Antienvelhecimento - Andaime ativado pelo gene Klotho promove resposta rejuvenescedora de cicatrização de feridas em células-tronco derivadas de tecido adiposo humano

3. Discussão

Este estudo teve como objetivo investigar o impacto funcional de um anti-envelhecimento -Andaime ativado pelo gene Klotho em ADSCs humanos para aplicações aprimoradas de cicatrização de feridas. No geral, descobrimos que o andaime ativado por gene oferece ativação controlada das habilidades regenerativas das ADSCs, conforme ilustrado na Figura5. Especificamente, o andaime ativado por gene aprimorou transitoriamente a haste das ADSCs por meio da ativação do fator de transcrição Oct-4. O andaime ativado por gene também promoveu a ativação precoce do gene antifibrótico TGF- 3, um fator crucial para uma cicatrização controlada com cicatrizes reduzidas. Além disso, as ADSCs ativadas controlaram temporariamente a angiogênese endotelial e apoiaram a cicatrização de fibroblastos dérmicos por meio de sinalização parácrina. Em direção à maturação, as ADSCs também controlaram a ativação da resposta pró-fibrótica nos fibroblastos dérmicos. Enquanto isso, as ADSCs no andaime ativado por gene efetivamente regeneraram a membrana basal dérmica, aumentando a deposição de laminina e colágeno IV. Esta resposta foi ainda associada com redução da cicatriz associada - Expressão da proteína SMA e melhor deposição qualitativa da matriz de elastina. Nosso estudo determinou coletivamente que o -Ativado pelo gene KlothoCistanchepossui um enorme potencial paracicatrização de feridase poderiaterapia avançada baseada em células-tronco para aplicações de cura rejuvenescedoras.

Figura 5. Um esquema do impacto funcional do andaime ativado pelo gene B-Klotho em ADSCs humanas para aplicações de cicatrização de feridas. As principais descobertas deste estudo são (1) aumento transitório da pluripotência das células-tronco e resposta antifibrótica, (2) controle parácrino aprimorado em relação à angiogênese e remodelação do colágeno pró-fibrótico em fibroblastos dérmicos e, finalmente, (3) aumento da maturação de a membrana basal com controle sobre a expressão de proteínas associadas à cicatriz As linhas pontilhadas para a matriz de elastina implicam uma deposição qualitativa melhorada.

Clique Aqui Para Saber Como CistancheEfeitos de cicatrização de feridas

Nas estratégias de cicatrização de feridas, a terapia gênica baseada em plasmídeo é aplicada para aumentar temporariamente as respostas celulares até que o reparo da ferida esteja completo.37]. Nosso andaime ativado por genes também mostra que a terapia O gene -Klotho é transitoriamente regulado ao longo de 14 dias. A expressão significativamente aprimorada (170- vezes) do -Klotho mRNA no dia 3 pode ser atribuído ao promotor CMV precoce imediato que é conhecido por aumentar a ativação transcricional do transgene codificado [38]. No entanto, nas MSCs, o CMV pode sofrer metilação do DNA ou desacetilação das histonas, o que pode reduzir a expressão do transgene.39]. Além disso, os plasmídeos geralmente são epissomas não replicantes, limitando a transferência do transgene para as células em divisão e causando um declínio na expressão do transgene ao longo do tempo.40]. A presença de marcadores heterocromáticos provenientes das sequências bacterianas doplasmídeo poderia reprimir ainda mais a expressão do transgene [41], contribuindo globalmente para uma expressão gênica transitória.

Um dos caminhos perseguidos no tratamento de feridas difíceis de cicatrizar é a aplicação de scaffolds bioativos semeados por células. Uma razão é a sua capacidade de promover a reparação rápida de feridas. Células metabolicamente ativas no enxerto secretam fatores parácrinos e sofrem diferenciação, orquestrando os complexos eventos de sinalização no ambiente da ferida.42]. As células-tronco, em particular, têm uma capacidade única de detectar estímulos externos e modular sua resposta para restaurar a homeostase.43]. No entanto, as células-tronco perdem sua haste quando são expandidas in vitro para gerar um grande número de células para o enxerto. Nosso estudo mostra que o stemness pode ser temporariamente aprimorado usando um andaime ativado por gene que carrega um gene antienvelhecimento -Klotho. Especificamente, observamos que o andaime ativado por gene antienvelhecimento aumentou a expressão do gene stemness Oct-4 nas ADSCs. Oct-4 é um dos principais fatores de transcrição em células-tronco embrionárias e é essencial para o desenvolvimento embrionário controlado [44]. Nas ADSCs, a ativação do gene Oct-4 pode promover seu potencial de proliferação e diferenciação [45]. Assim, a expressão aumentada de Oct-4 pode facilitar a rápida diferenciação das ADSCs no andaime ativado por gene em células hospedeiras e auxiliar no processo de cicatrização.

Tendo observado a ativação do gene Oct-4 nas ADSCs, avaliamos a potência angiogênica das ADSCs. A angiogênese é crucial para a integração eficiente do enxerto com o tecido hospedeiro.46]. As células do enxerto desencadeiam a angiogênese por meio da secreção de fatores parácrinos. A angiogênese também é um evento crucial para o desenvolvimento do tecido de granulação e sua atividade diminui à medida que o tecido de granulação amadurece.47]. Essa limitação programada da atividade angiogênica nas fases posteriores da cicatrização é essencial para controlar a cicatrização e a hipergranulação que podem impedir a reepitelização [48]. Nossa descoberta também mostra que as ADSCs no andaime ativado por genes podem aumentar o brotamento endotelial e controlar seu crescimento por meio da sinalização parácrina. Além disso, os aumentos significativos na atividade metabólica das células endoteliais e brotamento em resposta ao dia 3 CM demonstram o potencial do andaime ativado por genes carregados de ADSCs para se integrar rapidamente ao tecido hospedeiro. Além disso, o uso de células-tronco CM é uma abordagem livre de células comumente adotada para melhorar a qualidade da cicatrização de feridas.49]. Como limitação, reconhecemos que as células endoteliais dérmicas adultas serviriam como um modelo celular melhor para estudar a angiogênese; no entanto, para manter a consistência com nossos estudos anteriores e os HUVECs sendo amplamente aceitos como o candidato celular "padrão-ouro" [50], adotamos o ensaio de angiogênese HUVECs.

Um aumento na atividade de remodelação dos fibroblastos é uma característica geral da maturação do tecido de granulação.51]. Durante esta fase, as matrizes de colágeno III são gradualmente substituídas por fibras de colágeno I mais fortes.51]. As fibras de colágeno promovem a contração da ferida.52], e a contração da ferida é indispensável para o fechamento completo da ferida [53]. No entanto, um aumento sustentado agressivo na deposição de colágeno I pode aumentar a formação de cicatriz.54]. O controle da cicatrização é crucial, pois pode inibir o desenvolvimento de outros apêndices da pele, como folículos pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas, por exemplo, em queimaduras.54]. Nossa descoberta demonstra que o CM envelhecido (dia 14) do grupo de andaime ativado por gene pode controlar a expressão de colágeno pró-fibrótico I em fibroblastos dérmicos adultos. Este efeito controlado nos fibroblastos ocorreu sem maior influência na migração do fibroblasto ou nas suas expressões de colágeno III anti-fibrótico em relação ao grupo de andaime livre de genes. Portanto, sugerimos que o andaime ativado por genes carregados de ADSCs pode oferecer melhor controle na limitação da cicatrização in vivo por meio da expressão controlada do colágeno I. Li et al., também mostraram que as ADSCs CM podem reduzir significativamente a expressão de colágeno I em fibroblastos derivados de cicatrizes hipertróficas [55]. Outro estudo de Wang et al., demonstrou uma redução semelhante na expressão de colágeno I em fibroblastos derivados de quelóides [56], demonstrando coletivamente o potencial antifibrótico do CM das ADSCs.

Uma das descobertas significativas que notamos com a aplicação do O andaime ativado pelo gene Klotho é a regeneração aprimorada da membrana basal nas ADSCs. A regeneração da membrana basal é essencial para a maturação dos vasos sanguíneos e completa reepitelização.57,58]. É importante ressaltar que a tendência em que as proteínas laminina(2.1-vezes) e o colágeno IV (8.8-vezes) são regulados positivamente, indicando maior maturação da membrana basal no grupo de andaimes ativados por genes [59]. Além de atuar como fator antienvelhecimento [60], o beta klotho funciona para aumentar a sensibilidade ao fator de crescimento de fibroblastos (FGF) pelos receptores de FGF [61]. Além disso, descobriu-se que um aumento na sinalização de FGF promove a maturação da membrana basal por meio da deposição de laminina e colágeno IV.62]. Portanto, considerando o papel de beta klotho como um co-receptor de FGF, o aumento da maturação basal no grupo de andaime ativado por gene é potencialmente mediado por um aumento na sinalização de FGF de ADSCs.

O componente da membrana basal notavelmente regulado positivamente no grupo de andaime ativado por gene é a proteína de colágeno IV. A proteína de colágeno IV representa 50% de todas as membranas basais.63] e fornece estabilidade estrutural à membrana basal [59]. No entanto, o envelhecimento reduz significativamente a expressão de colágeno IV na junção derme-epidérmica.58,64] e a falta de colágeno IV pode promover a patogênese da cicatriz [65]. Assim, nossos resultados sugerem que o aumento da potência regenerativa da membrana basal do andaime ativado por genes carregados de ADSCs pode ajudar significativamente na cicatrização aprimorada em pacientes idosos. Outros estudos também mostraram que a ECM derivada do tecido adiposo possui um tremendo potencial terapêutico para o reparo da pele.66]. Além disso, enxertos de engenharia de tecidos ricos em laminina e colágeno IV também são de interesse para o reparo do epitélio respiratório.67]. 

Além do controle pró-fibrótico em relação aos fibroblastos, nosso estudo mostra ainda que as ADSCs no andaime ativado por gene também expressam uma expressão 2- vezes menor da proteína associada à cicatriz -SMA [68]. Embora não tenhamos avaliado seu impacto in vivo, a redução da A expressão de -SMA é crucial para melhorar a cicatrização qualitativa [69]. O uso de agentes fibróticos como a bleomicina [70] poderia ser uma maneira de avaliar melhor as propriedades antifibróticas da construção de andaime ADSCs/ativada por gene in vitro; no entanto, nosso foco foi estabelecer o potencial terapêutico provisório do constructo.

Outro indicador de que o andaime ativado por genes carregados de ADSCs pode melhorar a cicatrização qualitativa é a deposição de matriz de elastina fibrosa em vez de secreções extracelulares irregulares no grupo de andaime livre de genes. A deposição de elastina é uma das principais atividades que impulsionam a cicatrização de feridas fetais sem cicatrizes.71]. No entanto, as peles adultas carecem da deposição de elastina [71]. Como tal, a tropoelastina, um precursor da elastina, é frequentemente incorporada em andaimes de biomateriais para controlar a cicatrização na cicatrização de feridas.72]. Tomados em conjunto, nossos achados implicam que os ADSCs/ O construto de andaime ativado pelo gene -Klotho pode conferir uma forte resposta antifibrótica in vivo.

4. Materiais e Métodos

4.1. Preparação de andaime ativado por gene

O andaime ativado por gene foi desenvolvido usando um processo de 2-etapa. Em primeiro lugar, andaimes de sulfato de condroitina e colágeno poroso sólido foram fabricados por uma pasta liofilizada de colágeno tipo 1 de tendão bovino e sulfato de condroitina-6-derivado de cartilagem de tubarão (Sigma, Reino Unido). Um processo otimizado de liofilização projetado para criar poros uniformes foi usado para produzir os andaimes [73]. Com base em nosso protocolo publicado [74], os andaimes liofilizados foram tratados desidrotermicamente (DHT) a 105◦C sob vácuo para esterilização e melhoria mecânica. Os andaimes esterilizados foram então reticulados quimicamente com solução de cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida 14 mM e solução de N-hidroxissuccinimida 5,5 mM (razões molares de 2,5 de EDC/NHS) (Sigma, Reino Unido) para melhorar ainda mais a estabilidade mecânica [75]. Os andaimes reticulados foram então lavados com PBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) para remover os produtos químicos residuais. Uma vez que os andaimes estavam prontos, os poliplexos em uma proporção N/P10 (razão nitrogênio para fosfato) foram preparados misturando um volume predeterminado de solução de polietilenoimina ramificada (PEI) com DNA plasmidial (pDNA) que codifica o gene beta-Klotho humano ( -Klotho), obtido da SinoBiological, Pequim, China. A razão N/P10 foi escolhida com base em nossos estudos anteriores que descobriram que poliplexos formulados em uma razão N/P 10 poderiam efetivamente formar nanopartículas catiônicas pequenas e estáveis ​​com plasmídeos tão grandes quanto GLuc (5,76 kb) [21,23]. Antes do uso, os plasmídeos foram diluídos em água livre de endotoxinas para obter uma concentração de trabalhode 0,5µg/µL. O plasmídeo contém citomegalovírus humano avançado imediato(CMV3) promotor para promover a expressão estável e transiente de alto nível do codificadogene em células de mamíferos.

A mistura de plasmídeo/PEI foi deixada em repouso por 30 min para se auto-montar em polyplexnanopartículas. As nanopartículas foram então carregadas de molho nos andaimes por pipetagemvolumes iguais da solução polyplex por lado do andaime. Um total de 2µg pDNA erausado por andaime para desenvolver o andaime ativado por gene.

4.2. Semeadura celular ativada -Andaime ativado por gene Klotho

ADSCs humanos (iXCells Biotechnologies, San Diego, CA, EUA) foram expandidos para a passagem 4 no meio de crescimento de ADSCs (Cat no. MD0003) fornecido pela empresa. Um total de 5× 105 ADSCs (2.5× 105 por lado) foram então semeados por andaime livre de gene (controle,n = 3) ou andaime ativado por gene (teste,n = 3). Depois de deixar as células assentarem por cerca de 20 min, 2 mL de meio de transfecção OptiMEM (Gibco, Reino Unido) foram adicionados e os andaimes celularizados foram incubados a 37◦C por 24h. Após a incubação de 24 h, os andaimes celularizados livres de genes ou ativados por genes foram transferidos para novas placas de 12-poços e alimentados com 2 mL de meio de crescimento de ADSCs. A troca de mídia foi então realizada a cada 3-4 dias até o dia 14, coletando 1 mL do meio condicionado (CM) e substituindo-o por igual volume de meio fresco. Todos os CM foram armazenados em−80 ◦C até análise.

4.3. Análises qRT-PCR para determinar - Superexpressão do gene Klotho e ativação de genes funcionais

A fim de determinar a regulação transitória dos genes alvo, as células foram colhidas nos dias 3 (início) e 14 (tardio) pós-semeadura nos andaimes livres de genes ou ativados por genes. As células foram primeiro lisadas usando o reagente de lise Qiazol (Qiagen, Germantown, MD, EUA). O clorofórmio foi então adicionado para separar o lisado celular em proteínas, DNA e fases de RNA. Usando o kit RNeasy (Qiagen, Manchester, Reino Unido), o RNA foi extraído e sua qualidade e quantidade foram determinadas usando um leitor de placas Multiskan Go (Thermo Scientific, Reino Unido) com a absorbância ajustada para 260 nm. O DNA genômico foi então removido misturando o RNA com um tampão de limpeza de DNA genômico (Qiagen, Manchester, Reino Unido) e aquecendo a 42◦C por 2 min. Posteriormente, a transcrição reversa foi realizada para preparar o cDNA. Duplicatas de cDNA por replicação (n = 3) foram carregados nas placas qRT-PCR e, em seguida, o ensaio foi executado usando os primers listados na Tabela1. A mudança de dobra na expressão de mRNA em relação às células no andaime sem gene foi calculada usando o 2−∆∆TCmétodo de médias de três réplicas por grupo. O GAPDH humano (Hs_GAPDH_1_SG, Cat. No. QT00079247) foi usado como o gene de limpeza.

4.4. Análises de Bioatividade de Fatores Secretados das ADSCs em -Andaime ativado por gene Klotho

4.4.1. Análises de Bioatividade Pró-Angiogênica

4.4.2. Análises de cicatrização e maturação de fibroblastos dérmicos

Após o ensaio de angiogênese, investigamos a potência do CM para cicatrização dérmica empregando um ensaio de raspagem de fibroblastos dérmicos humanos adultos (iXcells, Cat no. 10 HU-014). Para este estudo, escolhemos especificamente o CM envelhecido a partir do dia 14 para estudar sua influência no fechamento da ferida fibroblástica durante a maturação. Um total de 1× 104 células/poço em uma placa de poço 96- foram semeadas e incubadas durante a noite no meio de crescimento de fibroblastos. No dia seguinte, uma ferida foi criada na monocamada raspando horizontalmente uma ponta de pipeta de 200 uL no poço. A monocamada foi então enxaguada com PBS para remover quaisquer detritos e alimentada com o CM. O fechamento da ferida foi registrado entre 12 e 16 horas após o arranhão. A imunocoloração foi usada para estudar a expressão de colágeno pró-fibrótico I (1:100, Novusbio, Reino Unido) e anti-colágeno III (1:100, Novusbio, Reino Unido) nos fibroblastos. Os fibroblastos foram contrastados com rodamina (1:800, Abcam, Reino Unido) para imagens de F-actina. A imunocoloração foi realizada conforme descrito na Seção4.5, com exceção do processamento e desparafinização de tecidos. Ambos HUVECs e os fibroblastos foram usados ​​na passagem 4.

4.5. Imaging Imunofluorescência de Proteínas da Matriz Extracelular

Após 14 dias de cultura, os andaimes celularizados livres de genes ou ativados por genes foram colhidos para detecção de deposição de matriz usando imunofluorescência. O processamento das amostras foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os andaimes foram primeiro lavados com PBS e fixados em formalina tamponada neutra a 10 por cento por 20 min. As amostras fixadas foram então processadas usando o protocolo padrão para desparafinização. Os blocos foram então cortados em 7-µm fatias grossas e coletadas em lâminas carregadas. Os cortes foram então desparafinizados com xileno seguido de reidratação do corte com gradientes decrescentes de etanol. Posteriormente, as células foram permeabilizadas com 0,2 por cento Tween®20 (Sigma-Aldrich, França) em PBS por 30 min (lavagem de 10 min× 3) e bloqueados usando 10 por cento NGS (Normal Goat Serum, Invitrogen, Rockford, IL, EUA)/5 por cento BSA/0,3 M Glicina (preparado em solução permeabilizante) por 1 h. Após o bloqueio, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas a 4◦C durante a noite com os anticorpos para as proteínas da matriz alvo listadas na Tabela2. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas em PBS três vezes por 2 a 3 minutos cada para remover quaisquer anticorpos primários não ligados. Posteriormente, as lâminas foram incubadas em Alexa 488-IgG anti-rato conjugada de cabra (A32723, Invitrogen, Reino Unido) ou IgG anti-coelho de cabra conjugada Alexa 594-(A11012, Invitrogen, Reino Unido) a 1: 800 diluição à temperatura ambiente por 1 h no escuro. A etapa de enxágue foi realizada como antes e contrastada para núcleos usando o meio de montagem com DAPI (ab104139, Abcam, Reino Unido). As lâminas foram então fotografadas usando um microscópio de fluorescência (Olympus BX43, Japão) a 20× objetivo. Amostras incubadas apenas com anticorpos secundários foram usadas como controle.

Quantificação de imagem

Image] (Image, NIH, MD, EUA) foi usado para determinar semi-quantitativamente a quantidade de proteínas expressas. Para cada marcador, um valor limite constante foi primeiro determinado por meio de imagens preliminares de várias seções. Usando o valor limite definido, a densidade integrada (área manchada x valor médio de cinza) das imagens foi determinada e, em seguida, normalizada para o número de células (contagem DAPI) para fornecer uma densidade de fluorescência média final por célula. Uma média foi quantificada de 8-10 imagens aleatórias por réplica com um mínimo de três réplicas por grupo. As médias obtidas das três réplicas/grupo foram então usadas para medir a expressão relativa entre os grupos.

4.6. Análise estatística

Todos os resultados são expressos como média mais desvio padrão. O teste t bicaudal não pareado foi geralmente usado para calcular a significância estatística entre os grupos, onde p < 0,05 foi considerado significativo

Este estudo mostrou que oanti-envelhecimento - Cistanche ativado pelo gene Klothoofertas controladas ativação da capacidade regenerativa de ADSCs. As principais conclusões deste estudo são (1)aumento transitório da pluripotência das células-tronco e da resposta antifibrótica, (2)melhor controle parácrino para a angiogênese, e remodelação pró-fibrótica do colágenoem fibroblastos dérmicos e, finalmente, (3)aumento da maturação da membrana basalcom controle sobre a expressão de proteínas associadas à cicatriz. Conclusivamente, esses resultados sugeremque os ADSCs carregados -O andaime ativado pelo gene Klotho pode possuir um grande potencialtratar uma ampla gama de feridas dérmicas.

recursos, ALL, FJO e MBK; curadoria de dados, ALL e MBK; redação - rascunho original preparação, ALL; redação—revisão e edição, ALL, FJO e MBK; visualização, ALL; supervisão,FJO e MBK; administração de projetos, MBK; aquisição de financiamento, FJO e MBK Todos os autoresleram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

1. Laiva, AL; O'Brien, FJ; Keogh, MB Inovações em sistemas de distribuição de genes e fatores de crescimento para cicatrização de feridas diabéticas.J. Tissue Eng. Regenerar. Med.2018, 12, e296–e312. [CrossRef] [PubMed] 

2. Makrantonaki, E.; Wlaschek, M.; Scharffetter-Kochanek, K. Patogênese dos distúrbios de cicatrização de feridas em idosos.JDDG J. Dtsch. Dermatol. Ges.2017, 15, 255–275. [CrossRef] [PubMed]

3. Ganguly, P.; El-Jawhari, JJ; Burska, AN; Ponchel, F.; Giannoudis, PV; Jones, EA A análise do envelhecimento in vivo em células estromais mesenquimais da medula óssea humana usando o ensaio de fibroblastos da unidade formadora de colônias e o fenótipo CD45lowCD271 plus.Células-Tronco Int.2019, 2019, 5197983. [CrossRef] 

4. Westerweel, PE; Teraa, M.; Rafifii, S.; Jaspers, JE; Branco, AI; Hooper, AT; Verhaar, MC Mobilização de células progenitoras endoteliais prejudicada e estroma de medula óssea disfuncional em diabetes mellitus.PLoS ONE2013, 8, e60357. [CrossRef] 

5. Murray, RZ; Oeste, ZE; Cowin, AJ; Farrugia, BL Desenvolvimento e uso de biomateriais como terapias de cicatrização de feridas.Queimar. Trauma2019, 

6. [CrossRef] [PubMed] 6. Ebrahimian, TG; Pouzoulet, F.; Squiban, C.; Buard, V.; andré, M.; Primo, B.; Tamarat, R. A terapia celular baseada em células estromais derivadas do tecido adiposo promove cicatrização fisiológica e patológica de feridas.Arterioscler. Trombo. vasc. Biol.2009, 29, 503–510. [CrossRef] 

7. Wu, Y.; Chen, L.; Scott, PG; Tredget, EE As células-tronco mesenquimais melhoram a cicatrização de feridas por meio de diferenciação e angiogênese.Células-tronco2007, 25, 2648–2659. [CrossRef] [PubMed] 

8. Foubert, P.; González, AD; Teodosescu, S.; Berard, F.; Doyle-Eisele, M.; Yekkala, K.; Fraser, JK Terapia celular regenerativa derivada de tecido adiposo para cicatrização de queimaduras: uma comparação de dois métodos de aplicação.Adv. Tratamento de feridas2016, 5, 288–298. [CrossRef] [PubMed]

9. Assi, R.; Foster, TR; Ele, H.; Stamati, K.; Bai, H.; Huang, Y.; Dardik, A. A entrega de células-tronco mesenquimais em andaimes de engenharia biomimética promove a cicatrização de úlceras diabéticas.Regenerar. Med.2016, 11, 245–260. [CrossRef] [PubMed] 

10. Jiang, Y.; Chen, B.; Liu, Y.; Zhufu, Z.; Yan, X.; Hou, X.; Tan, Q. Efeito do andaime de colágeno com células da fração vascular estromal derivadas de tecido adiposo na cicatrização de feridas diabéticas: um estudo em um modelo suíno diabético.Eng. de Tecidos Regenerar. Med.2013, 10, 192–199. [CrossRef] 

11. Falanga, V.; Sabolinski, M. Uma construção de pele viva de duas camadas (APLIGRAF®) acelera o fechamento completo de úlceras venosas de difícil cicatrização.Regeneração de Reparação de Feridas.1999, 7, 201–207. [CrossRef] 12. Hart, CE; Loewen-Rodriguez, A.; Lessem, J. Dermagraft: Uso no tratamento de feridas crônicas.Adv. Tratamento de feridas.2012, 1, 138–141. [CrossRef] [PubMed] 13. Dinh, TL; Veves, A. A eficácia de Apligraf no tratamento de úlceras de pé diabético.Plástico. Reconstr. Cirurg.2006, 117, 152S–157S. [CrossRef] [PubMed]

14. Eaglstein, WH; Falanga, V. Engenharia de tecidos e o desenvolvimento do Apligraf®, um equivalente da pele humana.Clin. Lá.1997, 19, 894–905. [CrossRef] 

15. Jiang, T.; Xu, G.; Wang, Q.; Yang, L.; Zheng, L.; Zhao, J.; Zhang, X. In vitro, a expansão prejudicou a haste das células-tronco mesenquimais de passagem precoce para o tratamento de defeitos da cartilagem.Doença da Morte Celular2017, 8, e2851. [CrossRef] [PubMed]

16. Liu, J.; Ding, Y.; Liu, Z.; Liang, X. Senescência em células-tronco mesenquimais: alterações funcionais, mecanismos moleculares e estratégias de rejuvenescimento.Frente. Célula Dev. Biol.2020, 8, 258. [CrossRef] [PubMed] 

17. Wang, W.; Xu, X.; Li, Z.; Lendlein, A.; Ma, N. Engenharia genética de células-tronco mesenquimais por entrega de genes não virais.Clin. Hemorreol. Microcirc.2014, 58, 19–48. [CrossRef] 

18. Deveza, L.; Choi, J.; Lee, J.; Huang, N.; Cooke, J.; Yang, F. A superexpressão de CXCR4 induzida por nanopartículas de polímero de DNA melhora o enxerto de células-tronco e a regeneração de tecidos em um modelo de isquemia de membro posterior de camundongo.Teranóstico2016, 6, 1176–1189. [CrossRef] [PubMed] 

19. O'Brien, FJ Biomateriais e andaimes para engenharia de tecidos.Mate. Hoje2011, 14, 88–95. 20. Yannas, I.; Tzeranis, D.; Harley, B.; Então, P. Andaimes à base de colágeno biologicamente ativos: Avanços no processamento e caracterização.Philos. Trans. R. Soc. Uma matemática. Física Eng. ciência2010, 368, 2123–2139. [CrossRef] 

21. Laiva, AL; Raftery, RM; Keogh, MB; O'Brien, FJ Impacto pró-angiogênico do SDF-1 andaimes baseados em colágeno ativado por gene na angiogênese dirigida por células-tronco.Int. J. Pharm.2018, 544, 372–379. [CrossRef] [PubMed] 

22. Lackington, WA; Raftery, RM; O'Brien, FJ Eficácia in vitro de um conduto de orientação nervosa ativado por gene que incorpora nanopartículas PEI-pDNA não virais que transportam genes que codificam para NGF, GDNF e c-Jun.Acta Biomater.2018, 75, 115–128. [CrossRef] 

23. Tierney, EG; Duffy, GP; Hibbitts, AJ; Cryan, SA; O'Brien, FJ O desenvolvimento de matrizes não virais ativadas por genes para regeneração óssea usando polietilenoimina (PEI) e andaimes à base de colágeno.J. Controle. Liberar2012, 158, 304–311. [CrossRef] [PubMed] 24. Laiva, AL; O'Brien, FJ; Keogh, MB SDF-1 O andaime de colágeno ativado por gene impulsiona a diferenciação funcional das células de Schwann humanas para aplicações de cicatrização de feridas.Biotecnologia. Bioeng.2021, 118, 725–736. [CrossRef] [PubMed]