Atriplex Canescens: um novo hospedeiro para Cistanche Deserticola

Contato:tina.xiang@wecistanche.com

Fangming Wang a, Bingyu Zhuo b, Shuai Wang c, Jin Lou c, Yuan Zhang b, Qingliang Chen a, Ziyi Shi a, Yuelin Song b, Pengfei Tu a,*

a State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs e Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing, 100191, China

b Escola de Matéria Médica Chinesa, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, Pequim, 102488, China

c Fundação Quheng, Asia Sci-Tech Center, 4760 Jiangnan Avenue, Binjiang, Hangzhou, Zhejiang, 310053, China

A B S T R A C T

Cistanche deserticolatem sido historicamente usado na medicina tradicional chinesa para complementar a função do rim (yang), beneficiando o sangue e a essência e umedecendo os intestinos para passar nas fezes. Seu hospedeiro. Haloxylon ammodendron é uma importante planta pioneira utilizada para quebra-ventos e fixação de dunas de areia, que são estratégias utilizadas no controle da desertificação. Por muito tempo, considerou-se que C.deserticola só pode parasitar H. ammodendron. Neste estudo, a identificação morfológica, identificação de código de barras de genes e experimentos de inoculação foram realizados, finalmente descobrimos queC. deserticolatambém pode parasitar Atriplex canescens. A.canescens é uma espécie de Chenopodiaceae com ampla adaptabilidade. Comparado com H. ammodendron, tem mais biomassa e uma maior variedade de adaptabilidade ecológica, tornando-o mais adequado para a produção industrial de C. deserticola. Além disso, também encontramos que a concentração de componentes ativos foi maior em C. deserticola parasitado em A. canescens do que naqueles parasitados em H. ammodendron; esta descoberta sugere ainda que a aplicação de C. deserticola em uma escala maior justifica uma maior exploração.

Palavras-chave: Cistanche deserticola Parasitismo Identificação baseada em código de barras de DNA Medicina Tradicional Chinesa Cistanche salsa

1. Introdução

O uso de Cistanche na medicina tradicional chinesa foi registrado pela primeira vez na Escritura Herbal Shennong, por seus efeitos de tonificar o yang do rim, aumentar a essência do sangue e umedecer os intestinos para facilitar a passagem das fezes. Também foi registrado em trabalhos de fitoterapia antiga como 'ginseng do deserto'. Os caules carnudos e secos e as folhas escamosas deCistanche deserticolaYC Ma e Cistanche tubulosa (Schenk) Wight foram o primeiro conjunto descrito em 2005 na Farmacopeia Chinesa. Cistanche é cultivado principalmente em Xingjiang, Mongólia Interior e Gansu da China, e globalmente, é encontrado em áreas semi-áridas e áridas em toda a Península Ibérica Europeia, Norte da África, Arábia, Irã, Afeganistão, Paquistão, Norte da Índia, Mongólia et al. [1]. É resistente a condições ambientais adversas, como climas extremamente áridos, variações severas de temperatura e solos depauperados [2]. De acordo com o Índice Taxonômico de Plantas Superiores Chinesas, existem seis espécies de Cistanche na China. No entanto, um estudo posterior confirmou a existência de apenas quatro espécies e uma variante de Cistanche, a saber,C. deserticolaYC Ma, C. tubulosa (Schenk)R. Wight, C. salsa(CAMey.)G.Beck, C.sinensis G.Beck e C. salsa var. albiflora PF Tu et al,[3].

C. deserticolaé considerada a única fonte tradicional de Cistanche e tem uma longa história de uso na medicina, desde a Dinastia Han Oriental (25 dC-220 dC)[4]. No Compêndio de Matéria Médica (escrito por Li Shizhen. Dinastia Ming), foi documentado para tonificar suavemente o yang (em contraste com outras ervas que têm uma ação mais vigorosa). Uma série de constituintes químicos eficazes, incluindo glicosídeos feniletanoides, iridóides, lignanas, alditóis, oligossacarídeos, polissacarídeos e alcalóides, foram isolados deC. deserticolapor métodos fitoquímicos modernos [5]. Estudos farmacológicos mostraram que o fenetil glicosídeo é o principal componente ativo, e foi relatado que melhora a função sexual, exerce efeitos neuroprotetores, melhora o aprendizado e a memória e protege o fígado. Também exerce efeitos terapêuticos contra demência, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fadiga e tumores, além de exibir propriedades anti-inflamatórias e imunomoduladoras [6, 7].

C. deserticolaé uma planta parasita obrigatória que vive exclusivamente das raízes de Haloxylon ammodendron [8]. Um estudo relatou que C.deserticola não é encontrado nem mesmo em Haloxylon persicum [9]. Nos últimos anos, uma atenção crescente tem sido dada a C, deserticola. uma vez que não só é fonte de componentes de valor medicinal, mas também contribui muito para o controle da desertificação [10].H. ammodendron é o único hospedeiro que tem sido utilizado em estudos envolvendo C. deserticola. Em abril de 2017, Wang Shuai, funcionário do Fundo de Bem-Estar Público de Zhejiang Ouheng, inoculou sementes de C. deserticola em Atriplex canescens no Jardim Botânico do Deserto de Mingin, província de Gansu, e C. deserticola floresceu em maio de 2018 e continuou florescer até maio de 2019. No entanto, as sementes foram compradas no mercado, e é duvidoso que fossem realmente sementes de C. deserticola. Além disso, esse fenômeno rompe com o conhecimento tradicional e precisa ser mais estudado.

A. canescens é um arbusto perene C4 nativo dos desertos do sudoeste da América e se adapta rapidamente às condições de salinidade, metais pesados, seca e altas temperaturas [11]. Por ser altamente palatável e rico em nutrientes, é usado como forragem para a maioria dos rebanhos e animais de grande porte [12]. Além disso, é especialmente útil para controle de erosão e recuperação de terras marginais devido à sua excelente adaptabilidade e extenso sistema radicular. Foi introduzido pela primeira vez na China a partir dos Estados Unidos da América em 1989 e tem sido amplamente utilizado para conservação do solo e da água, fixação de areia e restauração de terras salinas [13]. Embora o estudo que relata o crescimento deC.deserticolasobre A. canescens derruba a compreensão parasitária exclusiva de C. deserticola, isso pode vir a ser um achado revolucionário, uma vez que A. canescens é mais adequado para o crescimento de C. deserticola porque tem mais biomassa e uma gama mais ampla de adaptabilidade ecológica comparado com H. ammodendron.

Para garantir a precisão da descoberta acidental, foram realizados experimentos de identificação de plantas e inoculação artificial. A identificação tradicional de plantas inclui avaliação organoléptica (como toque, cheiro, visão e paladar), análise de características morfológicas (como microscópica e macroscópica) e perfil químico (como cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia em camada fina e gás cromatografia)[14]. É relativamente simples excluir C. tubulosa e C. Sinensis devido à diferença de tamanho, cor e disposição dos feixes vasculares no caule. O verdadeiro desafio é distinguir entre C. deserticola e C. salsa. De acordo com a Flora da China, o comprimento da bráctea de C. salsa é cerca de 1/3 da corola, enquanto é igual em C. deserticola. A transecção dos caules carnosos é semelhante entre C. deserticola e C. salsa e é composta pela epiderme, córtex, feixes vasculares e medula. A principal diferença está na bainha do feixe vascular, pois é caudada para C. deserticola e triangular ou semicircular para C. salsa.

Nos últimos anos, a tecnologia de código de barras de DNA tem sido frequentemente usada para identificação de espécies. É um processo que utiliza uma sequência curta de DNA do genoma padrão, que geralmente é conservada e não é afetada por fatores externos, como idade e tipo de tecido vegetal. As sequências candidatas populares para códigos de barras de DNA de plantas são rbcL, matK, psbA-trnH, ITS e ITS2 [15]. Vários estudos indicaram que ITS/ITS2 é a ferramenta de identificação mais eficaz para plantas. Também foi sugerido que a região ITS2 deve ser incorporada aos códigos de barras do núcleo devido ao seu maior poder discriminatório do que os códigos de barras plastidiais. Foi aceito que ITS2 poderia ser usado como um novo código de barras universal para a identificação de uma ampla gama de taxa de plantas [16, 17,18, 19,20,21]. Embora muitos estudos tenham tentado identificar um código de barras universal da planta, nenhum dos loci disponíveis funciona em todas as espécies, portanto, um método multilocus é necessário para discriminar entre as espécies de plantas [22,23,24,25,26,27, 28]. Neste estudo, ITS2, rbcL,psbA-trnL foram usados ​​como códigos de barras.

Além das técnicas de identificação morfológica e molecular, a evidência direta vem de experimentos de inoculação. Experimentos de inoculação precisam ser realizados para demonstrar que C. deserticola pode parasitar A. canescens. Além da identificação, o controle de qualidade se torna uma consideração primária. Mais investigações são necessárias para verificar a diferença entre a qualidade de C.deserticolaparasitada na raiz de H. ammodendron e aquela parasitada em A. canescent.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais vegetais

Cistanche cresce em solos arenosos macios com salinização suave, geralmente parasitando as raízes laterais de 30-100 cm de profundidade do hospedeiro. O clima na área de cultivo adequada é árido, menos chuvoso, tem grande evaporação, longas horas de sol e grande diferença de temperatura entre o dia e a noite. O condado de Minqin e a cidade de Baiving são os locais de coleta dessas amostras, estão geograficamente próximos e têm um clima árido continental temperado, com precipitação média anual de 113,2 mm e umidade relativa média anual de 44%. Informações específicas e detalhadas da coleta de amostras são mostradas na Tabela 1. Todas as amostras foram congeladas e preservadas em -20 grau no Laboratório Chave do Estado do Laboratório de Drogas Naturais e Biomiméticas, Pequim, China.

2.2. Coloração e observação do tecido

Amostras frescas foram obtidas e armazenadas em uma solução composta por 70 por cento de etanol, ácido acético glacial e formaldeído na proporção de 90:5:5 e foram desidratadas usando um gradiente de etanol (75 por cento, 95 por cento, 100 por cento, 100 por cento). por 1h. Os cortes desidratados foram submetidos a um gradiente de xileno (25 por cento ,50 por cento ,75 por cento ,100 por cento ,100 por cento ) por 1 h para obtenção de cortes transparentes. As seções transparentes foram submetidas a infiltração de parafina, onde um volume de parafina igual ao volume de xileno foi adicionado ao xileno contendo a amostra, metade da solução resultante foi então aspirada e um volume igual de parafina foi adicionado novamente. Este processo foi repetido 10 vezes e, finalmente, todas as soluções foram aspiradas e substituídas por igual volume de parafina; esta etapa final foi repetida duas vezes, e a solução resultante após cada etapa foi incubada por 1 h a 75 graus. Após a infiltração de parafina, os cortes foram submetidos ao embutimento, onde as amostras foram colocadas em um tanque de ferro contendo parafina líquida e parafina líquida adicional foi rapidamente adicionada para encher todo o tanque e deixada para solidificar. O bloco de cera resultante foi aparado e seccionado. As seções incorporadas foram colocadas em água morna, pescadas, colocadas em uma lâmina e incubadas a 45 graus por 30 min. As seções da lâmina foram desparafinadas por imersão em série em 100 por cento de xileno, 100 por cento de xileno, 50 por cento de xileno, 50 por cento de xileno, 100 por cento de etanol, 100 por cento de etanol, 95 por cento de etanol e 75 por cento de etanol e, em seguida, embebidas em safranina O por 40 min. Isto foi seguido por outra rodada de imersão rápida em série, em 75 por cento de etanol e 95 por cento de etanol e, em seguida, as lâminas são submersas em verde rápido por 1 min. Finalmente, as seções foram submetidas a uma última imersão em série em 95 por cento de etanol, 95 por cento de etanol, 100 por cento de etanol, 100 por cento de etanol, 50 por cento de xileno, 50 por cento de xileno e 100 por cento de xileno. Após a coloração dos cortes, uma gota de cola resinada foi colocada sobre a lâmina e uma lamínula foi colocada sobre ela. As lâminas foram deixadas em repouso por uma semana e as seções de tecido foram observadas usando um microscópio óptico Olympus e fotografadas.

2.3. Extração de DNA e amplificação por PCR

O DNA genômico total foi extraído de espécimes de flores usando um kit de extração de DNA genômico de plantas (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pequim, China) de acordo com os protocolos do fabricante. Os primers para amplificação e sequenciamento de genes e as condições de reação são mostrados na Tabela 2. Cada amplificação de gene foi repetida três vezes para cada amostra.

2.4. Análise de sequenciamento

Para obter sequências precisas, os produtos finais de PCR, após purificação com os Kits de Extração de Gel Transgene Quick, foram clonados separadamente em vetores de clonagem pEASY-Blunt, de acordo com as instruções do fabricante. Após a clonagem, foram transformadas em células Trans5a quimicamente competentes. Três colônias de cada amostra foram selecionadas aleatoriamente e sequenciadas usando primers M13. Essas colônias foram sequenciadas bidirecionalmente por sequenciamento Sanger, usando os kits de sequenciamento de ciclo BigDye Terminator V3.1 nos analisadores de DNA ABI Prism 37{13}}0. As sequências obtidas foram alinhadas usando Clustal X(v1.8.7)[29]e sincronizadas manualmente no BioEdit(v.1.3.0)[30. Utilizando os dados da sequência alinhada, reconstruímos a filogenia usando o software MEGA 7 usando o método neighbor-joining (NJ). Foi usado o modelo de parâmetro 2-Kimura (K2P) e o bootstrap foi de 1000 repetições [31].

2.5. Inoculação de C. deserticola

Três gramas de sementes de C. deserticola foram adicionados aos vasos (diâmetro × altura × diâmetro do fundo =20 cm × 20 cm × 12 cm) contendo solo arenoso e agitados para garantir uma distribuição uniforme. O grupo controle consistiu de 3 g de sementes de C. salsa adicionadas a vasos semelhantes contendo solo arenoso. Finalmente, A. canescens foi plantada em cada vaso, e os vasos foram colocados ao ar livre. Quando o teor de umidade do solo é inferior a 13 por cento (g/g), os vasos foram regados. O experimento foi conduzido no Parque de Ciências da Vida de Zhongguancun, Pequim, China (latitude 39 graus 56'N, longitude 116 graus 20'E; 20m acima do nível do mar) de maio a julho. A temperatura diurna variou entre 16 e 35 graus, a temperatura noturna entre 12 e 16 graus. A umidade relativa do ar é superior a 50%. A luz do sol é abundante. Aproximadamente 80 dias depois, o solo foi removido dos vasos e a taxa de inoculação foi determinada.

2.6. Determinação da concentração de componentes medicinais

A determinação da concentração dos componentes medicinais inclui duas partes, uma é o procedimento para cromatografia líquida e a outra é a preparação da substância de referência e da substância teste, mais detalhes são os seguintes:

eu). Determinação de echinacoside e verbascoside

Echinacoside e verbascoside foram pesados ​​e adicionados em 50 por cento de metanol para produzir uma solução de 0,2 mg/ml, que foi usada como solução de referência. A primeira é moer C. deserticola seca em pó, então o pó foi misturado em 50 ml de metanol a 50 por cento em um balão volumétrico marrom de 100 ml, e o líquido de teste foi obtido após submeter a mistura a agitação, imersão, sonicação, repouso , e filtração. A coluna cromatográfica foi uma coluna Agilent ZORBAX SB-C18 (4,6 mm × 150 mm,5um), com metanol(A)-0,1 por cento de solução de ácido fórmico (B) como fase móvel, eluição de gradiente ({{14} } min, 26,5 por cento A;17-20 min, 26,5 por cento → 29,5 por cento A; 20-27 min, 29,5 por cento A), a taxa de fluxo foi de 1,0 mL/min, a temperatura da coluna foi de 35 ° C, comprimento de onda de detecção foi de 330 nm, o volume de injeção foi de 10μul.

ii). Determinação de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose

Betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose foram pesados ​​com precisão e adicionados à água para fazer uma solução de {{0}},25 mg/ml, que foi usada como solução de referência. Cinco mililitros da solução de teste Cistanche acima mencionada foram misturados com 50 por cento de metanol em um balão volumétrico de 25 ml, bem agitados e filtrados com uma membrana microporosa de 0,2 um. A coluna cromatográfica foi SHODEXASHAIPAK NH2P-50 4E coluna de gel polimerizado （250 mm × 4,6 mm, 5μm）, a fase móvel foi parasitada em A. canescens, verificamos que ela possuía uma bainha de feixe vascular em forma caudada, semelhante à de A. canescens C. deserticola (Figura 2).

acetonitrila-água (77:23), a taxa de fluxo foi de 0,7 mL/min, a temperatura da coluna foi de 25 graus, usando o detector de dispersão de luz evaporativa (ELSD), a temperatura do tubo de deriva foi de 100 graus, o transportador a vazão de gás foi de 3 L/min, o volume de injeção da substância de referência e da amostra foram de 5 ul.

3. Resultados

3.1. Identificação morfológica de flores

Para confirmar a espécie de Cistanche que parasita A. canescens, foi realizada a análise morfológica dos espécimes florais (Figura 1 e Figura S1). A morfologia geral das flores da planta parasita foi semelhante à de C. deserticola. Além disso, a corola era mais espessa do que a de C. salsa em diferentes hospedeiros.

De acordo com a Flora da China, C. deserticola e C. salsa têm diferenças óbvias na bráctea das flores. Em C. deserticola, brácteas sub-iguais à corola, enquanto a bráctea de C. salsa é 1/3 do comprimento da corola. Com base em nossa análise estatística, as brácteas de Cistanche parasitadas em A. canescens e as de C. deserticola subigualaram a corola (Figura S2). O Cistanche de A. canescens exibiu características morfológicas de C. deserticola, sugerindo que C. deserticola pode ser o parasita de A. canescens.

3.2. Identificação microscópica de espécimes de tecido corados

A transecção do caule carnoso de C. deserticola é muito semelhante à de C. salsa, e ambas são compostas por epiderme, córtex, feixe vascular e medula. Os feixes vasculares de ambas as plantas estão dispostos em anéis ondulados ou ondulados profundos, e as medulas são obviamente visíveis. A principal diferença está na forma lateral da bainha do feixe vascular; é caudado em C. deserticola e triangular ou semicircular em C. salsa. Ao realizar uma análise de microestrutura no Cistanche

3.3. Identificação molecular

Além da identificação morfológica, também realizamos uma identificação molecular e selecionamos três fragmentos gênicos, a saber, ITS2, rbcL e psbA-trnL. Uma árvore evolutiva foi construída usando as informações de sequência de cada fragmento (Figura 3), e todas as três árvores filogenéticas mostraram que o Cistanche parasitado em A.canescens tinha uma relação filogenética próxima com C. deserticola. Esses resultados indicam que C. deserticola pode ser o parasita de A. canescens.

Divergências gênicas detalhadas entre as diferentes espécies de Cistanche foram observadas após o alinhamento de múltiplas sequências (Figura 4). Encontramos três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no corpo gênico ITS2 entre C. deserticola e C. salsa, nas bases 139.295 e 472. No corpo gênico rbcL, houve quatro divergências gênicas entre C. deserticola e C. salsa, contendo dois SNPs e duas inserções e deleções (indel)mutações. Comparado com ITS2 e rbL, as diferenças no corpo do gene psbA-trnL entre C. deserticola e C. salsa foram mais óbvias, com sete divergências de sequência, sendo quatro SNPs e três mutações InDel. Em particular, uma série de repetições de timina, começando na base 414 da sequência alinhada, pode ser usada para desenvolver marcadores de repetição de sequência simples (SSR) para distinguir C. deserticola e C. salsa.

3.4. Inoculação de C. deserticola

Para testar se C. deserticola ou C. salsa poderiam parasitar A.canescens, um experimento de inoculação foi realizado e encontramos evidências de parasitismo em todos os vasos inoculados com C.deserticola com uma taxa de inoculação de quase 100 por cento (Figura 5). Não foi observado parasitismo nos grupos controle. Este resultado prova diretamente que C. deserticola parasitava facilmente A. canescens, enquanto C. salsa não.

3.5. Determinação da concentração de componentes medicinais significativos

Estimamos a concentração de componentes medicinais importantes em C.deserticola parasitado em A. canescens. O cromatograma específico é mostrado no material suplementar. Para obter resultados precisos, quatro experimentos independentes foram montados. Com base em nossas medições (Tabela 3), descobrimos que a concentração de verbascoside e echinacoside foi 20 vezes maior do que a relatada na Farmacopeia Chinesa (de acordo com a Farmacopeia Chinesa, a porcentagem da soma das concentrações de echinacoside e verbascoside em C. deserticola deve ser inferior a 0,30 por cento). As concentrações também foram significativamente maiores do que em C. deserticola parasitada em H. ammodendron (geralmente 0,2-1,5 por cento)[32]. A concentração de manitol, betaína, frutose e outros componentes de carboidratos também foi muito alta, e a qualidade geral foi melhor do que em C. deserticola parasitada em H. ammodendron. Assim, esses resultados indicam que A. canescens pode ser usado para cultivar C. deserticola em nível industrial e proteger recursos silvestres ameaçados.

4. Discussão

Anteriormente, considerava-se que C. deserticola parasita exclusivamente H. ammodendron. No entanto, neste estudo, utilizando técnicas de identificação morfológica e molecular, demonstramos que C. deserticola também pode parasitar A. canescens. Embora H. ammodendron, A. canescens e H. persicum pertençam à família Chenopodiaceae, é interessante e peculiar que C. deserticola tenha seletividade de espécies, possivelmente governada pelas moléculas sinalizadoras secretadas pelo hospedeiro. A. canescens, originária dos Estados Unidos da América, apresenta forte resistência a perturbações ambientais e possui biomassa relativamente grande. A. canescens é um hospedeiro viável para C. deserticola por várias razões. Primeiro, ele pode sobreviver em uma ampla gama de condições ambientais. Em segundo lugar, a biomassa e a taxa de crescimento de C. deserticola podem ser maiores e mais rápidas, respectivamente, em A. canescens do que em H. ammodendron. Terceiro, devido à ampla variedade de adaptabilidade de A. canescens, a área de plantio pode ser expandida ainda mais. Assim, A. canescens tem vantagens distintas sobre H. ammodendron como hospedeiro e auxiliará na produção industrial de C. deserticola. C. deserticola e C. salsa são difíceis de distinguir, e a identificação morfológica no passado produziu resultados confusos. Com os avanços no campo da biologia molecular, as técnicas de identificação baseadas em moléculas têm sido amplamente utilizadas na fitoterapia chinesa. Como a maioria dos medicamentos fitoterápicos chineses oferece pouca informação genômica, a tecnologia de código de barras de DNA surgiu como uma técnica de identificação inovadora. Neste estudo, a tecnologia de código de barras morfológico e de DNA foi amplamente aplicada para identificar as espécies desconhecidas de Cistanche; isso não foi tentado antes, e nossos resultados demonstram que essa abordagem é viável. Como C. deserticola parasita A. canescens, é importante determinar diferenças na qualidade de C. deserticola nas raízes de A. canescens e nas raízes de H. ammodendron. De acordo com nossos resultados, a concentração de componentes ativos foi maior em C. deserticola parasitada em A. canescens do que naquela parasitada em H. ammodendron. Assim, nossos resultados estabelecem uma base teórica sólida para a produção em larga escala de C. deserticola parasitada em A. canescens.

5. Conclusões

Por muito tempo, C. deserticola foi considerado parasita exclusivamente H. ammodendron. Anteriormente, verificou-se que sementes de C. deserticola compradas no mercado podem parasitar A. canescens, outra planta de Chenopodiaceae. Utilizando métodos de identificação morfológica e molecular, confirmamos que a espécie de Cistanche parasitando A. canescens era C. deserticola. Este resultado foi ainda confirmado pela experiência de inoculação. Determinamos a concentração de componentes medicinais significativos e nossos resultados sugerem que a concentração e a qualidade dos componentes foram maiores em C,deserticola parasitado em A. canescens do que naquele parasitado em H. ammodendron. A descoberta de novos hospedeiros pode promover a produção industrial de C. deserticola, além de proteger efetivamente os recursos silvestres e o meio ambiente ecológico.

Declarações

Declaração de contribuição do autor

Fangming Wang: Concebeu e projetou os experimentos; Realizou os experimentos; Analisou e interpretou os dados; escreveu o papel.

Bingyu Zhuo, Yuan Zhang, Qingliang Chen, Ziyi Shi e Yuelin Song: Realizaram os experimentos.

Shuai Wang & Jin Lou: Contribuição de reagentes, materiais, ferramentas de análise ou dados.

Pengfei Tu: Concebeu e projetou os experimentos.

Declaração de financiamento

Fangming Wang foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2019YFC1710903).

Dr.Pengfei Tu foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (8177140819).

Declarações de disponibilidade de dados

Os dados serão disponibilizados mediante solicitação.

Declaração de declaração de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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