Fatores funcionais antienvelhecimento e mecanismo de Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Resultado

3.1 Potenciais ingredientes ativos e alvos da Cistanche deserticola

Ao revisar a literatura e combinar com pesquisas anteriores deste grupo de pesquisa, 12 componentes químicos, incluindo glicosídeos de feniletanol, iridóides e lignanas, foram selecionados como compostos alvo para pesquisa em farmacologia de rede. As informações específicas são mostradas na Tabela 3. Após a remoção das duplicatas do banco de dados, foi obtido um total de 86 alvos para 12 ingredientes ativos potenciais.

Cistanche de alta qualidade para anti-envelhecimento

3.2 Metas relacionadas com o envelhecimento

7.753 e 295 alvos relacionados ao envelhecimento foram coletados nos bancos de dados GeneCards e OMIM, respectivamente.

3.3 Alvos comuns de medicamentos e doenças e construção de rede PPI

A interseção de alvos de medicamentos e alvos de doenças resultou em 75 alvos de interseção, que foram importados para a plataforma de análise de rede STRING, nós não conectados na rede foram ocultados e uma rede PPI foi construída. Veja materiais de publicação aprimorados. Há um total de 45 nós e 59 conexões na rede PPI. Oito alvos principais foram selecionados através de análise topológica, conforme mostrado na Tabela 4.

3.4 Análise de enriquecimento GO e análise de enriquecimento KEGG

Através do banco de dados OmicsBean, os alvos principais foram submetidos ao enriquecimento funcional GO e à análise da via KEGG. A análise GO inclui três aspectos: componente celular, função molecular e processo biológico. Os 10 principais itens com o menor valor P são mostrados no material de publicação aprimorado. Os resultados mostram que os processos biológicos envolvem principalmente a regulação do metabolismo reativo do oxigênio, a regulação positiva das respostas imunes, a localização de proteínas em organelas, a digestão de polissacarídeos, etc.; os componentes celulares incluem principalmente o sistema endomembranar, a região extracelular, a membrana plasmática e as células ligadas à membrana.

Órgãos, corpos secretores extracelulares, aparelho de Golgi, etc.; as funções moleculares estão principalmente relacionadas à atividade da glucosidase, atividade reguladora da óxido nítrico sintase, ligação de carboidratos, atividade da -frutose furanosidase, etc. Um total de 27 vias relacionadas ao envelhecimento foram obtidas através da triagem de enriquecimento KEGG, e as 20 principais vias foram atraídas para uma via diagrama de bolhas (veja materiais de publicação aprimorados). Cistanche deserticola retarda o envelhecimento.

Tabela 3 Ingredientes ativos de Cistanche deserticola

Tabela 4: Objetivos principais da Cistanche deserticola para retardar o envelhecimento

Envolve principalmente vias de câncer, sistemas neurossecretores e vias de transdução de sinal. As vias do câncer incluem principalmente câncer de próstata, câncer de mama e outras vias; o sistema neuroendócrino envolve a via de sinalização do estrogênio, a via de sinalização do GnRH e a via de sinalização da insulina (via de sinalização da insulina) e assim por diante; as vias de sinalização incluem a via de sinalização fosfatidilinositol 3-quinase-proteína quinase B (PI3K Akt) e a via de sinalização da fosfolipase D (via de sinalização da fosfolipase D).

3.5 Construção de redes de materiais medicinais-componentes-alvos-vias

Os ingredientes ativos, alvos e vias da Cistanche deserticola que retardam o envelhecimento foram mapeados na rede material medicinal-ingrediente-alvo-via por meio do software Cytoscape 3.8.0. Há um total de 114 nós e 218 linhas nesta rede (ver material de publicação aprimorado).

3.6 Efeito da Cistanche deserticola na expectativa de vida dos nematóides

Os resultados dos testes de toxicidade são mostrados na Figura 1. Comparado com o grupo controle, Cistanche deserticola 25 e 50 ug·mL–1

Pode prolongar a vida útil dos nematóides. 100 ug·mL–1 não tem efeito óbvio. 200 e 500 ug·mL–1

Tem certa toxicidade para nematóides e encurta sua vida útil. Com base nos resultados do teste de toxicidade, selecione

Cistanche deserticola foi administrada em concentrações de massa de 25, 50, 75 e 100 ug·mL–1 para determinar a vida útil dos nematóides N2. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Comparado com o grupo controle, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

A expectativa de vida dos nematóides no grupo foi significativamente estendida, então os experimentos subsequentes foram conduzidos com 25, 50 e 75 ug·mL–1.

Figura 1 Curva de sobrevivência de nematóides após administração de diferentes concentrações mássicas de Cistanche deserticola

• Lenda:

• Vermelho: Grupo de Controle
• Azul: Grupo Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Verde: Grupo Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Roxo: Grupo Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Laranja: Grupo Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Marrom: Grupo Cistanche 500 µg·mL⁻¹

• Eixos:

• Eixo Y: Taxa de Sobrevivência (%)

• Eixo X: Tempo (t/d)

  
  

3.7 Efeito da Cistanche deserticola na capacidade de estresse dos nematóides

Sob condições de estresse oxidativo2-induzidas por H2O, em comparação com o grupo controle, a vida útil dos nematóides no grupo de tratamento Cistanche deserticola foi prolongada (Figura 2A). A expectativa de vida média dos nematóides no grupo controle foi (1,44±0.07) h, e Cistanche deserticola 75 ug·mL– A expectativa de vida média dos nematóides no grupo 1 foi (2,02 ±0,05) h, e a vida útil foi significativamente estendida (P).<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabela 5 Efeito de diferentes concentrações de massa de Cistanche deserticola na vida útil dos nematóides (xˉ±s, n=100)

Observação:Comparado com o grupo controle, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Efeito da Cistanche deserticola no acúmulo de lipofuscina e na capacidade de flexão corporal dos nematóides

A lipofuscina acumula-se gradualmente com a idade. Em comparação com o grupo de controle, os níveis de fluorescência azul dos nematóides nos grupos Cistanche deserticola 25, 50 e 75 ug·mL–1 diminuíram em 15,09%, 28,7% e 39,{9}}%, respectivamente. no 7º dia (Figura 3A~B); No 11º dia, os níveis de fluorescência azul diminuíram em 8,55%, 22,36% e 36,84% respectivamente, indicando que Cistanche deserticola inibiu o acúmulo de lipofuscina.

O efeito da Cistanche deserticola na capacidade de flexão corporal dos nematóides é mostrado na Figura 3C. Comparado com o grupo controle, o número de tempos de flexão corporal dos nematóides no grupo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 aumentou 25% e 36% em 30 segundos nos dias 3 e 7, respectivamente. 17%, indicando que Cistanche deserticola pode promover a flexão corporal dos nematóides.

3.9 Efeito da Cistanche deserticola na capacidade de deglutição e capacidade reprodutiva de nematóides

Nos dias 3 e 7, em comparação com o grupo controle, não houve diferença estatisticamente significativa na taxa de bombeamento faríngeo (número de bombas faríngeas em 60 s) dos nematóides no grupo de administração de Cistanche deserticola (Figura 4A), indicando que Cistanche deserticola não alterou a taxa de bombeamento faríngeo dos nematóides N2. A ingestão de alimentos e os efeitos de longevidade mediados pela Cistanche deserticola não dependem da restrição alimentar. Não houve alterações significativas no número de ovos (Figura 4B) e no número de descendentes (Figura 4C) dos nematóides tratados com a droga em comparação com o grupo controle, indicando que Cistanche deserticola não afetou a capacidade reprodutiva dos nematóides.

3.10 Efeito da Cistanche deserticola nas ROS, conteúdo de MDA e atividade de enzimas antioxidantes

A toxicidade do estresse agudo resulta em níveis aumentados de ERO. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, em comparação com o grupo controle, o nível de acúmulo de ROS de nematóides no grupo Cistanche deserticola foi significativamente reduzido no 7º dia de administração (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Lenda:

• Vermelho: Grupo de Controle
• Azul: Grupo Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Verde: Grupo Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Roxo: Grupo Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Laranja: Grupo Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Marrom: Grupo Cistanche 500 µg·mL⁻¹

3.11 Efeito da Cistanche deserticola na expressão de mRNA de genes relacionados ao envelhecimento

A via de sinalização da insulina (IIS) entre as 20 principais vias analisadas pelo KEGG está intimamente relacionada ao envelhecimento de C. elegans, e a pesquisa do mecanismo é relativamente madura [10], verificando assim a expressão de genes relacionados ao envelhecimento na via de sinalização da insulina. Peptídeos semelhantes à insulina (ILPs) liberados em C. elegans se ligam ao seu receptor DAF-2 e ativam o produto final de glicação avançada-1 (AGE-1), que ativa ainda mais a proteína quinase B{{ 7}}/2 (Akt-1/2). , fosforilando o fator de transcrição DAF-16, resultando em atividade DAF-16 e

Sua migração para o núcleo é inibida [11]. Conforme mostrado na Figura 6, em comparação com o grupo controle, os níveis de expressão de mRNA DAF-2, AGE-1 e Akt-1 em nematóides na Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 grupo foram significativamente reduzidos (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Foi demonstrado que o efeito de prolongamento da vida mediado pela Cistanche deserticola depende da via de sinalização do IIS. O gene sir-2.1 desempenha um papel importante em atividades fisiológicas, como envelhecimento de nematóides, estresse e apoptose. A regulação positiva da expressão do gene sir-2.1 prolongará a vida útil dos nematóides [12], mas não há efeito após a administração do medicamento. Alterou significativamente o nível de expressão de SIR-2. 1 mRNA (Figura 6). HSF-1 e SKN-1 desempenham um papel importante na regulação do estresse oxidativo e do envelhecimento em C. elegans [11]. Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo controle, Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

Os níveis de expressão de HSF-1, HSP-16. 1, PAS-16. 2 e SKN -1 mRNA no grupo C. elegans foram significativamente aumentados (Figura 6). Os fatores de transcrição DAF-16/forkhead box protein (FOXO) e SKN-1/fator de transcrição nuclear E2-fator 2 relacionado (Nrf2) são ativados e podem regular muitos genes que codificam antioxidantes relacionados proteínas [13]. Comparado com o grupo de controle, os níveis de expressão de mRNA de SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 e MTL-1 de nematóides no O grupo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 aumentou significativamente, indicando que Cistanche deserticola pode aumentar a capacidade antioxidante. prolongar sua vida. A restrição alimentar pode melhorar a função mitocondrial e prolongar a vida útil, limitando a ingestão de alimentos [14]. Não houve diferença estatisticamente significativa na expressão do mRNA do EAT -2 nos nematóides de cada grupo, indicando que o efeito de prolongamento da vida mediado pela Cistanche deserticola não ocorre através da via de restrição alimentar (Figura 6).

Figura 4 Efeito da Cistanche deserticola na capacidade de deglutição e capacidade reprodutiva de nematóides (xˉ±s, n=5)

Lenda:

• 对照组: Grupo de controle
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 75 ug/mL

Gráfico B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Distância de natação horizontal em 30 segundos/tempo
• Dia 3: Dia 3
• Dia 7: Dia 7

Gráfico C:

• 相关水平的百分率: Porcentagem do nível correspondente
• Dia 7: Dia 7
• Dia 11: Dia 11

Gráfico A:

• 60 s内爬壁次数: Número de subidas de paredes em 60 segundos
• 第{{0}}日: Dia 0
• Dia 3: Dia 3
• Dia 7: Dia 7

Gráfico B:

• 广泛测试得分: Pontuação do teste de campo aberto
• 1º dia: Dia 1
• Dia 2: Dia 2
• Dia 3: Dia 3
• Dia 4: Dia 4
• Dia 5: Dia 5

Gráfico C:

• 千元迷宫次数: Erros do labirinto em Y
• 1º dia: Dia 1
• Dia 2: Dia 2
• Dia 3: Dia 3
• Dia 4: Dia 4
• Dia 5: Dia 5

3. 12 Efeito da Cistanche deserticola na vida útil de nematóides com genes mutantes relacionados

Em comparação com o grupo de controle, a curva de vida útil dos nematóides mutantes dos genes daf{{0}}, skn-1 e hsf-1 no grupo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 fez não se desloca significativamente para a direita após o tratamento (Figura 7A~C). A expectativa de vida média dos nematóides mutantes do gene -2 aumentou em 16,45% (P <0,001, Figura 7D).

Os resultados mostraram que o efeito de prolongamento da vida mediado pela Cistanche deserticola estava relacionado aos genes daf-16, hsf-1 e skn-1, mas não ao gene eat-2 .

3. 13 Efeito da Cistanche deserticola na translocação nuclear das proteínas DAF-16 e SKN-1

Imagens representativas da expressão da proteína DAF-16 no citoplasma, espaço intercelular e núcleo são mostradas na Figura 8A. Em comparação com o grupo controle, a razão de localização nuclear da proteína DAF-16 em nematóides foi significativamente aumentada e a razão de localização citoplasmática foi significativamente reduzida após a administração de Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Figura 5 Efeitos da Cistanche deserticola nas ROS, conteúdo de MDA e atividade de enzimas antioxidantes em nematóides (xˉ±s, n=100)

Lenda:

• 对照组: Grupo de controle
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Grupo Cistanche 75 ug/mL

Gráfico B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Distância de natação horizontal em 30 segundos/tempo
• Dia 3: Dia 3
• Dia 7: Dia 7

Gráfico C:

• 相关水平的百分率: Porcentagem do nível correspondente
• Dia 7: Dia 7
• Dia 11: Dia 11

Gráfico A:

• 60 s内爬壁次数: Número de subidas de paredes em 60 segundos
• 第{{0}}日: Dia 0
• Dia 3: Dia 3
• Dia 7: Dia 7

Gráfico B:

• 广泛测试得分: Pontuação do teste de campo aberto
• 1º dia: Dia 1
• Dia 2: Dia 2
• Dia 3: Dia 3
• Dia 4: Dia 4
• Dia 5: Dia 5

Gráfico C:

• 千元迷宫次数: Erros do labirinto em Y
• 1º dia: Dia 1
• Dia 2: Dia 2
• Dia 3: Dia 3
• Dia 4: Dia 4

• Dia 5: Dia 5

  
  

3. 14 Efeito da Cistanche deserticola na expressão proteica de SOD-3, GST-4 e HSP-16.2 em nematóides

Os níveis de expressão proteica SOD-3, GST-4 e HSP-16.2 foram visualizados e quantificados usando nematóides transgênicos CF1553, CL2166 e TJ375, respectivamente (Figura 9). Comparado com o grupo controle, os níveis de expressão proteica de SOD-3 e GST-4 em nematóides em cada grupo de concentração em massa de Cistanche deserticola foram significativamente aumentados (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).