Efeitos antienvelhecimento do extrato de Piper Cambodianum Cistanche em células fibroblásticas dérmicas humanas normais e um modelo de cicatrização de feridas em camundongos Ⅱ

Cistancheextrair células NHDF protegidas dos efeitos da irradiação UV

As células da pele respondem rapidamente quando expostas a UV ou citocinas, como interleucina (IL)-4 e IL-13.19Após a exposição aos raios UV, vários fatores são estimulados, incluindo EGFR,20,21 TNFR,22quinases de proteína ativada por mitógeno (MAP), ERK e quinase amino-terminal c-Jun (JNK).23Tanto JNK quanto p38 fosforilam e ativam o fator de transcrição c-Jun, que, por sua vez, eleva c-Fos e aumenta os níveis da proteína ativadora do fator de transcrição-1,24que é necessário para a transcrição de MMPs. Esses receptores são ativados pela fosforilação da MAP quinase e outras proteínas a jusante.25As MAP quinases são ativadas pela fosforilação de resíduos específicos de treonina e tirosina.24,26A exposição à radiação ultravioleta leva à alta expressão de heterodímeros c-Jun e c-Fos, numerosas citocinas e fatores de crescimento, que são fosforilados por JNK e p38.27,28Da mesma forma, os níveis de proteína p53 foram elevados, começando de 2,5 horas a 24 horas após a exposição aos raios UV.29Demonstramos que as células expostas à irradiação UV por 24 horas expressaram os níveis de proteína TNFR1 e EGFR, que diminuíram de maneira dose-dependente quando as células foram tratadas comCistanche. Examinamos o efeito da radiação UV tanto na fosforilação quanto na atividade de p38 (Thr180/Tyr182). Os níveis de proteína de c-Jun e p53 foram reduzidos dramaticamente emCistanche- células tratadas (Figuras 4A e B).

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Cistanche extrai células de NHDF irradiadas com UV protegidas de ROS

A luz UVB estimula a produção de ROS,30,31e a exposição aos raios UV na pele produz ROS, como O2 ⋅−, H2 O2, e1 O2. 32Não tratado eCistanche- células tratadas foram submetidas a irradiação UV por 24 horas, e a geração de ROS foi medida por separação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Figura 3Regulação das proteínas da MEC emCistanchecélulas tratadas.Notas: (A) Células de NHDF foram tratadas comCistanchepor 24 horas. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunoblotting usando anticorpos anti-colágeno, anti-elastina, anti-MMP-3 e anti-ERK-2. Os resultados são representativos de três experimentos independentes. (B) Actina, colágeno, elastina, MMP-3 e ERK-2 nos imunoprecipitados foram quantificados por Western blotting. As alturas das barras são as respectivas médias± SDs de três experimentos independentes. *P,0.05; **P,0.01. Abreviaturas:Conc, concentração; ECM, matriz extracelular; ERK, quinase regulada por sinal extracelular; MMP, metaloproteinase de matriz; NHDF, fibroblasto dérmico humano normal;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; SDs, desvios padrão.

Figura 4Cistanche inibir a produção de ROS em células irradiadas por UV.Notas: (A) Células de NHDF foram expostas à irradiação UV a 40 J por 180 segundos e tratadas comCistanchepor 24 horas. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransferência usando anticorpos anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 ou anti-p-JNK. Os resultados são representativos de três experimentos independentes. (B) Total e p38 fosforilado em tirosina, JUK, actina e TNFR6 nos imunoprecipitados foram quantificados por análises de Western. As alturas da barra são a média± SD de três experimentos independentes. *P,0.05; **P,0.01. Abreviaturas:Conc, concentração; EGFR, receptor do fator de crescimento epidérmico; JNK, quinase amino-terminal c-Jun; JNK, c-Jun N-terminal quinase; NHDF, fibroblasto dérmico humano normal;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, espécies reativas de oxigênio; DP, desvio padrão; TNFR, receptor do fator de necrose tumoral; UV, ultravioleta.

A irradiação UV aumentou a produção de ROS, enquantoCistanche extrato diminuiu a produção de ROS em células NHDF. Os níveis de ROS de H2 O2 foram medidos usando os permeantes celulares 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (CM-H2 DCFDA) (Figura 5A). A irradiação UV aumentou os níveis de ROS de H2 O2 , enquanto os níveis de ROS foram reduzidos emCistanche extrair de maneira dose-dependente (Figura 5B). Esses resultados indicaram queCistancheO extrato protege os fibroblastos dérmicos da irradiação UV, reduzindo a geração de ROS.

Observação macroscópica da cicatrização de feridas em camundongos

Feridas foram criadas nas costas de camundongos e depois tratadas comCistancheextrair (0, 1, 10 e 50µg/mL); as áreas da ferida foram medidas todos os dias durante 4 dias. No dia 4, as áreas ao redor das feridas emCistanchecamundongos -tratados mostraram diminuição da vermelhidão de uma maneira dependente da dose em comparação com áreas de feridas não tratadas (Figura 5). As áreas de feridas tratadas com extrato eram menores do que as áreas de feridas não tratadas, mostrando um padrão dose-dependente. No dia 4, as áreas da ferida tratadas com 50µg/mL deCistancheforam completamente cobertos por novo epitélio. Nenhuma área da ferida foi infectada (Figura 6A e B). As proporções de áreas de feridas nos dias 0 e 4 foram calculadas (Figura 6C).

Discussão

O uso de materiais fitoterápicos e diferentes partes de plantas vem aumentando com os concomitantes avanços da fitoterapia. Os materiais fitoterápicos têm sido usados ​​em várias formas, como drogas mono ou poliervas, suplementos dietéticos e ingredientes dietéticos, e muitos se tornaram produtos comerciais bem conhecidos e seguros.33Várias plantas, incluindoCistanche, foram investigados por suas potenciais propriedades farmacológicas, mas nenhum estudo comparativo foi realizado anteriormente comCistanche extrair. Este estudo foi realizado para determinaros efeitos deCistanche extrato em atividades de cicatrização de feridas usando modelos de feridas de incisão em camundongos. A cicatrização de feridas envolve o restabelecimento da integridade tecidual por meio de processos associados aos estágios de inflamação, proliferação e remodelação.34 A fase de remodelação da pele é caracterizada pela reformulação e reforma dos componentes das fibras colágenas que melhoram a resistência tênsil.35O processo de cicatrização é regulado principalmente pela biossíntese e deposição de novo colágeno e subsequente maturação.36Em nosso estudo de feridas,Cistanche extrato mostrou maior efeito de cicatrização de feridas em comparação com o controle (Figuras 1C e 6). Tal cicatrização pode ser devida ao aumento da concentração de colágeno e estabilização das fibras. No processo de reparo tecidual, as células inflamatórias potencializam a migração e proliferação das células endoteliais, levando à neovascularização das células do tecido conjuntivo que sintetizam matrizes extracelulares, incluindo colágeno e queratinócitos, resultando na reepitelização do tecido ferido.37A taxa de contração mais rápida da ferida pode aumentar a comunicação intracelular das junções comunicantes nos fibroblastos e aumentar a maturação mais rápida do tecido de granulação.38No modelo de ferida de incisão, camundongos tratados comCistancheextrato mostrou cicatrização mais rápida em comparação com os controles (Figura 6). Numerosos estudos revelaram que a regulação negativa da via p38 quinase protege várias linhagens celulares que expressam p53-tipo selvagem do estresse genotóxico.39,40Nossos dados mostraram que a expressão de p38 em células irradiadas com UV foi regulada negativamente porCistanche tratamento. Portanto,Cistanche extrato obtido de folhas e caules demonstrou tratamento eficaz na cicatrização de feridas.Cistancheextrato diminuiu a produção de ROS da irradiação UV ao eliminar ROS em células NHDF (Figuras 5A e B). Além disso,Cistancheextrair cicatrização acelerada de feridas após irradiação da pele ((Figura 6A-C). Esses resultados sugerem queCistanche O extrato protege a pele dos danos da irradiação UV e pode ser útil como uma nova matéria-prima em aplicações cosméticas.

Figura 5Cistancheinibição mediada da produção de ROS em células irradiadas por UV.Notas: (A) As células foram tratadas com irradiação UVB (40 J) pelo tempo indicado e depois incubadas com 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato por 30 minutos. A geração de ROS foi medida por FACS. (B) As células foram expostas a UVB (40 J) por 180 segundos e tratadas com a concentração indicada deCistanchepor 24 horas. A produção de ROS foi estimada com a coloração de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato e analisados ​​por FACS.Abreviaturas:FACS, seleção celular ativada por fluorescência; FITC, isotiocianato de fluoresceína; NHDF, fibroblasto dérmico humano normal;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, espécies reativas de oxigênio; UV, ultravioleta; UVB, ultravioleta B.

Figura 6Efeitos de cicatrização de feridas na pele de camundongos prejudicados.Notas: (A) Ferimentos de 5-mm de diâmetro foram criados na pele dorsal de 7-camundongos machos C57Bl/6 de uma semana (n=3). A recuperação das feridas foi avaliada comCistanchetratamento nas diferentes concentrações (controle negativo e tratamento pós-ferida comCistancheem 1, 10 e 50µg/mL). (B) A área da ferida foi determinada medindo o diâmetro das feridas abertas. (C) A área da ferida foi calculada usando a dimensão das feridas abertas; *P,0.05; **P,0.01. Abreviaturas:Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn; Conc, concentração.

Conclusão

Este estudo investigou opotenciais efeitos anti-envelhecimento e cicatrização de caule Cistanche e extrato de folhaem células NHDFe um modelo de camundongo de cicatrização de feridas. Otratamento de células NHDF com Cistanche extratospromove a recuperação da área riscadade uma maneira dependente da dose, bem como o aumento da expressão do gene ECM. Além disso, Cistancheextratosforam capazes deproteger a célula da exposição aos raios UV, reduzindo a produção de ROS. Finalmente, essas observações são avaliadas e confirmadas nos camundongos modelo para cicatrização de feridas in vivo. Portanto,O extrato de Cistanche representa um novo agente terapêutico promissor para o tratamento antienvelhecimento e cicatrização de feridas.

Agradecimentos:Este estudo foi financiado pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação (NRF-2014R1A1A3050752). Os autores gostariam de agradecer ao Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB) por fornecer aosCistancheextratos.

Divulgação Os autores não relatam conflitos de interesse neste trabalho.

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