Vias dependentes e independentes do receptor de hidrocarboneto aril mediam os efeitos antienvelhecimento da curcumina Parte 2

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2.2.6. Cultivo de EC Humano Primário

A EC primária humana (Lonza, Colônia, Alemanha) foi cultivada em meio basal endotelial completo (EBM) (Lonza, Colônia, Alemanha) suplementado com 1 ug/mL de hidrocortisona, 12 ug/mL de extrato de cérebro bovino, 50ug/ ml de gentamicina, 10ng/ml de fator de crescimento epidérmico humano e 10 por cento (o/v) de soro fetal de vitela a 37 graus e 5 por cento de CO, até a terceira passagem. Após o descolamento com 0,05 por cento (o/o) de Tripsina/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha), as células foram cultivadas em placas de cultura de 6 cm ou placas de cultura de 6 poços por pelo menos 18 h antes da transfecção ou tratamento.

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2.2.7. Transfecção Transitória de EC

As células foram transfectadas como descrito anteriormente [65]. Em resumo, o EC foi transfectado usando SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A superexpressão ou knockdown de AhR foi alcançada após 24 ou 48 h, respectivamente. A eficiência de transfecção após superexpressão foi de aproximadamente 40 por cento.

2.2.8. Ensaio de Ferimento de Arranhões de EC

Para investigação da capacidade migratória do EC, foram realizados ensaios de feridas por arranhões conforme descrito anteriormente [66]. Em detalhe, as feridas foram colocadas em uma monocamada de células com um raspador de células ao longo de uma linha de rastreamento. Após a lesão, as células não aderidas foram removidas por lavagem suave.extrato de salsa cistacheO tratamento com curcumina foi realizado logo após a cicatrização da ferida. A curcumina foi dissolvida em DMSO e usada na concentração final de 7,5 uM. A migração de EC foi quantificada pela coloração das células com 5 ug/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)(Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) em PBS por 5 min após as células terem sido fixadas com 4 por cento (v/v) de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente. As imagens foram tiradas usando um microscópio fluorescente Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha)) usando uma 200-ampliação. As células que migraram para a ferida a partir da linha de rastreamento foram contadas automaticamente usando a função de análise de partículas de Image]1.52a]67I após a separação dos núcleos sobrepostos.

Cistanche pode anti-envelhecimento

2.2.9. Imunocoloração de EC

EC foi fixado com 4 por cento (o/v) de paraformaldeído por 15 min à temperatura ambiente. Após permeabilização e bloqueio em 0,3 por cento (o/o)Triton-X 100 e 3 por cento (o/u) de soro de cabra normal em PBS, as células foram incubadas com um anticorpo de coelho contra AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou Nrf2 (clone D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Alemanha) diluído em 1 por cento (o/v) de soro de cabra normal em PBS durante a noite a 4 C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e incubados com uma IgG anti-coelho de cabra acoplada Alexa 594-(1:500, Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) por 1 h em temperatura ambiente.haste de cistachePara coloração de actina, as células foram incubadas com Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) por 20 min em temperatura ambiente. Os núcleos foram contracorados com 0,5 µg/mL de DAPI em PBS por 5 min à temperatura ambiente e as células foram montadas com ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha). As imagens fluorescentes foram obtidas usando um microscópio fluorescente Zeiss AxioVision Observer D1, com ampliação de 400x ou 200x.

2.2.10. qPCR em células

O RNA celular total foi isolado combinando lise em TRIzolTM com processamento downstream usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Alemanha)) de acordo com as instruções do fabricante. A síntese de cDNA foi realizada usando o QuantiTect9 Reverse Transcription Kit （Qiagen （Hilden, Alemanha））com 1 ug de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de transcrição relativos foram determinados por PCR usando o 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix e um termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden, Alemanha)). O transcrito para a proteína ribossomal L32 (rpl32) foi usado como referência, e a expressão relativa foi calculada pelo método AC [68]. Foram utilizados os seguintes pares de primers abrangendo íntrons: capital (número de acesso do gene NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3'; ahr(gene número de acesso NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(número de acesso do gene NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(número de acesso do gene NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGAC{{ 41}}'.

2.3. Camundongos

2.3.1. Linhagens e Reprodução de Ratos

Mulher 8-12-de uma semana ("jovem") e 18-de um mês ("velho") B6 deficiente em AHR.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; referido camundongos AHR-KO) foram criados como heterozigotos nas instalações de animais da IUF. Os irmãos de ninhada do tipo selvagem foram usados ​​para controle. Os camundongos foram criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos em um ciclo claro-escuro de 12/12h e receberam ração padrão (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Alemanha) ad libitum. 2.3.2.qPCR em camundongos

O RNA total foi isolado de tecidos de órgãos de três camundongos WT e três deficientes em AHR com TriZol[. Em seguida, 400 ng de RNA foram transcritos reversamente usando a transcriptase reversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA) e iniciadores hexâmeros aleatórios. Os níveis de expressão gênica foram medidos em duplicata para cada tecido de camundongo em um Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemanha), em 15 μL de volume final, contendo 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Alemanha), 1 uM de cada primer ,1,5 μL de cDNA e água livre de RNase. As eficiências do primer estavam entre 90 por cento e 146 por cento. Consulte a Tabela S2 para sequências e eficiências do primer. Os níveis de expressão foram calibrados para a expressão de RPS6 como um gene de manutenção na mesma amostra usando o {{ 14}}método CT [69].

2.4.Análises In Silico

Modelagem de Homologia do CeAhR LBD

O modelo estrutural de C. elegans AhR LBD (resíduos 267-372) foi gerado por modelagem de homologia. As estruturas de raios-X dos domínios PASB de membros homólogos da família bHLH-PAS que compartilham a identidade de sequência mais alta (cerca de 20%) com o CeAhR PASB foram usadas como modelos: os ciclos de saída locomotores circadianos kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), o proteína contendo domínio PAS neuronal 3(NPAS3, PDB:5SY7), os fatores induzíveis por hipóxia 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) e lo(HIFlo, PDB:4H6J). O modelo foi obtido com MODELLER[70-72].Cistanche tubulosa benefícios e efeitos colateraisO modelo ótimo foi selecionado dentre os 10 gerados, com base no melhor DOPE SCORE [73]. A qualidade dos modelos foi avaliada usando PROCHECK [74]. Estruturas secundárias foram atribuídas por DSSPcont [75]. A cavidade de ligação dentro dos LBDs modelados foi caracterizada usando o servidor CASTp[76]. A visualização dos modelos foi realizada usando PYMOL[77].

2.5. Análise Estatística

Salvo indicação em contrário, as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism (Versão 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EUA). Para ensaios de expectativa de vida/saúde, a análise estatística foi feita usando OASIS[53]. A análise estatística dos dados do microarray foi realizada em R (R Foundation (Viena, Áustria)). Boxplots foram criados no GraphPad Prism (Versão 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EUA) e mostram a mediana (linha),25-75º percentil (caixa) e 10-90º percentil (bigodes).

3. Resultados

3.1. A curcumina promove a extensão da saúde de maneira independente e dependente de AhR

A perda de ahr-1 promove a saúde e a expectativa de vida de C.elegans em condições basais[14] e afeta negativamente características relacionadas à idade em resposta a moduladores de AhR de mamíferos, como benzo[a]pireno (BaP), UVB luz e microbiota [25]. Polifenóis dietéticos, como a curcumina, formam um importante grupo de moduladores de AhR de mamíferos com efeitos pró-longevidade em C. elegans [78,79] e, portanto, investigamos o efeito de prolongamento da vida útil da curcumina para seus ahr-1 dependência. A curcumina estendeu de forma reprodutível e significativa a expectativa de vida e saúde de C. elegans de maneira ahr{12}}dependente (Figura 1A,B). Anteriormente, mostramos que a perda de ahr{14}} também estende a vida útil nos modelos de doença de Huntington e doença de Parkinson, com superexpressão muscular de poliglutamina propensa à agregação (poliQ40) e -sinucleína ( -syn), respectivamente, enquanto em ao mesmo tempo aumentando seu conteúdo de agregados de proteína [25]. Curiosamente, o tratamento com curcumina aumentou o número de agregados polyQ40 e -syn na mesma medida que ahr{23}} perda de função (Figura 1C). A curcumina também promoveu a expectativa de vida e a capacidade de locomoção nesses modelos de doença (Figura 1DE), mas os efeitos da perda de ahr-1 e da suplementação de curcumina foram aditivos no PolyQbackground (Figura 1D), revelando funções protetoras independentes da AHR-1- de curcumina pelo menos neste contexto comprometido.

Figura 1. A curcumina promove a saúde de maneira-1-dependente e independente da AHR. Curvas de vida útil (A) e de saúde (B) de nematóides wt e ahr-1 tratados com DMSO ou curcumina. As curvas de sobrevivência mostram dados agrupados de 290-300 vermes/condição em 5 experimentos. Teste estatístico: teste de log-rank, # significância vs. DMSO, * significância vs. peso, valor de Bonferronip<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 medeia os efeitos antienvelhecimento da curcumina e ahr-1 esgotamento

Em busca de possíveis efetores dependentes de ahr-1-da curcumina, adotamos abordagens direcionadas e imparciais. Examinamos a expressão de genes alvo AhR de mamíferos clássicos e focamos nos genes Cyp, uma vez que a curcumina altera a expressão de CyplA1 e CyplB1 em células de mamíferos [80,81]. No entanto, a quantificação de 47 cyps diferentes em C.elegans por PCR semiquantitativo em tempo real (qPCR) revelou que apenas cyp-13B1 foi significativamente regulado positivamente por depleção de ahr-1 ou por curcumina de forma ahr{12}}dependente(Figura S1A-B), enquanto os outros três cyps(ie,cyp-13A5, cyp-13A8 e cyp-42A1) foram aumentado pela curcumina apenas na ausência de ahr-1(Figura S1). Esses dados, juntamente com outros trabalhos [25,82], sugerem que os cips provavelmente não são os principais alvos do CeAhR. Isso também é apoiado por nossa análise transcriptômica em mutantes do tipo selvagem e ahr-1. De fato, consistente com o papel de AHR-1 na determinação neuronal [37,38,40,41], as mudanças de expressão gênica entre mutantes do tipo selvagem e ahr-1 mostraram enriquecimento em processos ligados ao desenvolvimento neuronal e diferenciação e sem grandes alterações nos genes de desintoxicação clássicos (Figura 2A).qAnálise de PCR de alguns dos genes mais regulados para cima e para baixo entre ahr-1(jul45) e tipo selvagem (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3) principalmente confirmaram sua dependência ahr{60}}em condições basais (Figura 2B), mas nem UVB [25] nem curcumina (Figura 2C) afetaram significativamente a expressão desses genes. Nós nos perguntamos se as mudanças de expressão nesses genes são conservadas evolutivamente e avaliamos sua expressão em diferentes tecidos (ou seja, cérebro, fígado, intestino e sangue) de 8- e 18-tipo selvagem e camundongos AhR KO. Alguns genes mostraram uma tendência para uma expressão aumentada em camundongos jovens (atf-2 homólogos) ou velhos (lpr-4/5 homólogos) de uma maneira específica do tecido, mas nem um padrão óbvio nem alterações conservadas foram observado (Figura S2). Esses resultados refletem possíveis diferenças espécie-específicas ou atividade transcricional de AhR dependente de tecido em mamíferos negligenciada pela análise transcriptômica de animal inteiro em C. elegans. Um exame minucioso dos genes mais diferencialmente expressos entre C. elegans tipo selvagem e ahr-1(jul45) revelou que a expressão de muitos desses genes é afetada em C.elegans durante o envelhecimento e por moduladores de AhR de mamíferos dietéticos ( por exemplo, quercetina e resveratrol)[25], sugerindo assim um papel para AHR-1 na expressão gênica modulada por polifenol. De acordo com esse cenário, os dados do microarray mostraram que a maioria dos genes expressos diferencialmente no tratamento com curcumina foram de fato regulados de maneira ahr{82}}dependente (Figura 2D; Tabela 1).extrato de cistanche tubulosaDos 47 genes alterados pela curcumina no tipo selvagem (43 up-regulated e 4 down-regulated), apenas 5 também foram induzidos pela curcumina em ahr-1(ju145). Entre os genes regulados pela curcumina de maneira AHR-1-dependente estavam as enzimas de fase Il e curiosamente, algumas delas (ugt-9 e ugt-29), foram reguladas na mesma direção pela curcumina ou por perda de ahr-1 (Tabela 1). Assim, verificamos sua expressão e de ugts(ugt-45 e ugt-57) adicionais que foram diferencialmente expressas ao aplicar uma análise estatística menos restritiva não corrigida para comparações múltiplas. Dos genes examinados, ugt-45 foi aumentado em ahr-1(ijul45) e pelo tratamento com curcumina (Figura 3A,B). Também observamos mudanças na expressão de alguns genes de desintoxicação entre tipo selvagem e camundongos AhR KO de uma maneira dependente do tecido. A expressão diferencial desses genes foi maior no cérebro, onde Ugt2a3 (ugt-9 e ugt-29 em C.elegans) foi down- e Hpgds (gst-4 em C. elegans) foi regulado positivamente (Figura S3A). Não houve alteração na expressão de nenhum dos genes testados nas amostras de fígado de camundongos (Figura S3B). De acordo com os dados de C,elegans, o homólogo murino ugt-45 Ugt3a2 mostrou uma tendência à superexpressão no intestinos de camundongos Ahr KO (Figura S3C). Notavelmente, ugt-45 RNAi impediu os efeitos benéficos sobre a vida e a saúde promovidos pela curcumina (Figura 3C, D) ou depleção ahr-1 (Figura 3E, F) indicando que as duas intervenções podem contar com sinalização a jusante modulada conjuntamente para eliciar sua atividade antienvelhecimento.

Figura 2. Os genes regulados diferencialmente pela curcumina são regulados principalmente de maneira ahr-1-dependente. (B, C) A expressão dos genes mais fortes regulados para baixo e para cima entre wt e ahr-1 [25]foi avaliada por qPCR em wt vs.ahr-1(B) e DMSO-vs . nematóides tratados com curcumina (C). Boxplots mostram dados de 3 experimentos. A expressão é mostrada em relação ao peso tratado com DMSO (linha tracejada). Teste estatístico:1-way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Tukey,*p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

A Figura 3.ugt-45 é necessária para a extensão da vida útil de mutantes de curcumina e ahr-1. (A, B)A expressão gênica foi avaliada por qPCR em wt vs.ahr-1(A) e DMSO- vs. nematóides wt tratados com curcumina (B). Boxplots mostram dados de 3 experimentos. A expressão é mostrada em relação ao peso tratado com DMSO (indicado como uma linha tracejada). Teste estatístico: 2-way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Sidak, *p-value<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 e curcumina protegem de forma independente contra o estresse oxidativo

As propriedades benéficas dos polifenóis são frequentemente atribuídas à sua capacidade de proteger contra espécies reativas de oxigênio (ROS)|83,84]. Como o AhR está envolvido em processos mediados pelo estresse oxidativo [85-87], nos perguntamos se a curcumina pode afetar a fisiologia dos animais por meio de respostas antioxidantes reguladas pelo AhR. Observamos que os mutantes ahr-1 produzem mais mitocondrial(mt)ROS e têm um potencial de membrana mitocondrial reduzido (Figura 4A,B), dois parâmetros correlacionados com a longevidade [88,89]. Embora consistente com o paradigma mitohormese ahr{10}}(jul45) produza um pouco mais de mtROS e viva mais, esses animais foram mais sensíveis ao estresse oxidativo do que o tipo selvagem. Especificamente, os efeitos prejudiciais induzidos por juglona e H2O2 no salto, motilidade e sobrevivência dos animais foram significativamente mais fortes em ahr-1(jul45) em comparação com o tipo selvagem (Figura 4C-F). Esses dados sugerem que a depleção de AHR-1 tem efeitos motores benéficos em condições basais, enquanto sua presença é necessária para a proteção contra o estresse oxidativo, desvinculando dois parâmetros relacionados à idade frequentemente correlacionados, a saber, a expectativa de vida e a resistência ao estresse. Em vez disso, a curcumina melhorou significativamente a resistência a H, O e juglona em mutantes de tipo selvagem e ahr-1 (Figura 4E,F), sugerindo que a curcumina provoca uma resposta antioxidante independente de ahr-1-. Consistente com a regulação desacoplada da expectativa de vida e resistência ao estresse oxidativo, o silenciamento ugt-45 não afetou a sensibilidade ao estresse oxidativo tanto para mutantes ahr-1 quanto para animais tratados com curcumina (Figura 4G).comentários de cistanche tubulosaAssim, a curcumina tem efeitos pró-longevidade via ahr-1 e ugt-45, mas protege contra o estresse oxidativo por meio de mecanismos independentes de ahr-1-.

3.4. Nrf2/SKN-1 medeia os efeitos independentes de AhR da curcumina

Para avaliar ainda mais o crosstalk AhR-curcumina em recursos adicionais relacionados à idade, medimos a capacidade migratória na EC primária humana - uma marca registrada da funcionalidade do vaso, que diminui com a idade [90] e é reduzida pela ativação do AhR [14]. Em consonância com a atividade antienvelhecimento da supressão de ahr-1 e da curcumina, a superexpressão de AhR foi inibida significativamente, enquanto a curcumina aumentou a capacidade migratória da EC humana primária (Figura 5A). É importante notar que a indução da capacidade migratória pela curcumina foi comparável em células transfectadas com vetor vazio ou expressão de AhR (Figura 5A). No entanto, a migração de células tratadas com curcumina foi significativamente reduzida pela superexpressão de AhR: a curcumina induz em células transfectadas com vetor vazio até 60 células migradas por campo de alta potência, enquanto em células que superexpressam AhR apenas até 25 células por campo de alta potência (Figura 5A). Esses dados sugerem que o efeito pró-migratório da curcumina é modulado por mecanismos independentes de AhR, mas possivelmente também por uma redução na atividade de AhR. Em seguida, determinamos a distribuição de AhR intracelular e a expressão de cVplal em EC humano tratado com curcumina, a curcumina não afetou a translocação nuclear de AhR (Figura 5B) ou a expressão de cyplal (Figura 5C). Em busca de vias moduladas pela curcumina de maneira independente de AhR, voltamos aos perfis transcriptômicos de nematóides para encontrar fatores de transcrição que regulam genes significativamente modulados pela perda de ahr-1 ou pelo tratamento com curcumina em animais do tipo selvagem (Tabela 1 ). Esta pesquisa in silico identificou o fator de transcrição redox SKN-1, o ortólogo do Nrf2 humano (fator nuclear eritróide 2-fator 2 relacionado), cuja ativação pela curcumina [91] é frequentemente relatada como um possível mediador de sua atividade antioxidante [92,93]. Assim, o protótipo C.elegans Nrf2/SKN-1-gene dependente, gst-4, é superexpresso no mutante alhr-1 [25] e induzido pela curcumina no tipo selvagem e ainda mais em mutantes ahr{40}} (Figura 5D). Além disso, a curcumina aumentou a estabilização e a translocação nuclear de Nrf2 em EC humano primário (Figura 5E) e induziu a expressão de superóxido dismutase de manganês (Sod2) - um gene alvo clássico de Nrf2 - nas células transfectadas com um vetor vazio ou em células nas quais AhR é silenciado por shRNA (Figura 5F). A falta de indução de Sod2 por AhR shRNA em EC pode ser devido a uma redução parcial (50 por cento) na expressão (Figura S3D), que pode não ser suficiente para desencadear a ativação de Nrf2 ou de fator de transcrição (TF) adicional, que , em C.elegans, pode concorrer para a indução do gst-4 [94]após a depleção completa de AhR. Curiosamente, Hpgds, um homólogo de C.elegans gst-4, foi significativamente aumentado no cérebro de camundongos AhR KO (Figura S3A), mas não é um alvo de Nrf2. Outra evidência para uma possível sinalização independente de Nrf2/SKN-1 ativada por depleção de ahr-1 é que a ativação de gst-4 pela curcumina é completamente suprimida pela pele-7 RNAi no C.elegans tipo selvagem, enquanto os mutantes ahr-1 ainda induzem gst-4 apesar da depleção da pele-1 (Figura 5G, H). No entanto, o RNAi da pele-1 reduziu a resistência ao estresse oxidativo tanto no tipo selvagem quanto no ahr-1(ju145)(Figura 5I). Inesperadamente, o silenciamento da pele -1 não afetou a resistência juglone de animais tratados com curcumina (Figura 5I). Nossos dados revelam um cenário complexo em que a curcumina promove diferentes recursos antienvelhecimento com base na sinalização dependente ou independente de AhR, mas Nrf2/SKN-1-dependente (e adicional).

Figura 4. AHR-1 e a curcumina protegem independentemente contra o estresse oxidativo. (A) Imagens representativas (esquerda) e quantificação de intensidade DSRed (direita) em nematódeos wt ou ahr-1 corados com MitoSOX. Boxplots mostram dados agrupados de 129-135 worms/condições em 3 experimentos. (B) O potencial de membrana das mitocôndrias foi avaliado por coloração TRME em nematóides de idades indicadas. São apresentadas imagens representativas (esquerda) e a quantificação da fluorescência TMRE (direita). Boxplots mostram dados agrupados de 3 experimentos.(C,D) Atividade de bombeamento faríngeo (C) e motilidade (D) de mutantes wt e ahr-1 após tratamento com H2O2. Boxplots mostram dados agrupados de 39-54(C) ou 35-36 worms/condição (D) em 3-4experimentos.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Figura 5. A curcumina ativa Nrf2/SKN-1 independente do AhR.(A) Ensaio de ferida por arranhão em EC primário humano tratado com curcumina (cur) ou DMSO transfectado com um vetor vazio (EV) ou um vetor de expressão para AHR humano. Painel superior: fotos representativas; a linha tracejada representa o início da migração. Barra de escala: 100 um. Painel inferior: quantificação; boxplots mostram dados de 4-6experimentos.Teste estatístico:1-way ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Curcumina e pró-oxidantes exibem efeitos opostos na atividade de AHR-1

Consistente com o efeito antienvelhecimento da redução da expressão/atividade de AhRex, nossos dados sugerem que a curcumina pode prolongar a vida útil de C.elegans suprimindo as vias reguladas de AHR-1-via redução da expressão/atividade de AHR-1 ou agindo em vias de sinalização comuns a jusante. Assim, tentamos quantificar a atividade de AHR-1 em C.elegans, mas várias tentativas de avaliar a expressão de AHR-1 e localização subcelular usando anticorpos (contra AhR de mamífero ou anticorpos personalizados contra CeAhR) ou marcadores fluorescentes repórteres (OP562, UL1709, ZG93) não deram provas significativas. Considerando que AHR-1 se liga a XREs in vitro [35], pensamos em usar a expressão gênica orientada por XRE como uma leitura para a atividade de AHR-1. Assim, nos voltamos para células Cos7 derivadas de macacos, que não expressam AhR endógeno e, portanto, não exibem atividade de AhR endógeno [95,96] e podem ser exploradas para monitorar a indução de Luciferase orientada por XRE como uma leitura para AHR-1 atividade (Larigot et al.; apresentado junto com este estudo). Quando as células Cos7 foram co-transfectadas com vetores expressando C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 e um promotor contendo XRE acoplado a luciferase do gene CYPIA1 humano [64] AHR{ {27}} mostrou baixa atividade em condições basais (tratadas com veículo). É importante notar que o tratamento com curcumina ou outros nutracêuticos que promovem o envelhecimento saudável em C.elegans, como luteína [97] e resveratrol [98,99], suprimiu significativamente a atividade AHR-1 (Figura 6A-C). Em vez disso, BaP e leflunomida, conhecidos ativadores de AhR em mamíferos, não afetaram a atividade de AHR-1 (Figura 6A,B) nas concentrações que usamos. Notavelmente, a atividade AHR-1 foi abolida em células Cos7 transfectadas com um vetor que expressa o alelo ahr-1(jul45) em vez do alelo de tipo selvagem (Figura 6A-C), sugerindo que jul45 é um verdadeiro alelo de perda de função e que a intensidade de luciferase medida é devido a AHR funcional-1.

Em seguida, procuramos investigar se a curcumina reduz a atividade de AHR-1 por ligação direta ou modulação indireta. Até o momento, nenhum ligante de C.elegans AHR-1 foi identificado e, como não há informações disponíveis sobre seu LBD, realizamos uma análise in silico para caracterizá-lo. As duas isoformas AHR-1, la e 1b, foram alinhadas e, embora diferentes em comprimento, sua sequência de domínio PASB é idêntica. Essa sequência foi então alinhada ao domínio PASB de Drosophila melanogaster e aos de dois AhRs de vertebrados para os quais modelos estruturais foram gerados anteriormente, ou seja, camundongo (Mus musculus)[100] e peixe-zebra (Danio rerio)[101](Figura 6D). O alinhamento mostrou diferenças claras entre as espécies com a principal peculiaridade de invertebrados apresentarem deleções de sequência na região mais variável no domínio PAS, correspondendo à região flexível, incluindo o feixe helicoidal (C , D , E hélices) e as alças curtas conectando esses elementos (Figura 6D,E). Essas deleções podem reduzir o espaço disponível na cavidade de ligação desses AhRs. Em seguida, geramos um modelo 3D do AHR-1 PASB por modelagem de homologia. Este modelo apresenta a típica dobra PAS, mas com uma hélice Do mais curta em comparação com outros AhRs. No entanto, a cavidade interna apresenta algumas particularidades; contém mais resíduos hidrofóbicos e é truncado ao meio por algumas cadeias laterais internas. Em particular, H365 e H274 são faceados e podem formar uma ligação de hidrogênio no meio da cavidade; além disso, as cadeias laterais Y332, L363 e L302 podem obstruir a cavidade, reduzindo o espaço interno disponível para os ligantes (Figura 6E). Esta cavidade pequena e truncada provavelmente não permite a ligação de grandes ligantes (por exemplo, TCDD ou curcumina). Semelhante ao modelo estrutural AHR-1, um modelo do peixe-zebra zfAhRla mostrou que a cavidade LBD é truncada em comparação com os parálogos de ligação TCDD zfAhR1b e zfAhR2 [101]. Ligantes pequenos e flexíveis, como leflunomida, ligam e ativam o zfAhRla, mas a concentração de leflunomida que testamos não ativou AHR-1 em nosso sistema de células Cos7 (Figura 6B). Nós então nos perguntamos se as mutações nos aminoácidos responsáveis ​​pela pequena cavidade do LBD poderiam permitir que os ligantes clássicos ativassem o CeAhR. O resíduo CeAhR L363 (Figura 6D) corresponde a A375 em mAhRb-I e V375 em Madrid, e este resíduo tem um grande impacto na ligação do ligante [102]. Da mesma forma, T386 de zfAhRla (Figura 6D), correspondendo a A375 em mAhRb-1 e A386 em zfAhR1b e zfAhR2, contribui para a falta de ligação de TCDD de zfAhRla e, quando mutado para alanina, restaura a sensibilidade de TCDD quando Y296H também é introduzido [101]. O aminoácido Y296 já é uma histidina em C.elegans(H274). Assim, mutamos apenas a leucina na posição L363 no vetor CeAhR para uma alanina (L363A) (Figura 6D,E indicada por uma seta). Além disso, mutamos a histidina próxima na posição H365 para glutamina (H365Q), que é Q377 em camundongos (Figura 6D, E indicado por uma seta), uma vez que provavelmente forma uma ligação de hidrogênio com H274 e pode contribuir para a pequena cavidade de AHR{ {49}} (Figura 6E). Em seguida, testamos se ligantes de AhR de mamíferos afetam a atividade de AHR-1 quando L363 e H365 sofrem mutação. No entanto, essas alterações, em vez de restaurar a resposta aos ligantes xenobióticos como no peixe-zebra [101], aboliram até mesmo a atividade AHR{55}} basal, semelhante ao alelo ju145 (Figura 6F). Esses resultados mostram diferenças claras entre os LBDs de C.elegans e zebrafish, mas mostram que o LBD é fundamental para a atividade basal de AHR-1. Juntamente com estudos anteriores [35,38,82], nossos resultados sugerem que é improvável que AHR-1 esteja envolvido na resposta de transativação induzida por xenobióticos clássicos, o que, portanto, pode não ser relevante para ahr-1-regulado envelhecimento fisiológico. Em vez disso, compostos derivados de plantas podem exercer efeitos conservados, pelo menos em parte, através da supressão de vias moduladas AHR-1-. Nosso modelo 3D sugere que a curcumina não modula a atividade AHR-1 ligando seu LBD. Assim, a supressão da atividade de AHR-1 pela curcumina pode ser devido ao seu efeito antioxidante. Consistente com essa possibilidade, e com o aumento da sensibilidade dos mutantes C.elegans ahr-1 ao estresse oxidativo, descobrimos que a atividade AHR-1 é de fato aumentada por agentes indutores de ROS. Ou seja, as células Cos7 tratadas com a rotenona pró-oxidante exibiram atividade aumentada de AhR quando transfectadas com C.elegans ou AhR murino, mas não quando transfectadas com o alelo jul45 ou o alelo com mutações LBD (Figura 6G,H).

No geral, enquanto a ativação do CeAhR protege contra o estresse oxidativo no início da vida, sua expressão diminuída neutraliza o envelhecimento e medeia o efeito antienvelhecimento benéfico da curcumina (Figura 7). A curcumina pode, assim, ajudar a equilibrar a ativação do TF redox de maneira dependente do contexto e do tempo e favorecer a supressão de AhR diretamente por meio de seu efeito antioxidante e/ou pela ativação de Nrf2/SKN-1 (ou outro TF), que pode simultaneamente mediar a atividade antienvelhecimento da curcumina.

Figura 6. A curcumina e os pró-oxidantes têm efeitos opostos na atividade da AHR-1. (AC)Avaliação da atividade de AHR-1 após tratamento com os compostos indicados em células Cos7 transfectadas com AHR wt-1(wt) ou AHR-1 carregando a mutação pontual ju145 (ju145) e AHA{10}} bem como uma luciferase induzível por XRE. Boxplots mostram dados de 3-5experimentos.* valor-p<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Figura 7. Modelo proposto da via de sinalização AHR-1 na resposta de C.elegan a pró e antioxidantes. Em condições "normais" (painel do meio), AHR-1 é ativado por ROS intracelular. Isso leva à eliminação das chaperonas do AHR citosólico-1 e à subsequente translocação nuclear do AHR-1. No núcleo, o AHR-1 forma um heterodímero com o translocador nuclear do AHR (AHA{ {7}}) e se liga a XREs de genes-alvo, o que, por sua vez, leva à redução dos níveis de ROS intracelulares. Nestas condições, a perda da função ahr-1 leva a um aumento da vida útil. Na presença de antioxidantes (painel esquerdo), as concentrações intracelulares de ROS são baixas levando a AHR-1 residindo no citoplasma, ligado por seus cofatores. A inibição da atividade AHR{10}} basal leva a um aumento da vida útil. Na presença de pró-oxidantes (painel direito)AHR-1 é ativado por ROS excessivo, o que resulta em sua translocação nuclear, a formação de heterodímero AHR-1-AHA-1 e o início de transcrição do gene alvo. No ahr-1 KO, a diminuição da desintoxicação de ROS através de genes-alvo induzidos por AHR-1- leva a um acúmulo de ROS e torna o ahr-1 suscetível.

4. Discussão

AhR foi originalmente descoberto em mamíferos por sua atividade de resposta xenobiótica induzida pela ligação de tóxicos ambientais ou ligantes endógenos, mas também existem moduladores que não dependem da ligação de ligantes, mas são muito menos investigados. C.elegans representa um organismo modelo único para investigar as atividades de AhR independentemente de sua resposta xenobiótica clássica, uma vez que CeAhR não se liga a ligantes protótipos de AhR [35,39]. Usando este modelo, identificamos uma função conservada evolutivamente para AhR no processo de envelhecimento [14] e mostramos que alguns dos moduladores de AhR de mamíferos (ou seja, bactérias, Bal e UVB) afetam os parâmetros de envelhecimento através de AHR-1 em um maneira dependente do contexto [25]. Aqui, acompanhamos nossas descobertas anteriores com uma investigação mais mecanicista das características de envelhecimento reguladas por AhR em todas as espécies pela curcumina polifenol dietética. Nossas análises combinadas in vivo, in vitro e in silico revelaram um cenário novo e complexo: enquanto a curcumina promove recursos antienvelhecimento em nematóides e CE primária humana, pelo menos em parte, de maneira dependente de AhR, seus efeitos antioxidantes em ambas as espécies dependem em mecanismos independentes de AhR, mas principalmente dependentes de Nrf2/SKN{11}}.

Mostramos pela primeira vez que a curcumina retardou o envelhecimento fisiológico de C.elegans de maneira AHR-1-dependente. Em busca de possíveis efetores dependentes de ahr-1-da curcumina, empregamos abordagens direcionadas e imparciais e descobrimos que a maioria dos genes regulados diferencialmente após o tratamento com curcumina são regulados de maneira dependente de AHR-1-. Além disso, muitos desses genes exibiram um padrão de expressão semelhante em AHR-1-depletados e animais tratados com curcumina, sugerindo que a curcumina está promovendo a extensão da vida por meio da supressão da atividade de AHR-1. Surpreendentemente, nem a análise alvo nem a transcriptômica indicaram um papel importante para os genes alvos de AhR clássicos, como cups, que, em vez disso, foram encontrados em grande parte subexpressos em neurônios (Larigot et al.; apresentado junto com este estudo). Curiosamente, esses achados podem indicar que a transcriptômica de animais inteiros pode mascarar os efeitos neuronais específicos do AhR, neste caso específico através dos genes cps. Descobrimos que, entre os genes expressos diferencialmente, muitos pertencem a enzimas de desintoxicação de fase II, como o intestino-45, que foi aumentado pela depleção de ahr-1 (e no cérebro de camundongos AhR KO) e tratamento com curcumina para mediar sua extensão de vida. Em vez disso, o tratamento com curcumina e a depleção de ahr{12}} aumentaram a expressão de outra enzima de desintoxicação de fase II, GST-4, por meio de diferentes mecanismos: o primeiro contando com, enquanto o último é principalmente independente de, Nrf2/ SKN-1, um TF redox clássico que induz GST-4 sob estresse oxidativo em C.elegans [103]. Além disso, enquanto a curcumina induz respostas dependentes de Nrf2/SKN-1-em C.elegans (expressão de GST-4) e EC primária humana (expressão de Sod2 e capacidade migratória), ela também protege C.eleans contra o estresse oxidativo em uma SKN-1-de maneira independente. Em C.elegans, a curcumina não pode prolongar a vida útil na pele muito doente-1(zu67) mutantes [104], enquanto a GST-4 pode ser induzida de maneira independente de SKN-1-pela sinalização EGF [94] e crosstalk entre a via EGF e o AhR foi relatado em mamíferos [105].

Curiosamente, e oposto à cepa do tipo selvagem, observamos um efeito independente de AHR-1-da curcumina na saúde em modelos de nematóides para a doença de Huntington e Parkinson, respectivamente. Nessas cepas, o tratamento com curcumina aumentou o número de agregados de proteínas na mesma extensão que a deficiência de AHR-1, indicando um efeito protetor da própria agregação de proteínas e/ou ativação de vias de proteção da curcumina contra a agregação de proteínas independentemente de a/ hr-1 esgotamento. A influência da curcumina na agregação de proteínas é controversa: foi demonstrado que ela inibe a formação de fibrilas, mas também se liga a espécies pré-fibrilares/oligoméricas de proteínas amiloidogênicas, acelerando assim sua agregação e reduzindo a neurotoxicidade geral [106]. É importante notar que a cafeína, que também protege contra características do envelhecimento cardiovascular [66,107], também previne a paralisia induzida por A sem diminuir os agregados A, mas através da ativação da via protetora Nrf2/SKN{10}}dependente [108]. Será importante avaliar se o efeito protetor induzido pela curcumina ou toda{12}} depleção nos modelos de doença de C.elegans é mediado por mecanismos que promovem a remoção de espécies oligoméricas/pré-fibrilares em agregados menos tóxicos e/ou por a ativação de outros mecanismos, como Nrf2/SKN-1, que podem proteger concomitantemente contra proteotoxicidade. É importante notar que as enzimas de desintoxicação podem conter XRE e ARE (elementos responsivos a antioxidantes), e uma interação entre a sinalização regulada por Nrf2/ARE e AhR/XRE foi descrita [109]. Será assim interessante esclarecer como a curcumina promove os seus diferentes efeitos benéficos anti-envelhecimento através do equilíbrio entre a sinalização regulada por Nrf2 e AhR.

Nossas abordagens combinadas mostraram que a curcumina inibe a atividade de AHR-1. Em mamíferos, foi sugerido que o efeito inibitório do AhR da curcumina é mediado pela ligação direta do LBD [110] ou pela inibição da proteína quinase C que fosforila o AhR [79]. Outro estudo indicou que a atividade transcricional do AhR é dependente do estado redox celular e da estrutura da cromatina, ambos influenciados pela curcumina [111]. Embora o AHR-1 não se ligue ao TCDD, ele se liga ao XRE in vitro[36], mas estudos sistemáticos, abordando o potencial de hidrocarbonetos poliaromáticos ou outros ligantes de AhR de mamíferos para modular AHR-1, estão faltando principalmente devido a a falta de ferramentas adequadas para avaliar isso. Nossos estudos tentam preencher esta lacuna e, explorar células Cos7 expressando AHR-1 acoplado a ensaios de luciferase (Larigot et al.; apresentado junto com este estudo) e modelagem in silico de C. elegans LBD, revelou que a curcumina suprime AHR -1 atividade, mas provavelmente não por ligação direta de LBD. O ensaio in vitro utilizado em nosso estudo confirmou que o CeAhR não é ativado pela sinalização clássica dos xenobióticos. No entanto, não revelaria atividades devido à ligação de AhR a sequências de DNA diferentes do XRE "clássico" encontrado em CYP1A1, como o XRE responsivo a polifenol (quercetina) encontrado em PON1 [112,113]. A imunocoloração em EC primário humano também argumenta contra a translocação nuclear de AhR induzindo a curcumina, que, juntamente com o efeito promotor da capacidade migratória em células que superexpressam AhR, também pode indicar que a curcumina suprime a atividade de AhR.

Propomos que o efeito inibitório da curcumina, em vez de depender da ligação do AhR, envolve sua capacidade antioxidante, que pode de fato estar associada ou mesmo depender da ativação de Nrf2/SKN-1. O AhR de mamífero é ativado por ROS via modificação oxidativa independente de LBD [85], mas nossos dados mostram que a indução da atividade de AHR-1 pela rotenona pró-oxidante requer o LBD. Um mecanismo indireto de ativação de AhR mediado por ROS é a formação do potente ligante de AhR FICZ[114]. No entanto, FICZ é uma grande molécula planar que, de acordo com nosso modelo in silico, não se encaixaria no AHR-1 LBD. Embora o mecanismo exato pelo qual a atividade de AHR-1 é promovida por ROS e inibida por curcumina (seja via supressão direta de ROS ou indiretamente via ativação de Nrf2 ou outros genes reguladores de antioxidantes) ainda não foi estabelecido, isso é fortemente apoiado por nosso achados: AHR-1 é ativado por rotenona, e mutantes ahr-1 exibem mais mtROS, potencial de membrana mitocondrial reduzido e são mais sensíveis a H, O e juglona, ​​bem como a UVB e BaP [25] , ambos os quais produzem ROS[115,116]. Nesse contexto, é interessante notar que os mutantes ahr{16}} exibem leve alteração das funções mitocondriais, que se assemelham às da mitohormese [117. Isso sugere que toda -1 depleção (e possível curcumina inibindo AHR-1) pode promover a saúde por meio de estresse mitocondrial leve, que é conhecido por prolongar a vida útil de C.elegan por meio de genes de desintoxicação modulados de forma semelhante nos outros { {20}} mutantes [118.119]. Além disso, se o Nrf2/SKN-1 e as mitocôndrias desempenham um papel na modulação da atividade de AHR-1 no tratamento com curcumina é uma possibilidade interessante que ainda precisa ser validada.

No geral, aproveitando as múltiplas características oferecidas pelo nematoide C.elegans para estudos in vivo, sugerimos que a função ancestral do AhR pode estar na regulação de enzimas de fase ll relacionadas a respostas antioxidantes e não xenobióticas. Ao contrário dos efeitos prejudiciais induzidos por altos níveis de ROS, os efeitos benéficos promovidos pela deficiência de AhR podem ser mediados por estresse mitocondrial leve e/ou produção leve de ROS (mitohormese), que também dependem de Nrf2/SKN-1. Também fornecemos fortes evidências da interação entre a curcumina e o AhR. A inibição da sinalização de AhR pela curcumina é conservada evolutivamente e provavelmente não é mediada pela ligação ao AhR LBD, mas sim pelas propriedades de eliminação de ROS da curcumina ou pela ativação de Nrf2/SKN-1. A via de sinalização Nrf2 pode de fato ser ativada pela curcumina de diferentes maneiras [91]. Finalmente, nossos dados mostraram que a curcumina promove efeitos antienvelhecimento também de maneira independente em C.elegans (aumento da expressão de GST-4 e resistência ao estresse oxidativo) e EC primário humano (aumento da expressão de Sod2 e capacidade migratória ), o que também poderia explicar os efeitos aditivos da curcumina e a perda da função AHR-1 na saúde de animais que expressam polyQ.

5. Conclusões

Em conclusão, através de uma combinação original de abordagens in silico, vitro e in vivo, mostramos que, embora a ativação do CeAhR proteja contra o estresse oxidativo no início da vida, sua expressão diminuída neutraliza o envelhecimento e medeia o efeito antienvelhecimento benéfico da curcumina (Figura 7) . A curcumina pode, assim, ajudar a equilibrar a atividade de diferentes fatores de transcrição envolvidos na desintoxicação/respostas antioxidantes (suprimir AhR e ativar Nrf2) em condições onde estes são alterados (aumentar AhR e diminuir Nrf2/SKN-1), como envelhecimento ou distúrbios associados à idade. Nosso trabalho adiciona um nível adicional de complexidade às já vastas atividades multifuncionais e específicas de contexto do AhR, com importantes repercussões na saúde e na vida útil do organismo. Além disso, abre a porta para estudos adicionais, usando o sistema de nematóides para descobrir e investigar funções ancestrais do AhR, que são menos prováveis ​​de serem identificadas em mamíferos.

Este artigo foi extraído de Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants