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Autofluorescência como um biomarcador não invasivo de senescência e produtos finais de glicação avançada em Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISCUSSÃO

Anteriormente, a autofluorescência era usada para monitorar a lipofuscina, o pigmento da idade, como um biomarcador de senescência4,13. Embora tenhamos observado vermelhoFluorescência indicativa de lipofuscina como visto em estudos anteriores9, azulFlA fluorescência foi detectada em um estágio anterior da vida quando os vermes foram examinados usando um M165 FCFlestereomicroscópio de uorescência (Leica Microsystems, Tóquio, Japão) (dados não mostrados). O objetivo do presente estudo foi examinar se a autofluorescência azul poderia servir como um marcador mais sensível para rastrear a senescência de vermes individuais.

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OFla fluorescência medida em vermes individuais aumentou com a idade; quanto menos vermesFluoresceu, maior sua expectativa de vida. Assim, azulFlA fluorescência pode fornecer um biomarcador alternativo para rastrear a senescência. No entanto, Pincus et al. relatou que os vermes que posteriormente morreram (dentro de 24 h)Fluoresceu devido à biossíntese de quinurenina; esses pesquisadores nomearam essa luz azul"morteflfluorescência". Alegadamente, a morteFluorescência reFlafeta a emissão por uma forma glicosilada do ácido antranílico produzida pela via da quinurenina; o automóvelFlmaterial fluorescente é detectado em grânulos intestinais semelhantes a lisossomos31. Essa luz azul pode ser o mesmo marcador de morte que Coburn et al. observado emC. eleganspor várias horas antes e depois da morte, e isso foi observado em vermes jovens submetidos a lesões letais e em vermes que morreram naturalmente de velhice. Com efeito, observamos que ogentil-1mutante, que carece de atividade de quinureninase, foi menos autofluorescente do que o tipo selvagem. No entanto, nossos resultados indicaram que alguma porção do azulFlA fluorescência está associada ao envelhecimento e não à morte. Notavelmente, como mostrado na Fig.3b, vermes envelhecidos exibiram aumento de azulFluorescência mesmo quando excluídos os dados obtidos nos 2 dias anteriores à morte. Além disso, os vermes aindaFluoresceu mais com o envelhecimento, independentemente do estado daKynu-1gene. ReduzidoFluorescência noKynu-1mutante deve, portanto, ser devido à perdade aceleração da síntese de AGE por quinureninas, em vez da falta de morteFlfluorescência32.


Certos compostos AGE sãoFlfluorescente27. Inferimos que o azulFla fluorescência pode incluir a emissão desses AGEs, separada daquela atribuível à morteFluorescência. Quando proteínas de vermes extraídas foram incubadas com açúcares in vitro, oFlintensidade de fluorescência e os níveis de AGEs aumentaram ao longo do tempo. Vermes cultivados em meio contendo riboseFluoresceu mais do que os animais de controle são criados na ausência de ribose suplementar, mesmo quandoKynu-1foi mutado. Em contraste, vermes cultivados na presença de rifampicina, um conhecido inibidor da produção de AGEs, exibiram níveis reduzidos de azulfluorescência. De fato, a microscopia de fluorescência indicou que 13-vermes de um dia emitiam mais luz azul do que 3-adultos jovens de um dia. A imunocoloração com anticorpos anti-CML ou anti-pentosidina falhou em mostrar a presença de AGEs de disseminação difusa em um padrão de distribuição semelhante ao do azulFluorescência. OFluorescência pode se originar de outros abundantesFlAGEs fluorescentes, como vespertina A, LM-1 e argpirimidina33,34.


Para fornecer a gema para oocistos,C. eleganshermafroditas consomem sua própria biomassa intestinal, o que resulta em atrofia intestinal e deposição ectópica de vitelo mais tarde na vida. Vitelogeninas (proteínas da gema) estavam presentes em níveis duas vezes maiores em vermes velhos (em comparação com animais mais jovens), conforme relatado anteriormente35, e exibiu seis vezes maisFluorescência após glicação in vitro. Esses dados sugeriram que as próprias vitelogeninas gerariam 12- vezes maisfluorescência em vermes mais velhos em comparação com adultos jovens teoricamente. O Western blotting mostrou que as principais bandas que reagiram com o anticorpo anti-CML foram as proteínas da gema. Esse achado coincide com os relatos anteriores de Nakamura et al., que detectaram glicação intensa da vitelogenina36, e Golegaonkar et al., que detectaram diminuição da glicação em vitelogenina-2, vitelogenina-6 e fator de alongamento alfa 1 em nematóides tratados com rifampicina30. Alegadamente, as vitelogeninas atuam como antioxidantes e contribuem para a longevidade das abelhas rainhas37. EmC. elegans, as vitelogeninas desempenham um papel crucial na resistência ao estresse 38. Como os próprios antioxidantes podem ser facilmente oxidados, o acúmulo de vitelogenina glicada pode prejudicar a proteção contra danos oxidativos, resultando na relação inversa entre a expectativa de vida e a intensidade do azulFluorescência observada no presente estudo. No entanto, Sornda et al. relatou recentemente que a expectativa de vida não está relacionada à resistência ao estresse oxidativo mediada por YP115/YP88 (vitelogenina-6)39. Esses pesquisadores propuseram que o acúmulo de vitelogenina YP170, derivado de vitelogeninas 1–5, causa atrofia intestinal e diminuição da expectativa de vida, enquanto o acúmulo de YP115/YP88 pode retardar a atrofia intestinal e prolongar a expectativa de vida. A glicação da vitelogenina-6 e a disfunção resultante, portanto, podem contribuir para a senescência. Embora os fatores de alongamentofluoresceram três vezes mais intensamente após a glicação in vitro, as quantidades dessas proteínas foram semelhantes entre vermes jovens e velhos. Portanto, a contribuição desse fator para o aumento da autofluorescência pode ser menor do que a atribuível às vitelogeninas.

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Cistanchetem sido usado geralmente como um modelo paraestudarintervenções de senescência e anti-senescência. Propusemos o uso da minhoca como modelo para investigar os efeitos pró-longevidadede bactérias do ácido láctico8. Dada a demonstração (no presente estudo) de que o azulFluorescência em nematóides é um possível indicador de acúmulo de AGEs, propomos queCistanche hermafroditas podem servir de modelo para investigar a utilidade de intervenções anti-senescência que agem por meio da supressão da produção de AGEs. Em contraste, é improvável que a autofluorescência seja um biomarcador de senescência para vermes machos porque as vitelogeninas devem ser escassas.

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Fig. 5 Fluorescência azul de mutantes kynu-1, que não devem emitir fluorescência de morte. aIntensidade de fluorescência (ex 340/em 430) de 7- dias de idade e 13- dias de idadeKynu-1mutantes (n = 37 cada); vermes mais velhos ainda emitiam maisFluorescência do que vermes mais jovens, apesar daKynu-1mutação. No entanto, nenhum sinalFifidiferença significativa foi detectada nos valores de autofluorescência pelo Mann–WhitneyU teste.b Um verme de 7-dia mantido com ribose emitiu mais azulFluorescência apesar dagentil-1mutação. AzulFluorescência deC. eleganscultivada com ribose (n = 24) ou sorbitol (n = 18) foi comparado com o de vermes de controle sem os açúcares (n = 20). Os valores de autofluorescência foram comparados usando o não paramétrico Steel–Método Dwass (**p < 0.01). c Curvas de sobrevivência deC. eleganscultivada com ribose (n = 62) ou sorbitol (n = 84) foram comparados com os de vermes de controle sem os açúcares (n = 64). Os vermes tinham 3 dias de idade no dia 0. A sobrevivência do nematóide foi calculada pelo Kaplan–método de Meier e as diferenças de sobrevivência foram testadas quanto à significância pelo uso do teste de log-rank (**p < 0.01).


MÉTODOS

NematódeosCistanche A cepa Bristol N2 e suas cepas mutantes derivadas foram gentilmente cedidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota. As mutações usadas neste estudo foram CB1370daf-2 (e1370)e CB1003Kynu-1 (E1003). Os nematódeos foram mantidos e propagados em NGM de acordo com a técnica padrão 40. Ovos de vermes foram recuperados de vermes adultos após exposição a uma solução de hipoclorito de sódio/hidróxido de sódio conforme descrito anteriormente 41. As suspensões de ovos foram incubadas durante a noite a 25 graus para permitir a eclosão, e a suspensão de L1-estágio de vermes foi centrifugado a 156 ×g por 1 min. O sobrenadante foi removido e as larvas remanescentes foram transferidas para placas frescas de NGM modificado sem peptona (mNGM) cobertas comE. colicepa OP50 (OP50). As cepas foram cultivadas em placas de ágar mNGM a 25 graus, exceto para odaf-2estirpe, que foi cultivada a 20 graus até o estádio L4. Todos os ensaios foram iniciados com vermes adultos jovens que começaram a postura a 25 graus. Nenhuma aprovação ética foi necessária para os nematóides.Cepas bacterianasOP50 foi usado como alimento internacionalmente estabelecido de nematóides. Tryptone soya agar (Nissui Pharmaceutical, Tóquio, Japão) foi usado para cultivar OP50. Bactérias (100 mg de peso úmido) foram suspensas em 0,5 mL de tampão M9; uma alíquota de 50-µL da suspensão bacteriana foi então espalhada no mNGM em placas de 5,5-cm de diâmetro, salvo indicação em contrário.


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Análise multivariada de autofluorescência

Populações de 100 adultos cada foram recuperadas aos 3 e 17 dias de idade,lavado três vezes, concentrado em 3 µL de tampão M9 e armazenado congeladono–80 graus até o uso. Antes da extração, 3 µL de tampão de lise (consistindo emTampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, dodecil sulfato de sódio a 0,1 por cento(SDS), 1 por cento Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonilFluoride (PMSF), e
2 por cento 2-mercaptoetanol) e 4 µL de 15 por cento SDS foram distribuídos para cada tubo. As amostras foram então submetidas aFicinco ciclos de congelamento e descongelamento para liberar proteína. Os espectros fotoluminescentes foram coletados com umFlfluorescênciaespectrofotômetro (Hitachi FL{{0}}) com software de interpretação de dados (FL Solutions ver. 2.0). As propriedades de fluorescência das suspensões de nematóides foram

analisado usando uma matriz de emissão de excitação (EEM)Flespectroscopia de uorescência. Análise multivariada (excitação de comprimento de onda único com múltiplosemissão de comprimento de onda e varredura síncronaFluorometria) rendeu gráficos EEM consistindo em excitação de varredura única e o síncronofluorescênciaos espectros de cada série foram desenhados.



Espectros de fluorescência de vermes envelhecidos

Vermes (3–13 dias de idade) foram recuperados de um meio de crescimento contendo 2'-desoxi-5-Fluorouridina (Tokyo Chemical Industry, Tóquio, Japão). EsseO composto bloqueia o desenvolvimento embrionário da progênie, impedindo assim a contaminação pela prole. Vermes envelhecidos individuais foram coletados emtubos, lavadoscincovezes, concentrado em 3 µL de tampão M9 e armazenado congelado a–80 graus até o uso. Antes da extração, 100 µL de tampão de lise(consistindo de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 10 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de PMSF e 1 µL de coquetel de inibidores de protease (Sigma, St. Louis, MO, EUA)) foram adicionados a cada tubo. As amostras foram moídas usando um Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tóquio, Japão) para liberar
proteína. Os conteúdos de proteína foram medidos quantitativamente usando o Pierce™ Reagente de Ensaio de Proteína 660 nm (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, EUA) e um instrumento NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific). Ofluorescênciaespectro foi determinado para cada amostra 30-µL (contendo 1,5μg de proteína total) usando uma grade multimodo

leitor de microplacas modelo SH-9000Laboratório com software de tratamento de dados SF6(Corona Electric, Ibaraki, Japão). Cada medição foi realizada três vezes.


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Medição da autofluorescência de vermes vivos individuais (método wrap-drop)

Vermes selecionados aleatoriamente foram lavados com tampão M9 e, em seguida,minhocas individuais foram colocadas em 1.0 µL de tampão M9 em adesivo Saran Wrapfilm (Asahi Kasei, Tóquio, Japão) estendido sobre uma 384-placa bem preta(STEM, Tóquio, Japão). Pequenas cavidades foram formadas em cada poço usando umreplicador (Watson, Kobe, Japão). Essa modificação foi para recuperar os vermes com segurança após a medição, de modo que a mudança dependente da idade da autofluorescência de cada verme pudesse ser rastreada. o apegoFilm foi escolhido porque auto-fluoresceu menos do que outros disponíveis comercialmenteFilms.

No entanto, os dados em branco (somente buffer M9) foram verificados três vezes paracada poço, considerando oflutuaçãode bem em bem. Limites mínimos de detecção e limites quantificáveis ​​foram determinados com base em dados em branco em cada dia comoμ (média do espaço em branco)mais3.29σ (desvio padrão) eμmais√2 × 10σ, respectivamente. A autofluorescência no corpo de cada verme

foi capturado com um leitor de microplacas de grade multimodo. Depoismedição, cada verme foi mantido individualmente em um 4,0-cmplaca de diâmetro coberto com OP50 (2 mg/10μTampão L M9) a 25 graus. Cadao ensaio foi realizado em um mínimo de 20 vermes e repetido duas vezes.


Medição da expectativa de vida

Os vermes foram mantidos em placas mNGM cobertas com OP50 a 25 graus até os 13 dias de idade. Após avaliação porfluorescênciaensaio, 30 vermes cada forammudou-se para novas placas mNGM separadas cobertas com OP50. As placas foram incubadas a 25 graus, e os vermes vivos e mortos foram contados a cada 24 h. Um verme era considerado morto quando não respondia a um toque suave de um catador de minhocas.

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AGEs após glicação in vitro

A extração de proteínas foi realizada conforme descrito anteriormente. Vermes de três dias de idade foram usados ​​para glicação artificial. As amostras de proteína (2 mg/mL)foram incubados com 500 mM de glicose, 100 mM de ribose ou 500 mM de frutose(Ficoncentração final). Todas as amostras foram incubadas a 37 graus por 0–4 semanas. Alíquotas (50μL) foram dispensados ​​nos poços de uma placa de poliestireno
(Sumitomo Bakelite, Tóquio, Japão) e incubados por 2 h a 37 graus. Depoisremoção da solução da amostra, a placa foi lavada com PBS-T(solução salina tamponada com fosfato (PBS), 00,05 por cento Tween 20); 250μL de 3 por cento de leite desnatadofoi adicionado a cada poço, e a placa foi incubada por 2 h a 37 graus . Cadapoço, em seguida, foi lavado com PBS-T, e 100μL de um anti-AGE (anti-CML)
anticorpo monoclonal (Clone No. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japão; 75 ng/mL) foi dispensado a cada poço; a placa foi então incubada à temperatura ambientetemperatura por 1h. Após lavagem com PBS-T, 100μL de uma peroxidase conjugadaanticorpo IgG anti-camundongo de cabra (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, EUA; 1:150,000) foi dispensado em cada poço, e
a placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 h. Após lavagem com PBS-T, 100μL de uma solução de trabalho (solução de coloração de tetrametilbenzidina (TMB): solução de peróxido= 1:1; Kit ELISA POD substrato TMB, Popular,Nacalai Tesque, Kyoto, Japão) foi dispensado em cada poço, e a placa foi mantida em temperatura ambiente no escuro até a extinção pelo

adição de 100μL de ácido sulfúrico 1 mol/L por poço. A absorção de cadapoço a 450 nm (sub: 650 nm) e foi medido imediatamente com um leitor de microplacas. O ELISA foi realizado três vezes para cada uma das condições de teste.


Western blotting para vermes envelhecidos

As amostras foram tratadas com 4 × Bolt™ Tampão de Amostra LDS (Thermo Fisher ScientiFific) e 10 × Parafuso™ Agente redutor de amostra (Thermo Fisher ScientiFific), e cada amostra contendo 1,5μg de proteína total foi executado em um Bolt™ 4–12 por cento Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher ScientiFific). Em seguida, as proteínas foram transferidas do gel para um polivinilidenoFlmembrana de uoride (ATTO, Tóquio, Japão) e bloqueada com 5 por cento de leite desnatado em PBS- 0.1 por cento Tween 20 por 1 h. A membrana foi incubada durante a noite a 4 graus com um anticorpo monoclonal anti-AGE (anti-CML) (Clone No. 6D12 a 1:1000), lavada com PBS-T e depois incubada à temperatura ambiente durante 1 h com um anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase (1:25,000). Após a lavagem com PBS-T, a membrana foi incubada com o reagente de detecção de western blotting ECL prime (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Inglaterra) e digitalizada usando um ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) ou ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Reino Unido). As membranas foram então lavadas com PBS-T, incubadas com Western BLoT Stripping Buffer (Takara, Shiga, Japão) por 30 min em temperatura ambiente e lavadas novamente com PBS-T. A membrana foi novamente sondada por anticorpos anti-vitelogenina YP115 e YP170 (cada 1:10.000) a 4 graus durante a noite42, lavados com PBS-T e incubados com anticorpo de cabra anti-rato IgG conjugado com peroxidase (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, EUA) à temperatura ambiente por 2 h. Para os controles de carregamento, as membranas foram novamente sondadas usando um anticorpo anti-actina (Clone No. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e anticorpo anti-camundongo conjugado com peroxidase (GE Healthcare UK). As densidades das bandas de vitelogenina (YP170 e YP115) e CML em cada pista foram normalizadas contra aquelas das bandas de actina na respectiva pista. As densidades de banda foram analisadas usando o software ImageQuant TL (GE Healthcare). Cada ensaio foi realizado duas vezes.


Efeitos da ribose e da rifampicina nos AGEs in vivo

Vermes de três dias de idade foram cultivados em mNGM contendo 400 mM de riboseou sorbitol 400 mM para corresponder à osmolaridade da ribose elevada; alimento para vermes foi fornecido como OP50 morto por calor (100 graus, 10 min) para evitar que as bactérias fermentassem o açúcar. Para evitar a contaminação pela progênie, os vermes foram transferidos para placas frescas diariamente por 4 dias até que estivessem completamente

finalizadopostura de ovos (aos 7 dias). Para avaliar a influência da ribose, realizamos ensaios de sobrevivência e medimos a autofluorescência. Um verme foiconsiderado morto quando não respondeu a um toque suave com um catador de minhocas. Os vermes que morreram por aderirem à parede da placa não foram incluídos na análise e foram censurados. Em um experimento separado,MGM contendo 50 µM (finalconcentração) rifampicina (dissolvida emDMSO) foi usado. Cada ensaio foi repetido duas vezes.


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Fig. 6 Autofluorescência da vitelogenina (Vit) e fator de alongamento (EF). aEspectrofotometria (ex 325/em 350–600) de vitelogenina efator de alongamento antes e depois da glicação in vitro por ribose por 14 dias: gly-Vit e gly-EF são vitelogenina glicada e alongamento glicadofator, respectivamente. RiboFLFLavin (Costela) é mostrado como um representanteLFLcomposto fluorescente. Extrato de 17-vermes de um dia (tipo selvagem N2) é mostrado para comparação (C. elegans). b A glicação in vitro da vitelogenina e o fator de alongamento pela ribose produziram aumentos na autofluorescência
ao longo do tempo.c Análise de Western blotting de AGE e vitelogeninas em amostras extraídas de populações de vermes (tipo selvagem N2) de diferentes idades. Os blots foram derivados do mesmo gel e foram processados ​​com cada anticorpo em ordem.d Quantificaçãode vitelogeninas e AGEs deblotting usando densitometria. Os experimentos foram repetidos duas vezes e os dados de um experimento representativo são mostrados. Tanto a linha quanto a linha pontilhada em vermelho mostram as mudanças de dobra dos AGEs, enquanto as em preto indicam quantidades de vitelogeninas. Círculos fechados e cruzes são para os dados de bandas correspondentes a YP170 e YP115, respectivamente


Identificação de proteínas específicas de vermes antigos

Análise de espectrometria de massa de extratos de nematóides 3- e 17-de um diafoi realizada em um espectrômetro de massa AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF (Newark, NJ, EUA) com Protein Pilot versão 4.0. Ambas as matrizes foramdigerido por tripsina e misturado com uma solução matriz (7 mg/L de - ácido ciano-4-hidroxicinâmico em 0.1 por cento (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA), 70 por cento
(v/v) acetonitrila (ACN)). Oamigotaxa usada para separação foi de 300ML/min,e a separação foi obtida usando um gradiente linear de duas fases móveis ({{0}}.1 por cento (v/v) TFA em 2 por cento ACN (solvente A) e 0,1 por cento (v/v) TFA em 80 porcentagem de ACN(solvente B)) nas seguintes proporções: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). Um sistema MALDI-TOF Mass foi usado para obter uma massa de peptídeoimpressão digital. Correspondência de peptídeos epesquisas de proteínas foram realizadas no banco de dados Swiss-Prot versão 57.0.


As proteínas extraídas foram dissolvidas em bicarbonato de amônio 50 mM(AmBic) para produzir concentrações de proteína entre 0.1 e 1 µg/µL. A fim de maximizar a solubilidade das proteínas, um volume calculado de WatersRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, EUA) foi adicionado para produzirFiconcentrações nais de 0.1–0,2 por cento de Rapigest em amostras pré-digestão. As amostras
foram aquecidos a 40 graus com agitação por 10 min; o conteúdo então eracentrifugado e o pellet resultante foi suspenso em AmBic contendo 10 mM de DTT. As amostras foram aquecidas a 80 graus por 15 min e peletizadas à temperatura ambiente. Uma alíquota de iodoacetamida 200 mM (IAM) em 50 mMAmBic foi adicionado a cada amostra para produzir umfinalconcentração IAM de

20 mM (na presença de um excesso molar de 2× de DTT); a mistura então foiincubado no escuro à temperatura ambiente por 30 min para permitir que a reação de alquilação prossiga. Tripsina em AmBic 50 mM foi misturada com cada solução a 1:50 (tripsina: concentração de proteína). As amostras foram digeridas por pelo menos 4 h ou durante a noite a 37 graus com agitação. Seguindocentrifugação, TFA e ACN foram adicionados para produzirfinalconcentrações de 0,5–1.0 por cento TFA e 2 por cento ACN por volume. As amostras foram agitadas por 2 h a 60 graus. Após centrifugação a 22.200 ×g por 5 minutos, o sobrenadante foipipetado em um frasco de amostrador automático. As proteínas foram digeridas com tripsina antesà análise por cromatografia líquida de fase reversa usando um sistema Ultimate3000RSnanoLC (Thermo Fisher Scientific) acoplado a um sistema ESI-Q-TOF (Impact II Bruker Daltonics). Álcool desidrogenase de leveduraA proteína (ADH1_LEVEDURA) foi acrescentada nas amostras como um padrão interno;o spiking foi realizado para fornecer uma quantidade de aproximadamente 50 fmol dopadrão na coluna.


Autofluorescência após glicação in vitro

A solução de vitelogenina em PBS ({{0}}.053 µM) foi adquirida da Biosense Laboratories AS (Bergen, NORUEGA). A solução de fator de alongamento (1,17 µM) foi adquirida da Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan). Essas soluções foram glicadas com ribose 0,1 mM por 23 dias a 37 graus. RiboFLFLavin foi adquirido da Sigma (Tóquio, Japão) e dissolvido em PBS a 0,1 mM. Cada solução foi medida por espectrofotometria de fluorescência nas mesmas condições.

imunofluorescênciapor vermes jovens e velhosOP50 alimentado com CB1003 sincronizado com a idade foi incubado a 25 graus. Adultos de três dias e 13-dias foram permeabilizados com Bouin's protocolo de fixação do tubo43.


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Fig. 7 Imagens de fluorescência de mutantes 3-day-old e 13-day-old kynu-1. a-cVermes de três dias ed–f 13-worms de um dia, com imagens brutas na coluna 1. Para excluir os possíveis efeitos da morteFluorescência que começa a partir de 2 dias antes dos vermes' morte, o mutanteKynu-1foi usado. A autofluorescência é observada nas imagens das colunas 2 e 3. As fotos da coluna 3 foram ampliadas a partir das áreas indicadas (por retângulos) das imagens da coluna 2. Vermes envelhecidos (13-day-old) autofluorescentesigniFifisignificativamente maior do que vermes jovens (3-dia de idade). Cada barra de escala indica 50μm. g Quantificaçãode azulfluorescênciausando o software ImageJ e ImageQuant TL. Cada barra representa os valores médios deFlintensidade de fluorescência por 1 mm2 de nove vermes. ** indica uma significância estatísticaFifinão há diferença entre vermes de 3-dias e 13-dias em umap valor <0.01. As barras de erro representam o SE.

As amostras foramfixoem Bouin's fixadorcom metanol/ -mercaptoetanolem temperatura ambiente por 30 min. Para quebrar a cutícula, minhocas foram colocadas emisopropanol e armazenado em–80 graus por 10 min, depois incubados em temperatura ambiente por mais 30 min. Ofixadorsolução foi removida esubstituído por solução BTB (tampão borato 25 mM, 0,5 por cento Triton X-100, 2 por cento
-mercaptoetanol) à temperatura ambiente por 1 h; a incubação em BTB foirepetido por um total de três vezes. Os vermes foram então transferidos de BTB para BT (tampão borato 25 mM, 0.5 por cento Triton X-100), incubados em solução tampão de anticorpo (1 × PBS, 0.5 por cento Triton X-100, 0.1 mM EDTA, {{10}}.1 por cento de albumina de soro bovino (BSA), 0,05 por cento de azida de sódio, pH 7,2) à temperatura ambiente para

1 h, e bloqueado com uma solução tampão de anticorpo contendo 10 por cento de soro de cabra(Cosmo Bio, Tóquio, Japão) a 4 graus durante a noite. Os anticorpos primários consistiam em um anticorpo monoclonal de camundongo anti-AGE (anti-CML) (Clone No. 6D12; 1:125) e um anticorpo anti-pentosidina (Clone No. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). O anticorpo secundário consistia em anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado Alexa Fluor 555- (Abcam, Cambridge, Inglaterra; 1:100). Todas as diluições de anticorpo foram realizadas usando tampão de anticorpo contendo 0,5 por cento de BSA. As amostras foram montadas em lâminas de vidro usando o meio de montagem antifade VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA).



Microscópio Fluorescente

Imagens de fluorescência de 3- ou 13-vermes adultos de um dia, montadas em lâminas de vidro conforme descrito acima, foram registradas usando umFlfluorescênciamicroscópio (BZ-X700; Keyence) com uma lente objetiva de 10× (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). Autoflfluorescência de vermes um vermelhofluorescênciada AlexaO Fluor 555 foi visualizado com BZ-X DAPI (comprimento de onda de excitação (Ex), 360 ± 20 nm; comprimento de onda de emissão (Em), 460 ± 25 nm) e TRITC (Ex, 545 ±12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtros, respectivamente. As imagens da seção foramcapturado pelo modo de corte com tipo de fenda unidimensional com umlargura 32 e passo Z-stack 0.7μm para 40-μamostras de m de espessura. Para quantificar o azulfluorescência, ofluorescênciaintensidades medidas por imagem
O software Quant TL (GE Healthcare) foi normalizado para valores de densidade por 1 mm2 de um verme's área de projeção. O tamanho do corpo foi determinado com o software Adobe Photoshop Elements e ImageJ desenvolvido pelo National Institutes of Health. Neste sistema, a área de uma minhoca'projeçãofoi estimado automaticamente e usado como um índice de tamanho corporal.



Análise estatística

A correlação da expectativa de vida foi calculada usando Spearman's coeficiente de correlação de classificação. Os níveis de autofluorescência após a glicação in vitro foram comparados usando ANOVA fatorial de dois fatores e Scheffe's F teste. OOs valores de ELISA após a glicação in vitro foram comparados usando ANOVA de fator único e o teste de Dunnett para comparações múltiplas. Sobrevivência de nematóidesfoi calculado pelo Kaplan–método de Meier e as diferenças de sobrevivência foram testadas quanto à significância pelo uso do teste de log-rank. Os valores de autofluorescência após tratamento com rifampicina e envelhecimento dodaf-2eKynu-1mutantes foram comparados para cada um usando Student's t teste, ANOVA de dois fatores de medida repetida e Mann–WhitneyU teste. Os valores de autofluorescência após tratamentos de ribose para N2 ou oKynu-1mutante foram comparados usando o método não paramétrico Steel–Método Dwass. As densidades da microscopia de autofluorescência foram comparadas usando Student's teste t. Onde a significância foi observada, os dados foram classificadosFifieditado como *p < 0.05 and **p < 0.01. All análises estatísticas foram realizadas com o Microsoft Excel complementado como software de suplementomaisStatcel 3 (OMS, Tóquio, Japão) e JSTAT para Windows(Nankodo, Tóquio, Japão).


Resumo do relatório

Mais informações sobre design de pesquisa estão disponíveis no Nature ResearchResumo de relatórios vinculado a este artigo.


DISPONIBILIDADE DE DADOS

Os conjuntos de dados gerados durante o estudo atual estão disponíveis no site correspondenteautor em pedido razoável.



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