseção de doenças componentes. Primeiro defina os parâmetros de análise, insira o alvo de interseção na caixa Lista de Genes, selecione símbolo oficial do gene como o identificador de alvo, selecione Lista de Genes como o tipo de dados (Tipo de Lista) e selecione "Homo Sapiens (Espécie)" como o fonte alvo (espécie). Race)", inicie a análise após confirmar os parâmetros de análise, obtenha os resultados da análise GO e KEGG e, em seguida, use a plataforma de desenho online ImageGP para desenhar o diagrama de bolhas dos resultados da análise KEGG e GO. O software Cytoscape 3.7.2 constrói o componente imagem de rede -target-pathway.

2. 2. 6 Ancoragem molecular

Primeiro baixe o diagrama de estrutura 3D do ingrediente ativo no formato SDF do banco de dados PubChem, depois baixe o diagrama de estrutura 3D do alvo de interseção no formato PDB do US Global Protein Database (PDB) e, finalmente, carregue-o no CB-Dock site para docking molecular. Selecione as conformações de encaixe dominantes e visualize-as com Pymol.

2.3 Experimentos com animais

2.3.1 Modelagem, agrupamento e administração de medicamentos

10 ratos foram selecionados aleatoriamente como o grupo normal e alimentados com ração comum, e os ratos restantes foram alimentados com ração com alto teor de açúcar e gordura. Após 6 semanas, eles receberam uma injeção intraperitoneal única de 30 mg/kg de STZ (0,1 mmol/L de STZ dissolvido em tampão citrato de sódio pH 4,5) e 72 horas depois, o sangue foi retirado da veia da cauda. para detectar glicemia de jejum (FBG). Se FBG for maior ou igual a 16,7mmol/L, o modelo de diabetes foi estabelecido com sucesso [15]; continuar Eles foram alimentados com ração com alto teor de açúcar e gordura por 2 semanas. A modelagem DKD foi determinada como bem-sucedida com base na positividade da glicose na urina e na proteína total na urina em 24-hora (24-UTP) maior ou igual a 20 mg. Dentre eles, 3 faleceram durante o processo de modelagem e 7 não tiveram sucesso. , um total de 50 foram bem sucedidos. Os ratos que foram modelados com sucesso foram divididos aleatoriamente nos grupos modelo, grupo dapagliflozina (1 mg/kg) e grupos de dose alta, média e baixa de CPhGs (500, 250, 125 mg/kg). Cada grupo de administração foi administrado intragastricamente. Os ratos do grupo normal e do grupo modelo receberam medicamentos correspondentes, e os ratos do grupo normal e do grupo modelo receberam a mesma quantidade de solução salina normal por gavagem, uma vez por dia durante um total de 6 semanas. Durante o período de administração, os ratos de cada grupo, exceto o grupo normal, continuaram a receber ração rica em gordura.

2.3.2 Detecção de Indicadores Bioquímicos

Após 6 semanas de intervenção CPhG, 24-hora de urina foi coletada dos ratos e 24-hora de proteína total na urina (24-UTP) foi medida; sangue foi coletado da veia da cauda em jejum para detectar níveis de FBG; o sangue foi coletado da aorta abdominal, 4º grau, 1.500 r/min. Centrifugar durante 10 minutos para separar o soro e detectar azoto ureico sérico.

BUN), ácido úrico (UA), colesterol total (CT), triglicerídeos (TG), níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (lipoproteína de baixa densidade LDL).

2.3.3 Observação da morfologia patológica do tecido renal

Os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico e sacrificados. Os rins foram descascados, pesados, fixados com paraformaldeído 4%, desidratados, transparentes, mergulhados em cera, embebidos e seccionados para coloração com hematoxilina-eosina (HE).

Após a coloração de Masson, a morfologia do tecido foi observada ao microscópio, e o software Image-Pro Plus 6.0 foi utilizado para analisar a densidade óptica integrada e quantificar a área relativa da fibra de colágeno.

2. 3. 4 ELISA

O método foi utilizado para detectar os níveis de fatores inflamatórios séricos em ratos. Os níveis de IL-6, IL-1 e TNF- foram detectados de acordo com as instruções do kit.

2. 3. 5 Método Western Blot para detectar expressão de proteínas relacionadas

Foi retirado tecido renal de rato, adicionado lisado RIPA para extrair a proteína total e a concentração foi determinada pelo método BCA.

Após eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, transferência para membrana de PVDF e após bloqueio, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), Anticorpos SOCS3 (1:2000), -actina (1:2000), incubar a 4 graus durante a noite, adicionar anticorpo secundário IgG marcado com HRP (1:5000) e incubar em temperatura ambiente por 1 h, desenvolvido com kit de eletroluminescência, exposto por imager de gel de proteína, usando o software Image J

Análise quantitativa de peças. Usando -actina como referência interna, a razão entre o valor de cinza da banda alvo e a banda de referência interna é a expressão relativa da proteína.

2.4 Análise estatística

Os dados foram processados ​​pelo software SPSS 25.0 e os dados foram expressos como (x±s). Análise de variância unidirecional foi utilizada para comparação entre grupos. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.