Atividade antinociceptiva de cistanche Salsa Stolons, crescendo na República do Cazaquistão

Material vegetal

molho cistanche(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,estolões foram coletados no deserto de Moinkum, vila de Bakanas, em julho de 2014 em Almaty. O material vegetal foi identificado pelo Dr. G. Sitpayeva do Instituto de Botânica e Fitointrodução, Ministério da Educação e Ciências da República do Cazaquistão, onde foi depositado sob o número 01-04/306.

Análises químicas

estolões deC. salsa(2 g) foram submetidos a extração por micro-ondas. Inicialmente, o material foi moído para 0.001–2.000 mm e então colocado em um recipiente hermético para ser extraído por 10 min a 100–1100 graus com etanol 80 por cento ( relação 1:10). O extrato hidroetanólico (CSHE) foi analisado por HPLC-MS. O extrato bruto foi dissolvido em metanol (9,6 mg/ml) e filtrado através de 0,45mm Membrana de Teflon antes da análise. Um cromatógrafo líquido modelo HP 1100 Series (empresa Agilent Technologies, Inc., CA, EUA), equipado com um desgaseificador a vácuo de fluxo, uma bomba gradiente de baixa pressão de quatro canais e uminjetor. Os compostos fenólicos foram separados cromatograficamente por uma coluna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, preenchido com polímero de gel de sílica octadecilsilil (1,8µ). A análise cromatográfica foi realizada com um fluxo de fase móvel de 0,2ml/min, pressão operacional do eluente de 175–200 kPa, temperatura do forno da coluna de 30 graus, 2 ml de volume de amostra, modo de alimentação de eluente gradiente: 0–36 min 10 por cento A – 90 por cento B; 36 min – 100 por cento B (eluente A: metanol, eluente B: solução de ácido fórmico a 0,2 por cento). A detecção foi realizada por UV nos comprimentos de onda de 254, 334, 350, 410, 450 e 550nm. A comparação dos tempos de retenção, UV e espectros de massa obtidos com os dos compostos de referência foi utilizada para a identificação dos compostos químicos no extrato. A análise quantitativa foi realizada pelo uso de verbascosídeo padrãoe equinacosídeo analisados ​​nas mesmas condições cromatográficas. Suas curvas de calibração permitiram o cálculo da quantidade de cada fenilpropanóideglicosídeo no extrato etanólico desta planta. O método não foi validado.

animais

Ratos Swiss Webster (20–25g, dois meses de idade) foram utilizados neste estudo (doados pelo Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brasil). Os animais foram mantidos em condições padrão (ciclo claro-escuro de 12 h, 22 ± 2 graus e 70-80 por cento de umidade. Comida e águaAD Libitum). Os animais receberam apenas água para evitar a interferência do alimento na absorção da substância 12h antes do início dos experimentos. A aclimatação às condições de laboratório aconteceu por pelo menos 1 h antes de cada teste. Todos os protocolos foram conduzidos de acordo com as Diretrizes de Padrões Éticos para Investigação de Dor Experimental em Animais e seguiram os princípios e diretrizes adotados pelo Conselho Nacional de Controle deExperimentação Animal (CONCEA), aprovado peloInstituto de Ciências Biomédicas/UFRJ, Comitê de Ética em Pesquisa Animal, e recebeu o número DFBCICB015-04/16. Todos os protocolos experimentais foram realizados durante a fase clara. O número de animais por grupo foi mínimo e de acordo com as normas do CONCEA. No final de cada experimento, os camundongos foram mortos por overdose de cetamina/xilazina.

Tratamentos

Neste estudo, a CSHE foi avaliada aos 10, 30 e 100 mg/kg. O extrato foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO, Fisher Biotech) para preparar uma solução estoque a 100 mg/ml. O PBS foi utilizado como diluente para o preparo das diferentes doses. Soluções contendo 10, 30 e 100mg/kg do extrato hidroetanol deC. salsaestavam preparados. As drogas padrão utilizadas foram morfina 2,5mg/kg (Merck, diluído em tampão fosfato salino (PBS)), ácido acetilsalicílico 200mg/kg (Sigma Aldrich, dissolvido com 5M de hidróxido de sódio(NaOH) em 00,9 por cento salino) e capsazepina 10 nMol por pata. Solução salina mais DMSO (na mesma concentração do tratamento mais alto com extrato) foi dada ao grupo de controle negativo. Todos os tratamentos (extrato testado e padrões) foram administrados por via oral. A única exceção foi a capsazepina, que foi administrada por injeção intraplantar.

Dor aguda induzida por formalina

Uma solução de formalina 2,5 por cento (37 por cento formaldeído) foi injetada (20ul) na região plantar da pata traseira direita de camundongos 60min após o tratamento (extrato hidroetanol deC. salsaou ácido acetilsalicílico 200 mg/kg ou morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro transparente e a duração do tempo em segundos que eles passaram lambendo a pata após a injeção de formalina foi registrada e analisada em dois períodos separados, fase inicial de dor neurogênica (0-5 min após a injeção) e dor inflamatória de fase tardia (15 a 30 minutos após a injeção).

Nocicepção induzida por capsaicina

Este teste foi baseado no método descrito por Sakurada et al. com algumas modificações (Sakurada et al., 1992). Capsaicina (20 ul) C18H27NÃO3(Galena, Campinas, SP) foi injetado na região plantar da pata traseira direita dos camundongos (1,6 ug/pata) uma hora após o tratamento (extrato hidroetanol deC. salsaou capsazepina 10 nMol/pata). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro e a duração (s) da lambedura da pata foi registrada entre 0 e 5min após a injeção de capsaicina e então analisados.

Nocicepção induzida por glutamato

No método descrito por Beirith et al. (2002), solução de glutamato em PBS (20 ul) (l-ácido glutâmico, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/pata) foi injetado na região plantar da pata traseira direita dos camundongos uma hora após o tratamento (extrato hidroetanol deC. salsaou morfina 2,5 mg/kg). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro e a duração da lambedura da pata (segundos) foi registrada entre 0 e 15 min após a injeção de glutamato e então analisada.

Análise estatística

Os dados químicos são apresentados como média ± DP de cinco experimentos. Todos os grupos experimentais farmacológicos consistiram em um mínimo de seis camundongos. A análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida do teste de Dunnett permitiu a visualização da significância estatística entre os grupos por meio do software GraphPad Prism 5.0.pos valores foram considerados significativos quando eram menores que 0,05 (p < 0.05).

Discussão

Um total de dez glicosídeos fenilpropanóides foram identificados noC. salsa(crescendo no Cazaquistão) extrato de hidroetanol. Echinacoside (10,98 mg/g), acteoside (9,44 mg/g) e tubuloside B (7,94 mg/g) foram os principais compostos identificados. Os dados obtidos foram correlacionados com a literatura disponível para espécies deCistanchecrescendo em diferentes regiões da Ásia (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). Echinacoside e acteoside são os principais componentes, que formam a base para a padronização das espécies oficinaisC. deserticolaeC. tubulosa, listado na Farmacopéia Chinesa em 2005. Propomos que esses compostos também possam ser usados ​​para a padronização deC. salsaestolões do Cazaquistão, pois são os principais no extrato hidroetanólico estudado.

De acordo com os resultados farmacológicos deste estudo, é possível sugerir que o CSHE é um agente eficaz contra a dor neurogênica e a inflamação observada no teste da formalina. Para o melhor de nosso conhecimentoC. salsanunca foi testado em relação às suas ações antinociceptivas. Um estudo de 2002 comC. deserticola(Lin e outros, 2002) mostrou que essa planta apresentou atividades antinociceptiva e anti-inflamatória quando testada em modelos como contorções totais, formalina e edema de pata. Embora não houvesse nenhuma tentativa de investigar os principais constituintes ativos dos extratos, eles consideraram o extrato butanol e a camada aquosa como os ativos. Não surpreendentemente, esses solventes estão na escala de polaridade que corresponde ao fenilpropanóide.glicosídeos encontrados emC. salsa. Além disso, Lin e colaboradores estabeleceram que a ação antinociceptiva deC. deserticolaextratos não foi devido à ação do composto no receptor opiáceoou relacionado ao sistema imunológico. Em nosso estudo, o extrato rico em fenilpropanóides apresentou atividade em ambas as fases do teste da formalina. A atividade observada deveu-se, de fato, ao alvo farmacológico investigado e não a qualquer possível alteração motora evidenciada pelo teste do rota rod. Os resultados do teste de formalina indicam potencial para dor neurogênica, bem como dor induzida pormediadores inflamatórios. Inicialmente decidimos investigar a via da dor neurogênica. Como compostos semelhantes de outras espécies estudadas anteriormente não mostraram nenhuma atividade de receptor opiáceo, decidimos testar outros modelos, como modelos de glutamato e capsaicina.

O glutamato é um neurotransmissor excitatórioque tem um papel importante na modulação da dor em todo o sistema nervoso periférico e central. Essa ação é mediada por receptores ionotrópicos de glutamato controlados por ligantes(iGluRs) e receptores metabotrópicos de glutamato. Os iGluRs podem ser divididos emN-metilo-d-aspartato (NMDA) e -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-ácido propiônico (AMPA) (Kolber, 2015). A pesquisa mostrou que, ao antagonizar os receptores NMDA e AMPA com cetamina ecainate, respectivamente, observa-se um efeito antinociceptivo. No entanto, os antagonistas direcionados a esses receptores até agora induziram um efeito adverso substancial e, por esse motivo, um novo foco de pesquisa em mGluRs, esperando que o medicamento mediado por esse receptor causasse menos efeitos colaterais.Palazzo e outros, 2014). Os resultados dos testes do CSHE mostraram que esse tratamento foi eficaz na redução da dor induzida pelo glutamato. No entanto, ainda não se sabe se esse efeito é mediado por receptores ionotrópicos e/ou metabotrópicos. A morfina é uma das drogas disponíveis que tem efeito na transmissão glutamatérgica (Deyama et al., 2007). É relatado na literatura que a ativação do receptor de glutamato aumenta as respostas TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Por esse motivo, é possível que o efeito observado para CSHE seja devido à atividade no TRPV1 e não necessariamente por uma resposta direta nos receptores de glutamato.

O próximo passo desta pesquisa foi realizar um teste de lamber a pata utilizando como agente algésico a capsaicina, que é um agonista do receptor TRPV1. Os resultados mostraram que, de fato, a CSHE diminuiu a dor por meio do receptor TRPV1.

No caso da CSHE, em quase todas as metodologias testadas, pudemos observar que a dose de 30 mg/kg obteve melhores resultados que a de 100 mg/kg. Isso pode ser devido à saturação da solução levando a compostos precipitados e efetivamente menos quantidade de drogas sendo biodisponíveis.

Confirmar a composição química estabelecida para o extrato cazaque CSHE foi um passo importante porque os principais constituintes nele presentes já tiveram suas ações antinociceptivas/antiinflamatórias de alguma forma confirmadas. Por exemplo, o equinacosídeo foi estabelecido como um dos princípios ativos responsáveis ​​pela ação antinociceptiva deEchinaceae(Hostettmann, 2003). Além disso, um estudo anterior de Schapoval e colaboradores (Schapoval et al., 1998) apontou o acteoside como um dos principais princípios ativos em um extrato etanólico preparado comStachytarpheta cayennensisconforme avaliado por modelos de edema de pata e placa quente. Backhouse e colaboradores (Backhouse et al., 2008) também consideraram o acteoside o princípio ativo deBuddlejaglobosautilizando vários modelos de avaliação da dor, incluindo o teste da formalina. Novas formulações estão sendo desenvolvidas usando o conhecimento de ponta para aumentar a estabilidade e prolongar a ação antinociceptiva do acteosídeo (Isacchi et al., 2016).

Conclusão

Dez substâncias de natureza fenólica foram identificadas nos estolões do CazaquistãoC. salsapor análise HPLC/MS. Esses compostos podem ser os responsáveis ​​pela atividade antinociceptiva observada nos modelos experimentais aqui realizados. Levando em consideração que no território do Cazaquistão o gêneroCistancheé representado principalmente por espéciesC. salsa, podemos recomendar sua colheita e padronização usando echinacoside e acteoside como compostos padrão, para obter uma matéria-prima de boa qualidade para a Medicina Tradicional Chinesa.