Dinâmica transcricional específica do álcool de reconsolidação e recaída de memória, parte 4

Além do Arc, descobrimos que os níveis de mRNA de Egr1, mas não de Bdnf, foram aumentados no DH e no mPFC pela recuperação da memória do álcool.

Com o passar do tempo, as pessoas gradualmente adquirem uma nova compreensão do mistério do esquecimento. Nesse processo, uma nova tecnologia de recuperação de memória tornou-se gradualmente um ponto importante de pesquisa.

Então, existe uma relação entre a recuperação da memória do álcool e o desempenho da memória? Venha dar uma olhada agora! Em primeiro lugar, precisamos ser claros: a recuperação da memória sobre o álcool não é uma tecnologia separada. É uma tecnologia que afeta os neurônios cerebrais através do álcool. Este processo pode ativar algumas memórias “adormecidas” no cérebro, permitindo-nos refrescar essas memórias.

Em segundo lugar, precisamos de saber que melhorar a memória não nos permite simplesmente “lembrar” mais coisas, mas é um processo de recuperação e reconstrução de memórias de diferentes maneiras. Este processo pode nos ajudar a consolidar e compreender melhor o conhecimento que aprendemos, melhorando assim a nossa memória.

Portanto, podemos concluir que existe uma relação entre a recuperação da memória sobre o álcool e o desempenho da memória. Quando utilizamos esta tecnologia para reextrair memórias anteriores após beber álcool, estamos a passar por um processo de reconsolidação dessas memórias, melhorando até certo ponto a nossa memória.

É claro que também devemos observar que a recuperação da memória do álcool não é uma técnica duradoura e confiável para melhorar a memória. Se quisermos ter uma memória excelente por muito tempo, precisamos consolidar e melhorar continuamente a nossa memória através do estudo diário e da vida, combinado com outras técnicas de treinamento da memória.

Neste processo, precisamos manter sempre uma atitude otimista, para melhor estimular a nossa motivação de aprendizagem e o potencial de memória. Portanto, vamos enfrentar ativamente o treinamento da memória, sermos nós mesmos incessantemente e avançar com coragem no caminho da melhoria contínua da memória! Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Estas substâncias são muito importantes para a memória e a aprendizagem. Além disso, a carne também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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O aumento da expressão de mRNA de Egr1 foi previamente implicado na reconsolidação de medo e memórias de drogas [19, 21, 48, 61], levantando a possibilidade de que esse fator de transcrição também desempenhe um papel na reconsolidação de memórias de álcool.

Embora o papel do Bdnf na reconsolidação da memória permaneça controverso [19, 49], a indução do Bdnf é conhecida por ser crucial para a aquisição de memória e aprendizagem de extinção [19, 62]. Assim, a falta de mudança na expressão de Bdnf em nosso estudo poderia sugerir que nosso procedimento de recuperação de memória não iniciou o aprendizado de extinção em paralelo com a recuperação de memória.

Além disso, relatamos recentemente que, embora os níveis de mRNA de Bdnf no DH não sejam aumentados pela recuperação da memória alcoólica per se, a expressão do fator de crescimento foi elevada quando a recuperação é seguida por contracondicionamento aversivo que preveniu a recaída (44), sugerindo um papel complexo do Bdnf. na dinâmica da memória do álcool.

Nossas descobertas indicam que os aumentos na expressão de IEG não são exclusivos da reconsolidação de memórias relacionadas ao álcool.

Na verdade, ARC e EGR1 foram previamente implicados na consolidação de vários tipos de memórias, incluindo memórias de medo [19, 46, 47, 62], memórias de reconhecimento [21] e memórias associadas a diferentes drogas de abuso [20, 22, 61].

No entanto, também há evidências crescentes de que alguns dos mecanismos subjacentes à busca pelo álcool podem diferir daqueles que controlam a busca natural por recompensas [5, 27, 28, 63]. Além disso, há evidências de que as memórias para diferentes recompensas (e para diferentes drogas, em particular) são processadas diferentemente [29–32]. Nossos resultados de análise de RNAseq de fato revelaram a assinatura transcriptômica única induzida pela recuperação da memória do álcool.

Especificamente, encontramos 44 genes no DH e um conjunto diferente de 9 genes no PFC, que mostraram alterações significativas após a recuperação da memória do álcool. Após validação adicional dos dados, focamos em um gene no mPFC (Fkbp5) e três genes no DH (Adcy8, Scl8a3 e Neto1) e descobrimos que sua expressão não foi afetada pela recuperação de memórias associadas à sacarose.

Isto sugere que, ao contrário de Arc e Egr1, estes 4 genes específicos provavelmente não desempenham papéis gerais no processamento de memórias de recompensa, mas podem desempenhar papéis seletivos no processamento de memórias de álcool.

Curiosamente, esses quatro genes foram previamente implicados no transtorno por uso de álcool, no aprendizado e na memória. Assim, Fkbp5 codifica a Proteína de Ligação FK506 5, um regulador do sistema neuroendócrino de estresse [64].

As variantes do FKBP5 modulam a gravidade da síndrome de abstinência alcoólica [65] e predizem a propensão ao consumo excessivo de álcool em humanos [66–68]. Foi demonstrado que a deleção de Fkbp5 aumenta a gravidade da abstinência de álcool [65] e o consumo de álcool [67] em camundongos, enquanto a inibição farmacológica da proteína reduziu o consumo moderado de álcool e a reintegração de CPP em camundongos [69] e reduziu o consumo de álcool em ratos machos estressados ​​[70].

Os níveis de mRNA Adcy8, que codifica a adenilatociclase 8 (AC8) que catalisa a formação de AMPc em resposta ao influxo de cálcio e recentemente marcado como um possível regulador da ingestão de álcool [28, 71], foram diminuídos nas células sanguíneas de alcoólatras abstinentes de longo prazo [72].

Foi demonstrado anteriormente que a deleção de Adcy8 reduz o consumo de álcool e aumenta a sensibilidade aos efeitos sedativos do álcool em camundongos [73]. Além disso, a exposição crônica ao álcool em ratos regulou positivamente a expressão cerebral da família 8 de transportadores de soluto (trocador de sódio / cálcio), membro 3 (NCX3), a proteína codificada por Scl8a3 (74, 75).

O consumo de álcool em ratos também foi associado à redução da expressão de Neto1 no tronco cerebral [76], que codifica a neuropilina tollóide-like 1 (NRP1), um componente do complexo receptor NMDA [77].

Esta proteína está envolvida na organização e transmissão sináptica no hipocampo [78] e é necessária para aprendizagem espacial e memória [77].

Assim, nossos achados mostram que a mera recuperação de memórias do álcool, mesmo sem quaisquer efeitos farmacológicos do álcool, afeta a expressão desses genes. No entanto, o seu papel específico na reconsolidação e recaída da memória do álcool ainda precisa ser testado.

Uma limitação do presente estudo é que o ensaio de RNA-seq foi realizado nos tecidos mPFC e DH em massa, em vez de em células individuais ativadas pela recuperação de memória. Especificamente, estudos recentes sugeriram que as memórias em geral [79, 80], e especificamente as memórias relacionadas ao álcool [32, 81, 82], são codificadas através da ativação de conjuntos neuronais compostos por um pequeno número de neurônios, que podem ser identificados através de marcadores de ativação neuronal ( por exemplo, cFOS) [80].

De fato, padrões semelhantes de ativação de IEG (cFOS) pela recuperação de álcool condicionado por operante e memórias de recompensa doce foram encontrados no mPFC e em regiões mesolímbicas adicionais no cérebro de ratos [32, 81]. Assim, é possível que a realização seletiva do ensaio de RNA-seq no conjunto neuronal ativado pela recuperação de memória teria produzido resultados mais precisos.

Em resumo, nossas descobertas sugerem que a recuperação da memória do álcool induz dois programas de transcrição paralelos. Um programa, transmitido através de mecanismos moleculares comuns de aprendizagem e memória, incluindo os IEGs Arc e Egr1, está envolvido na consolidação de memórias, em geral.

O outro programa de transcrição, lançado pela recuperação da memória do álcool, é controlado por genes que promovem especificamente comportamentos relacionados ao álcool. Este modelo de processamento duplo para memórias de álcool levanta a possibilidade de que a reconsolidação de memórias para diferentes memórias possa ter mecanismos moleculares de processamento duplo semelhantes, com alguns componentes compartilhados por múltiplas memórias e outros exclusivos para cada tipo de memória.

Este modelo hipotético ainda precisa ser avaliado testando se a manipulação desses genes afeta diferencialmente a reconsolidação da memória do álcool e da sacarose. Se assim for, sugeriria que pode ser possível visar alvos moleculares específicos de recompensa para tratar distúrbios relacionados com memórias patogénicas, como a dependência, em vez de perturbar os principais mecanismos moleculares essenciais para muitas funções para além da reconsolidação da memória do álcool.

MATERIAIS E MÉTODOS

Consulte Informações Suplementares para obter detalhes sobre o aparelho, medicamentos e reagentes, projeto e preparação de oligodesoxinucleotídeos (ODN), análises de westernblot e qRT-PCR e preparação da biblioteca de RNA-seq.

Animais

Camundongos C57BL/JRccHsd machos e fêmeas (25–30 g), alojados em 3–4/gaiola, foram criados no Centro Animal da Universidade de Tel-Aviv (Israel) e mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12 horas (luzes acesas às 7h), com comida e água disponíveis ad libitum.

Em experimentos envolvendo condicionamento de local com sacarose, o acesso aos alimentos foi restrito por 6 horas antes das sessões de treinamento para aumentar a motivação dos ratos para coletar pellets de sacarose. Esta curta duração de privação alimentar baseia-se nas descobertas de que durante o dia, um jejum de 2 a 6 horas não afeta o comportamento alimentar [83] e não desencadeia uma mudança significativa nos marcadores metabólicos [84], minimizando assim os efeitos da restrição alimentar por si só. .

Os ratos foram pesados ​​duas vezes por semana para controlar a perda de peso. Todos os protocolos experimentais foram aprovados e em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Tel Aviv e com as diretrizes do NIH (número de garantia de bem-estar animalA5010-01). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados.

Procedimentos comportamentais

Condicionamento de local

Preferência de local condicionado ao álcool (CPP): Todos os ratos foram habituados a injeções diárias de solução salina ip durante 3 dias.

Teste de linha de base (dia 1): No primeiro dia, a porta deslizante foi retraída e os ratos foram autorizados a explorar livremente todo o aparelho por 30 min. Condicionamento com álcool (dias 2 a 9): O treinamento começou 24 horas após o teste de linha de base com uma sessão administrado por dia durante 8 dias, com a porta deslizante fechada. Nos dias 3, 5, 7 e 9, os camundongos receberam álcool (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) e foram imediatamente confinados ao compartimento pareado por 5 min.

Foi demonstrado anteriormente que esta dose e duração do condicionamento produzem CPP induzida por álcool [42, 85]. Nos dias alternados (ou seja, dias 2, 4, 6 e 8), os camundongos receberam solução salina e foram confinados ao compartimento não pareado pelo mesmo período do dia de condicionamento com álcool.

Os compartimentos pareados foram contrabalançados. Teste de preferência de local 1 (dia 10): O teste de preferência de local foi descrito para o teste de linha de base e serviu para indexar álcool-CPP [41]. A preferência foi definida como um aumento na porcentagem de tempo gasto no compartimento pareado com álcool durante o teste de preferência de lugar 1, em comparação com o teste de linha de base.

Recuperação de memória (dia 11): Antes desta fase, os camundongos foram atribuídos a diferentes condições experimentais (correspondidos para pontuações de CPP e sexo). Durante uma sessão de recuperação de memória, os ratos foram confinados ao compartimento pareado com álcool por 3 minutos e depois retornaram às suas gaiolas. Os ratos de controle foram manuseados brevemente. Teste de preferência de lugar 2 (dia 12): Os ratos foram submetidos a um teste de preferência de lugar idêntico ao teste de preferência de lugar 1.

Sacarose CPP: Pré-treinamento de sacarose (dias 1–6): Nos dias 1–3, os ratos foram habituados a coletar 5–6 pellets de sacarose (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, EUA) em gaiolas caseiras . Nos dias 4 a 6, os ratos foram treinados para coletar 3 pellets em uma caixa de acrílico vazia durante sessões de 30-minutos. Os ratos que coletaram menos de seis pellets (de um total de nove pellets durante os 3 dias) durante o treinamento com sacarose foram excluídos do experimento (2 ratos em 32).

Teste de linha de base (dia 7): No sétimo dia, a porta deslizante de uma câmara CPP foi retraída e os camundongos foram autorizados a explorar todo o aparelho por 30 min. Uma abordagem imparcial de aparelho/atribuição imparcial, conforme descrito no procedimento álcool-CPP, também foi adotada aqui. Condicionamento local com sacarose (dias 8 a 15): O treinamento começou 24 horas após o teste de linha de base com uma sessão por dia durante 8 dias, com o deslizamento Porta fechada. Nos dias 9, 11, 13 e 15, os camundongos foram colocados no compartimento pareado e, um minuto depois, três pastilhas de sacarose foram espalhadas no chão.
Os ratos foram devolvidos às suas gaiolas 15 minutos depois. Nos dias alternados (ou seja, dias 8, 10, 12 e 14), os camundongos foram colocados no compartimento não pareado por 15 min sem interferência.

Os compartimentos pareados foram contrabalançados. Teste de preferência de local 1 (dia 16): O teste de preferência de local foi descrito para o teste de linha de base e serviu para indexar sacarose-CPP. A preferência foi definida como um aumento na porcentagem de tempo gasto no compartimento pareado com sacarose durante o teste de preferência de lugar 1, em comparação com o teste de linha de base. Recuperação de memória (dias 17): O procedimento de recuperação de memória de sacarose foi idêntico ao procedimento de recuperação de memória de álcool (veja acima ).

Validação de oligodesoxinucleotídeo (ODN)

O projeto de ODN antisense de arco (AS-ODN) e ODN codificado (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) seguiu as diretrizes descritas anteriormente [56, 86].

Validação funcional Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) foi infundido no DH em um hemisfério, e SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}0,5 µl, 00,25 µl/min) foi infundido no outro hemisfério (os lados foram contrabalançados). Duas ou quatro horas depois, os ratos tratados exploraram um contexto desconhecido (compartimento CPP, ver descrição do aparelho, acima) durante 5 min para induzir a expressão de ARC dependente de novidade. Os camundongos foram eutanasiados uma hora depois (ou seja, 3 ou 5 horas após a infusão de ODN), os tecidos cerebrais foram coletados e os níveis de proteína ARC foram avaliados por análise de Western blot (Figura S4).

Cirurgia e microinfusão intra-hipocampalA cirurgia e as microinfusões foram realizadas conforme descrito anteriormente [42, 87].

Cirurgia. As cirurgias estereotáxicas foram realizadas sob anestesia com isoflurano. Os ratos foram colocados em uma estrutura estereotáxica (RWD Life Science, Shenzhen, China) e cânulas guia bilaterais (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) foram direcionadas ao DH em as seguintes coordenadas (−2mm posterior ao bregma, ±1,3 mm mediolateral, −1,45 mm ventral à superfície do crânio). As cânulas foram fixadas com acrílico dental. Cânulas falsas correspondentes (Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) foram inseridas nas cânulas-guia e cobertas com coletores de pó para manter o local do injetor coberto e livre de detritos. Os ratos foram autorizados a se recuperar por 7 a 10 dias antes do treinamento com álcool-CPP.

Infusões intra-hipocampais. Actinomicina D (4 µg/µl, 00,5 µl por lado, 00,25 µl/min, em DMSO) [19] ou um volume equivalente de veículo foi microinjetado no DH imediatamente após a recuperação da memória . Foi demonstrado que a infusão de actinomicina D no hipocampo em uma concentração semelhante interrompe a reconsolidação da memória [19]. Arc AS-ODN ou controle SCR-ODN (2nmol/µl, 0,5 μl/lado, 0,25 μl/min; em PBS) foi microinjetado no DH 4 hor 2 h antes ou 4 h após a recuperação da memória.

Após a remoção do copo de poeira e das cânulas falsas, a microinfusão foi conduzida durante 2 minutos em camundongos contidos e acordados, usando cânulas de injeção (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) estendendo-se 0 0,5 mm além da guia ponta da cânula. As cânulas de injeção foram deixadas no lugar por mais 2 min. Após a infusão, cânulas falsas foram inseridas nas cânulas-guia, fixadas com o coletor de pó, e os animais retornaram às suas gaiolas. As localizações das cânulas foram verificadas em cortes coronais de 30 μm de espessura de tecido fixado em paraformaldeído e corados com violeta de cresil.

Análise de dados

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75% do tempo passado em qualquer um dos compartimentos durante o teste inicial foram excluídos do estudo (9 de 267). O estabelecimento da PPC foi confirmado pela comparação dos escores de PPC entre o teste basal e o teste 1 de PPC e foi analisado por um teste t pareado. Como a expressão de CPP (ou seja, formação de memória) é necessária para a recuperação da memória, os dados de camundongos que não apresentaram CPP (um aumento mínimo de 5% na preferência entre a linha de base e o Teste 1) foram excluídos do experimento (48 de 258).

Álcool-CPP após interferência com a reconsolidação da memória foi analisada por uma ANOVA de modelo misto com um fator de tratamento entre indivíduos (Actinomicina D ou ODN) e um fator de teste dentro dos indivíduos (teste CPP 1, teste CPP 2). Interações significativas foram analisadas por um teste post hoc de Student – ​​Newman – Keuls. As densidades dos níveis de proteína ARC imunorreativa Western blotim foram normalizadas para aquelas de GAPDH e analisadas por uma ANOVA unidirecional com um fator de tratamento entre indivíduos, seguido pelo teste post hoc de Dunnett. Os dados de expressão de mRNA qRT-PCR foram normalizados para Gapdh e expressos como uma porcentagem de expressão de um grupo controle.

Os dados de todos os genes para cada região do cérebro foram analisados ​​por uma ANOVA unidirecional com um fator de tratamento entre indivíduos, seguido pelo teste de Dunnett para cada gene, para comparação com os dados obtidos de um grupo controle (sem recuperação). reunimos tecidos de 3 animais para cada réplica e preparamos o seguinte número de réplicas: 3 para o hipocampo dorsal (DH) - sem recuperação, 2 para recuperação de DH, 3 para o córtex pré-frontal (PFC) - sem recuperação e 2 para ( Recuperação PFC). Após o isolamento total do RNA com Trizol, bibliotecas de sequenciamento foram geradas usando o método que desenvolvemos (88).

As bibliotecas foram submetidas a sequenciamento de extremidade única de 50 pb com IlluminaHiseq 2000. Depois de confirmar a qualidade dos dados de sequenciamento por FastQC, as leituras foram mapeadas para o genoma de referência mm9 usando Bowtie2 (89) e anotadas com Tophat2 (90).

As leituras mapeadas para genes foram quantificadas porFeatureCounts (91). Excluímos Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a e o cromossomo mitocondrial para evitar contagens de genes superamplificados que poderiam distorcer a normalização da biblioteca, conforme descrito anteriormente (92). DESeq2 [58] foi usado para identificar genes diferencialmente expressos (DEG) no grupo Retrieval, em comparação com o grupo controle No Retrieval, com um valor p ajustado para significância (p(adj) < 0.05).

DISPONIBILIDADE DE DADOS Os dados RNA-seq estão disponíveis no NCBI Gene Expression Omnibus em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) com um token de revisor: knyfwwiorbutvuv.

REFERÊNCIAS

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