O inibidor ASK1 NQDI-1 diminui o estresse oxidativo e a neuroapoptose por meio da via de sinalização ASK1/p38 e JNK em lesão cerebral precoce após hemorragia subaracnóidea em ratos, parte 1

Abstrato. O estresse oxidativo e a neuroapoptose são processos patológicos chave após a hemorragia subaracnóidea (HSA). O presente estudo avaliou os efeitos neuroprotetores antioxidação e antiapoptóticos do inibidor da quinase reguladora do sinal de apoptose 1 (ASK1) etil‑2,7‑dioxo‑2,7‑dihidro‑3H‑nafto(1,2, 3‑de)quinolina1‑carboxilato (NQDI‑1) na lesão cerebral precoce (EBI) após SAH em um modelo de rato. Um total de 191 ratos foram usados ​​e o modelo de HAS foi induzido por meio de perfuração de monofilamento. Western blotting foi posteriormente usado para detectar os níveis de expressão endógena de proteínas. A imunofluorescência foi então usada para confirmar a localização celular nervosa de ASK1. A função neurológica de curto prazo foi avaliada usando os escores modificados de Garcia e o teste de equilíbrio na trave 24h após a HSA, enquanto a função neurológica de longo prazo foi avaliada usando o teste do rotarod e o teste do labirinto aquático de Morris. A apoptose dos neurônios foi avaliada pela coloração TUNEL e o estresse oxidativo foi avaliado pela coloração com dihidroetídio 24 h após a HSA. Os níveis de expressão proteica de (p‑)ASK1 e ASK1 fosforilados aumentaram após a HSA. O NQDI‑1 foi injetado por via intracerebroventricular 1h após a HSA e demonstrou melhorias significativas na função neurológica de curto e longo prazo e reduziu significativamente o estresse oxidativo e a apoptose neuronal. A injeção de NQDI‑1 causou uma diminuição significativa nos níveis de expressão de proteína de p‑ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4 hydroxynonenal e Bax e aumentou significativamente os níveis de expressão de proteína de heme oxigenase 1 e Bcl‑2. O uso do inibidor de p38 BMS‑582949 ou do inibidor de JNK SP600125 levou a reduções significativas nos níveis de expressão da proteína p‑p38 ou p‑JNK, respectivamente, e a uma redução significativa no estresse oxidativo e na apoptose neuronal; no entanto, esses inibidores não demonstraram efeito nos níveis de expressão da proteína p‑ASK1 ou ASK1. Em conclusão, o tratamento com NQDI-1 melhorou a função neurológica e diminuiu o estresse oxidativo e a apoptose neuronal em EBI após HSA em ratos, possivelmente via inibição da fosforilação de ASK1 e da via de sinalização ASK1/p38 e JNK. O NQDI‑1 pode ser considerado um agente potencial para o tratamento de pacientes com HAS.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolonga o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhora a atividade de SOD no soro e retarda a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave: hemorragia subaracnóidea, NQDI-1, quinase reguladora do sinal de apoptose 1, estresse oxidativo, apoptose, lesão cerebral precoce

Introdução

A hemorragia subaracnóidea (HSA) é uma doença cerebrovascular aguda grave causada pelo fluxo de sangue para o espaço subaracnóideo do cérebro (1). No entanto, atualmente, não existem medicamentos eficazes disponíveis para melhorar o dano ao tecido cerebral após a HSA após a prevenção de ressangramento (2). Portanto, são urgentemente necessários mais estudos sobre os mecanismos de lesão cerebral após HSA e a exploração de opções de tratamento adequadas para melhorar o prognóstico da HAS.

A lesão cerebral precoce (EBI) refere-se ao dano secundário do tecido cerebral causado por múltiplos distúrbios fisiológicos e uma série de alterações patológicas que ocorrem dentro de 72 horas após o início da HSA (3). Na fase de resposta aguda após a HSA, a lesão inicia-se com a entrada de grande quantidade de sangue no espaço subaracnóideo, seguida de uma série de lesões patológicas (4). Como as mitocôndrias são particularmente suscetíveis à hipóxia e à lesão isquêmica, a disfunção mitocondrial é uma das principais lesões patológicas sofridas após a HSA (5). Um grande número de espécies reativas de oxigênio (ROS) é liberado, o que leva ao aumento do estresse oxidativo e ativação da via apoptótica mitocondrial, causando lesão e disfunção mitocondrial (6). Portanto, modalidades terapêuticas que reduzam o estresse oxidativo e a apoptose são fundamentais para a melhora do prognóstico da HAS.

A quinase reguladora do sinal de apoptose 1 (ASK1), um membro da família da proteína 3 quinase ativada por mitogênio (MAP3K), é ativada por vários tipos diferentes de estresse celular e tem um papel importante no estresse oxidativo e na apoptose (7). Em culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos, o inibidor de Rho quinase fasudil reverte a elevação induzida por amiloide de (p-)ASK1 fosforilada, que diminui a apoptose neuronal na doença de Alzheimer (8). Até onde sabemos, no entanto, as opções terapêuticas direcionadas ao ASK1 após HSA não foram avaliadas.

Etil‑2,7‑dioxo‑2,7‑dihidro-3H-nafto(1,2,3-de)quinolina1-carboxilato (NQDI‑1) foi relatado como sendo um inibidor específico de ASK1 e foi validado usando ensaios de quinase in vitro (9,10). Estudos anteriores relataram que o NQDI-1 pode ser eficaz no tratamento de várias doenças por meio da inibição da atividade de ASK1 (11,12). O NQDI-1 alivia o dano mitocondrial induzido por microcistina-LR e a apoptose nas células da granulosa ovariana por meio da inibição da ativação de ASK1 (13). Além disso, a indometacina pode induzir respostas de cascata apoptótica em células gliais por meio da ativação de ASK1 do estresse do retículo endoplasmático (14). Portanto, o inibidor específico de ASK1 NQDI‑1 pode exercer efeitos neuroprotetores após HSA através da inibição da atividade de ASK1. p38 e JNK são considerados as vias de sinalização downstream de ASK1; p38 e JNK ativados podem ativar ainda mais uma variedade de substratos, incluindo fatores de transcrição nuclear, bem como proteínas quinases e outras proteínas funcionais, o que leva ao início do estresse oxidativo e apoptose (15).

Foi hipotetizado que o inibidor de ASK1 NQDI‑1 exerce efeitos neuroprotetores e diminui o estresse oxidativo e a neuroapoptose por meio da via de sinalização ASK1/p38 e JNK em EBI após HSA em ratos.

Materiais e métodos

Animais experimentais.Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética para Animais Experimentais da Central South University (aprovação nº 2019sydw0104). Um total de 191 ratos machos Sprague‑Dawley (SD) pesando 280‑320 g foram alojados em um ambiente de temperatura constante (21‑23˚C) e umidade (45‑50 por cento) com um ciclo claro/escuro de 12/12 h e tinham livre acesso a água e comida. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (16) e foram realizadas pelas diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para o cuidado e uso de animais (17). Quando os ratos atingiram o ponto de tempo predefinido designado do experimento ou atenderam a certos critérios para eutanásia [perda total de apetite por 24 horas ou falta de apetite (50% abaixo do normal) por 3 dias, incapacidade de comer ou beber, ou foram avaliados como sendo perto da morte (comportamento autolesivo, postura anormal, desconforto respiratório, etc.)], os ratos foram colocados em um dispositivo de eutanásia de dióxido de carbono com taxa de deslocamento de volume de CO2 definida em 30% /min (18). A morte foi confirmada pela cessação da respiração e batimentos cardíacos e dilatação da pupila. As carcaças de todos os ratos foram ensacadas e congeladas para descarte ambientalmente correto.

Modelo SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 pela avaliação do escore de classificação da HAS foram considerados para atender aos requisitos experimentais e ser um modelo de sucesso. O procedimento do grupo sham foi semelhante ao do grupo HSA, exceto que o fio de prolina 4‑0 não perfurou a parede arterial. A respiração, frequência cardíaca, cor da pele e reflexo pedal foram monitorados a cada 5 min durante as fases de recuperação cirúrgica e anestésica. Destes, 23 ratos morreram e 8 ratos foram excluídos, e essas mortes e exclusões foram complementadas por novos ratos modelados com SAH.

Gravidade da HAS.A gravidade da HSA foi avaliada por meio do escore de classificação da HSA 24 horas após a HSA (20). O lado ventral do tecido cerebral foi dividido em 6 regiões, cada uma classificada como 0‑3, dependendo da quantidade de coágulo sanguíneo e quão bem os vasos sanguíneos foram obscurecidos: Uma pontuação de 0 indica nenhum coágulo, 1 indica uma pequena quantidade de coágulo, 2 indica uma quantidade moderada de coágulo, mas grandes vasos na base do crânio ainda são identificáveis ​​e 3 indica uma grande quantidade de coágulo e vasos não identificáveis ​​na base do crânio. As seis pontuações regionais foram somadas para calcular uma pontuação total (0‑18), onde pontuações mais altas indicavam hemorragia mais grave. Ratos com uma pontuação total de grau de SAH inferior ou igual a 8 foram considerados como tendo SAH leve, excluídos de experimentos subsequentes e substituídos por ratos recém-modelados.

Administração de Drogas.Para permitir que as concentrações da droga no tecido cerebral sejam reguladas com mais precisão, independentemente do fígado e de outros fatores, os siRNAs e o NQDI-1 foram administrados por injeção intracerebroventricular (21). Após a anestesia (indução, 3% de isoflurano; manutenção, 2% de isoflurano), os ratos foram fixados em um aparelho estereotáxico cerebral. O microinjetor foi fixado ao bregma em 1,0 posterior, 1,5 à direita e 3,3 mm de profundidade. O siRNA ASK1 (cat. no. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ou controle de siRNA Scr (cat. no. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) foram dissolvidos em 5 µl de água deionizada estéril sem nuclease em uma concentração de 500 pmol e administrado 48 h antes da HSA. As sequências do ASK1 siRNA foram as seguintes: Sense 5'‑CGG CAGACAUUGUUAUCAAtt‑3' e antisense 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3'. As concentrações e doses de drogas relatadas em um estudo semelhante (22) e a solubilidade do NQDI‑1 foram usadas para determinar as concentrações usadas no presente estudo. Três doses de NQDI‑1 (1, 3 e 10 µg/kg; Selleck Chemicals) ou solução veículo em um volume total de 5 µl/rato foram injetadas 1 h após a HSA. As soluções BMS‑582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals) e veículo conseguiram atravessar a barreira hematoencefálica e foram administradas por via intraperitoneal 1 hora após a HSA (23,24).

Função neurológica de curto prazo.O escore de Garcia modificado e o escore de equilíbrio da trave foram usados ​​para avaliar a função neurológica de curto prazo 24 horas após a HSA. A pontuação modificada de Garcia foi dividida em seis categorias como segue: movimento voluntário, movimento voluntário dos membros, extensão da pata dianteira, capacidade de escalar, respostas somatossensoriais e resposta tentacular, cada uma das quais foi pontuada individualmente e somada para dar uma pontuação total variando de 3 a 18 (25). Pontuações mais altas foram consideradas para indicar melhor função neurológica. Para a pontuação de equilíbrio da trave, os ratos foram colocados em uma trave por 1 min e uma pontuação variando de 0-4 foi avaliada com base na distância percorrida (26). Pontuações mais altas foram consideradas para indicar melhor função neurológica.

Função neurológica de longo prazo.Os experimentos de pré-adaptação do Rotarod foram realizados em ratos usando a mesma velocidade inicial e aceleração antes da modelagem da SAH. Os ratos foram colocados em um testador de barra rotativa Rotamex (Columbus Instruments) para o teste Rotarod nos dias 7, 14 e 21 após a SAH (27). Primeiro, a velocidade inicial do Rotarod foi ajustada para 5 rotações por minuto e a aceleração para 2 rotações por 5 segundos. Depois de colocar os ratos, a latência de queda dos ratos foi registrada. Os ratos foram então deixados em repouso por 1 h. Finalmente, a latência de queda dos ratos foi testada novamente na velocidade inicial de 5 rotações por minuto e uma aceleração de 2 rotações por 5 seg. Maior latência de queda foi considerada para indicar melhor coordenação motora no rato. Na semana 4 após a modelagem da SAH, o teste do labirinto aquático de Morris foi usado para avaliar a memória de aprendizagem e a orientação espacial dos ratos (27). O exercício de aprendizagem de nadar e encontrar uma plataforma localizada abaixo da superfície da água foi realizado do dia 1 ao dia 5 na semana 4 (dias 28‑33 pós-SAH) e a trajetória de natação, latência de fuga e distância de natação foram registradas. No último dia, a plataforma foi removida para teste e a trajetória de nado, a distância de nado e a duração do quadrante da sonda foram registradas por 60 segundos.

IF coloração.Após perfusão sequencial de solução salina a 4˚C e 4˚C, 4 por cento de paraformaldeído do coração para remover o sangue do tecido cerebral, foi obtido tecido cerebral intacto. Após desidratação em gradiente de sacarose, o tecido cerebral foi então cortado em cortes de 10 µm em posição coronal e armazenado a -20˚C. A coloração IF foi usada para avaliar a co-localização de ASK1 com células nervosas. As seções de tecido congelado foram bloqueadas com 5 por cento de soro de burro (cat. n.º G1217‑5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) durante 2 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4˚C com anticorpos primários como se segue: Anti‑ASK1 (mouse; 1:200; cat. no. 67072‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti‑NeuN (coelho; 1:200; cat. no. 26975‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.) , molécula adaptadora de ligação de cálcio anti-ionizada-1 (Iba-1; coelho; 1:200; cat. no. 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) e proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP; frango ; 1:200; cat. no. ab4674; Abcam). As seções de tecido foram então incubadas por 2 h em temperatura ambiente com os correspondentes anticorpos secundários fluorescentes como segue: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti‑Mouse IgG (H mais L) (cat. no. 715‑585‑150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) AffiniPure Donkey Anti‑Chicken IgY (IgG) (H mais L) (cat. n.º 703‑545‑155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Posteriormente, eles foram corados para núcleos celulares usando 2 µg/ml DAPI (cat. n.º G1012‑100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) durante 10 min à temperatura ambiente. As seções foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência Olympus BX53 (Olympus Corporation) e as imagens foram capturadas.

Coloração de dihidroetídio (DHE).A coloração DHE foi realizada para avaliar o estresse oxidativo do cérebro (28). Seções de tecido cerebral congeladas foram incubadas com 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37˚C por 30 min no escuro. Após coloração para núcleos celulares usando 2 µg/ml DAPI por 10 min em temperatura ambiente, as seções foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência Olympus BX53. Um total de seis seções de cada tecido cerebral foram selecionados aleatoriamente e seis áreas em cada seção foram selecionadas aleatoriamente para geração de imagens. O número de células positivas para DHE foi contado usando o software ImageJ 1.4 (National Institutes of Health) e a média foi calculada e tomada como as porcentagens finais para cada seção de tecido cerebral.

Coloração TUNEL.A coloração TUNEL foi usada para avaliar a porcentagem de neurônios apoptóticos (29). As seções de tecido congelado foram bloqueadas com 5 por cento de soro de burro por 2 h em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo primário anti-NeuN (coelho; 1:200; cat. no. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc .). As seções de tecido foram então incubadas com o anticorpo secundário fluorescente Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H mais L) (cat. no. 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) por 2 h à temperatura ambiente. A coloração TUNEL foi realizada usando o kit One Step TUNEL Apoptosis Assay (cat. n.º C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) de acordo com o protocolo do fabricante. Finalmente, as seções de tecido foram coradas para núcleos celulares usando 2 µg/ml DAPI por 10 min em temperatura ambiente. A seleção aleatória dos locais de contagem TUNEL e o cálculo dos neurônios TUNEL-positivos para cada seção foram realizados usando o método acima mencionado para contagem DHE.

Ocidental blotting (WB).O WB foi usado para semiquantificar os níveis de expressão de proteínas. Após a perfusão de solução salina a 4˚C do coração para remover o sangue do tecido cerebral, obteve-se tecido cerebral intacto. Estudos anteriores relataram que o modelo de SAH, induzido por punção endovascular do lado esquerdo, resulta em um grau de viés para eventos hemorrágicos e pode ser relativamente grave em termos de danos ao tecido cerebral do lado esquerdo (30). Portanto, o tecido cerebral do lado esquerdo foi usado para avaliar o dano patológico após a modelagem da SAH. As proteínas do tecido cerebral foram extraídas usando solução de lise RIPA (cat. no. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de proteína das amostras foi determinada pelo ensaio BCA (cat. n.º P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) e posteriormente ajustada para 5 µg/µl pela adição de diferentes quantidades de água bidestilada. Os 5 µl de 5 µg/µl de amostras de proteína foram adicionados a cada pista e essas amostras de proteína foram separadas em géis de 10% por eletroforese SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas por 2 h em temperatura ambiente usando 5% de leite em pó desnatado (cat. n° P0216‑300g; Beyotime Institute of Biotechnology). As membranas foram incubadas durante a noite a 4˚C com os seguintes anticorpos primários: Anti‑p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1,000; cat. no. MA5‑28020; Thermo Fisher Scientific, Inc .), anti‑ASK1 (1:1,000; cat. no. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; cat. no. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p38 MAPK (1:1,000; cat. no. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), proteína quinase anti‑fosfo‑estresse ativada/quinase Jun‑amino‑terminal (fosfo‑SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; cat. n.º 9255; sinalização celular Technology, Inc.), anti-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; cat. nº 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-4 hidroxinonenal (4-HNE; 1:1 ,000; cat. no. ab46545; Abcam), anti-heme oxigenase 1 (HO-1; 1:1,000; cat. no. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑Bcl‑2 (1:1,000; cat. no. 26593‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.), anti‑Bax (1,1000; cat. no. 60267‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) e anti‑actina (1:2,000; cat. no. 4970; Cell Signaling Technology, Inc.). Seguiu-se a incubação com os anticorpos secundários apropriados conjugados com peroxidase de rábano durante 2 horas à temperatura ambiente: IgG-HRP de cabra anti-rato (cat. n.º sc-2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) ou IgG‑HRP anti‑coelho de cabra (cat. n. sc‑2004; 1:5.000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), e as bandas específicas foram visualizadas usando um kit ECL (cat. n. P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) e fotografadas usando um sistema UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). A análise densitométrica relativa das bandas WB foi realizada usando o software ImageJ 1.4 (NIH) e os níveis de expressão da proteína foram normalizados contra ‑actina.

Design experimental

Alterações de expressão e localização celular de ASK1 após HSA. Um total de 36 ratos foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos (n=6/grupo) da seguinte forma: i) operação simulada (sham), ii) 3 h pós-SAH, iii) 6 h pós-SAH, iv ) 12h pós‑HAS, v) 24h pós‑HAS e vi) 72h pós‑HAS. WB foi usado para avaliar mudanças nos níveis de expressão de proteínas de ASK1 e p-ASK1 endógenos. Um total de 4 ratos adicionais foram divididos em grupos sham (n=2) e SAH 24 h (n=2) e a coloração IF foi usada para avaliar a colocalização de ASK1.

Efeitos terapêuticos do inibidor de ASK1 NQDI-1 na função neurológica de curto e longo prazo após SAH. Um total de 30 ratos foram divididos em 5 grupos (n=6/grupo) da seguinte forma: i) Sham, ii) SAH mais veículo, iii) SAH mais 1.0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH mais 3.0 µg/kg NQDI‑1 e v) SAH mais 10,0 µg/kg NQDI‑1. Os escores modificados de Garcia e de equilíbrio de feixe foram usados ​​para avaliar a função neurológica de curto prazo 24 horas após a HSA. Com base na extensão da melhora neurológica de curto prazo, 3,0 µg/kg de NQDI‑1 foi avaliado como o grupo de dose mais apropriado e essa dose de NQDI‑1 foi usada em experimentos subsequentes. Um total de 30 ratos foram divididos em 3 grupos (n=10) da seguinte forma: i) Sham, ii) SAH mais veículo e iii) SAH mais NQDI‑1. Um experimento rotarod foi usado para avaliar a função neurológica de longo prazo nos dias 7, 14 e 21 após a SAH, e o teste do labirinto aquático de Morris foi realizado na semana 4 após a SAH para avaliar a função neurológica de longo prazo.

Efeitos terapêuticos do inibidor de ASK1 NQDI-1 no estresse oxidativo e apoptose. Um total de 12 ratos foram divididos em 3 grupos (n=4/grupo) da seguinte forma: i) Sham, ii) SAH mais veículo e iii) SAH mais NQDI‑1. A coloração (THE) foi realizada para avaliar o estresse oxidativo e a coloração TUNEL foi usada para avaliar a apoptose neuronal 24 horas após a HSA.

Papel da via de sinalização ASK1/p38 e JNK nos efeitos terapêuticos do NQDI‑1. Um total de 48 ratos foram divididos em 8 grupos (n=6/grupo) da seguinte forma: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH mais veículo, iv) SAH mais NQDI‑1, v) SAH mais mexido (Scr) (si)RNA de interferência curta, vi) SAH mais ASK1 siRNA, vii) SAH mais BMS-582949 e viii) SAH mais grupos SP600125. O siRNA ASK1, o inibidor p38 BMS-582949 e o inibidor JNK SP600125 foram injetados para avaliar se ASK1, p38 e JNK estavam envolvidos nos efeitos neuroprotetores do NQDI-1.

Análise estatística. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão e os dados experimentais de WB foram obtidos em 6 réplicas independentes, enquanto a coloração DHE e a coloração TUNEL foram realizadas como 4 réplicas independentes. Os dados foram analisados ​​usando SPSS versão 17 (SPSS, Inc.). Os dados do teste do labirinto aquático de Morris foram avaliados usando ANOVA mista/ANOVA de medidas repetidas de duas vias, seguido pelo teste post hoc LSD. Os dados dos experimentos restantes foram testados para distribuição normal usando o teste de distribuição normal de Shapiro-Wilk seguido por ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla post hoc de Tukey. Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultados

Mortalidade e gravidade da HAS. Um total de 191 ratos SD foram usados ​​no presente estudo, dos quais 8 ratos foram excluídos devido apenas a HSA leve (pontuação de graduação de SAH menor ou igual a 8). Dos ratos SD usados ​​nos experimentos, 34 ratos estavam no grupo sham e 149 ratos foram submetidos à modelagem de SAH. Nenhum rato do grupo simulado morreu; no entanto, 23 ratos morreram após modelagem de SAH (taxa de mortalidade de 15,4 por cento) (Tabelas SI‑V). Em comparação com o grupo sham, os coágulos no espaço subaracnóideo foram localizados principalmente perto do anel de Willis e em ambos os lados da artéria basilar seguindo a modelagem da SAH (Fig. 1A). A pontuação de classificação da SAH 24 h após a modelagem da SAH não demonstrou nenhuma diferença significativa na gravidade da hemorragia entre todos os grupos não simulados e uma diferença significativa entre os grupos simulados e todos os não simulados (Fig. 1B).

Alterações na expressão de proteínas e localização celular de ASK1 após HAS. Os níveis de expressão da proteína de ASK1 aumentaram e atingiram um pico em 24 h no cérebro após a SAH (Fig. 1C e D). No entanto, a razão da expressão da proteína p‑ASK1/ASK1 não demonstrou diferença significativa (Fig. 1C e E). A localização celular de ASK1 com neurônios NeuN-positivos, microglia Iba-1-positiva e astrócitos GFAP-positivos foi demonstrada tanto no grupo simulado quanto no grupo SAH 24 h (Fig. 1F-H).

O inibidor ASK1 NQDI-1 melhora as funções neurológicas de curto prazo 24 h após a HSA. NQDI‑1 (1, 3 e 10 µg/kg) foi injetado por via intracerebroventricular 1 h após a HSA. Ratos submetidos à modelagem de SAH tiveram escores modificados de Garcia e equilíbrio de trave significativamente mais baixos 24 h após a modelagem de SAH; entretanto, todas as três doses de NQDI‑1 levaram a uma melhora parcial significativa na função neurológica de curto prazo (Fig. 2A e B). Os escores de Garcia modificados foram significativamente maiores no grupo SAH mais NQDI-1 (3,0 µg/kg) em comparação com o grupo SAH mais NQDI-1 (1,0 µg/kg); no entanto, nenhuma diferença estatisticamente significativa foi demonstrada em comparação com o grupo SAH mais NQDI‑1 (10,0 µg/kg) (Fig. 2A e B), o que sugeriu que aumentar ainda mais a concentração de NQDI‑1 fez não provocar melhora adicional na função neurológica de curto prazo após SAH. Portanto, NQDI‑1 (3,0 µg/kg) foi considerada a concentração ótima efetiva e foi usada em experimentos subsequentes.

O inibidor de ASK1 NQDI-1 melhora as funções neurológicas de longo prazo após SAH. Usando velocidades iniciais de 5 ou 10 rpm para o teste Rotarod, a latência de queda foi significativamente diminuída no grupo SAH mais veículo em comparação com o grupo sham, enquanto a latência de queda foi significativamente prolongada após a injeção intracerebroventricular de NQDI-1 em comparação com o grupo SAH mais veículo grupo (Fig. 2C e D). Além disso, durante os dias 1-5 da fase de treinamento do teste do labirinto aquático de Morris na semana 4 pós-SAH, o grupo SAH mais veículo demonstrou latência de escape e distância de natação significativamente mais longa em comparação com o grupo simulado, enquanto o tratamento com NQDI-1 demonstrou uma diminuição significativa em comparação com o grupo SAH mais veículo (Fig. 2E‑G). Na fase de teste com a retirada da plataforma circular subaquática, não foram observadas diferenças significativas na velocidade de nado entre os três grupos (Fig. 2H). A duração do quadrante da sonda foi significativamente menor no grupo SAH mais veículo em comparação com o grupo sham e o tratamento com NQDI‑1 prolongou significativamente o tempo de exploração em comparação com o grupo SAH mais veículo (Fig. 2I).

O inibidor de ASK1 NQDI-1 diminui o estresse oxidativo e a apoptose neuronal 24 h pós-SAH. O nível de estresse oxidativo foi medido usando coloração DHE e a proporção de neurônios apoptóticos foi avaliada usando a porcentagem de neurônios TUNEL-positivos 24h após a HSA. A porcentagem de células DHE-positivas foi significativamente maior no grupo SAH mais veículo em comparação com o grupo simulado e o tratamento com NQDI-1 diminuiu significativamente isso em comparação com o grupo SAH mais veículo (Fig. 3A e). A porcentagem de neurônios positivos para TUNEL foi significativamente maior no grupo SAH mais veículo em comparação com o grupo sham. No entanto, a porcentagem de neurônios TUNEL-positivos diminuiu significativamente após o tratamento com NQDI-1 em comparação com o grupo SAH mais veículo (Fig. 3B e D).

ASK1 siRNA, BMS-582949 e SP600125 melhoram as funções neurológicas de curto prazo 24 horas após a SAH. Em comparação com o grupo SAH mais Scr siRNA ou grupo SAH mais veículo, a administração de ASK1 siRNA, BMS-582949 ou SP600125 demonstrou melhora significativa no Garcia modificado e na pontuação de equilíbrio de feixe (Fig. 4A e B).

O NQDI-1 atenua o estresse oxidativo e a apoptose após HSA por meio da diminuição da fosforilação de ASK1, p38 e JNK. Os níveis de expressão de proteínas de ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE, HO‑1, Bax e Bcl‑2 foram significativamente maiores após HSA em comparação com o grupo sham; no entanto, a proporção de p‑ASK1/ASK1 não foi significativamente diferente (Fig. 5A‑M). A injeção de veículo ou Scr siRNA não induziu diferenças significativas nos níveis de expressão da proteína em comparação com o grupo SAH. Em comparação com o grupo SAH mais veículo, o tratamento com NQDI‑1 causou uma diminuição significativa nos níveis de expressão de proteína de p‑ASK1/ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE e Bax, enquanto os níveis de expressão de proteína de HO ‑1 e Bcl‑2 aumentaram significativamente. Em comparação com o grupo SAH mais Scr siRNA, os níveis de expressão proteica de ASK1 diminuíram significativamente após a injeção de ASK1 siRNA. O tratamento com ASK1 siRNA também resultou em uma diminuição significativa nos níveis de expressão de proteínas de p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE e Bax e um aumento significativo na expressão de HO‑1 e Bcl‑2 em comparação com o SAH mais Scr siRNA grupo.

O inibidor de p38 BMS‑582949 reduz os níveis de expressão da proteína p‑p38, mas não afeta os níveis de expressão da proteína p‑ASK1, ASK1 ou p‑JNK. O tratamento com o inibidor de p38 BMS‑582949 demonstrou uma diminuição significativa nos níveis de expressão de proteínas de p‑p38, 4‑HNE e Bax e também aumentou significativamente a expressão de proteínas de HO‑1 e Bcl‑2 em comparação com o grupo SAH mais veículo; no entanto, os níveis de expressão de proteínas de ASK1, p‑ASK1/ASK1 e p‑JNK não demonstraram diferenças significativas (Fig. 6A‑M). O inibidor de JNK SP600125 diminui o nível de expressão da proteína p‑JNK, mas não afeta os níveis de expressão da proteína p‑ASK1, ASK1 ou p‑p38. O tratamento com o inibidor de JNK SP600125 causou uma diminuição significativa nos níveis de expressão de proteína de p‑JNK, 4‑HNE e Bax e um aumento significativo nos níveis de expressão de proteína HO‑1 e Bcl‑2 em comparação com o grupo SAH mais veículo; no entanto, os níveis de expressão de proteínas de ASK1, p‑ASK1/ASK1 e p‑p38 não foram significativamente alterados (Fig. 7A‑M).

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