Vacina contra adenovírus contendo subunidade truncada da proteína S1 do SARS-CoV-2 Spike leva a uma resposta imunológica específica em camundongos

Resumoct:O desenvolvimento de uma vacina eficiente e segura contra a doença do coronavírus 2019 (COVID-19) é uma abordagem crucial para gerenciar a pandemia de doença respiratória aguda grave do coronavírus 2 (SARS-CoV-2) à luz das condições atuais. Neste estudo, produzimos um segmento encurtado do gene otimizado SARS-CoV -2 spike (2.043 pb, denominado S1) que foi capaz de codificar uma proteína S1 truncada. A proteína foi testada para determinar se poderia provocar uma imunização eficiente em camundongos contra o SARS-CoV-2. A presença da proteína S1 foi confirmada com imunofluorescência e Western blotting. Uma vacina de adenovírus contendo o fragmento do gene S1 (Ad-S1) foi administrada por via intramuscular a camundongos quatro vezes durante 4 semanas. A imunidade humoral da proteína S1 do SARS-CoV-2 foi demonstrada em todos os camundongos imunizados. O soro de camundongos imunizados demonstrou excelente atividade antiinfecciosa in vitro. Uma resposta imune humoral robusta contra SARS-CoV-2 foi observada em camundongos após a vacinação com Ad-S1, sugerindo que a vacina de adenovírus pode ajudar no desenvolvimento de vacinas contra SARS-CoV-2 e outras doenças geneticamente distintas vírus.

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Palavras-chave: SARS-CoV-2; vacinas; vetor adenoviral; gene S1; imunidade

1. Introdução

A doença por coronavírus 2019 (COVID-19) está frequentemente associada à falência de múltiplos órgãos e altas taxas de mortalidade [1] e representa uma grande ameaça à segurança pública em todo o mundo. Em 15 de julho de 2022, a pandemia-19 de COVID persistiu globalmente, com 557.917.904 casos confirmados, incluindo 6.358.899 mortes, relatados à Organização Mundial da Saúde (OMS). Além disso, um total de 12.130.881.147 doses de vacinas foram administradas até 11 de julho de 2022. Portanto, a conceção e o desenvolvimento de novas vacinas contra o coronavírus (nCoV) são de grande importância e uma das principais prioridades de saúde globais. A proteína S é um fator chave na entrada do SARS-CoV-2 coronavírus 2 da doença respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) nas células hospedeiras [2,3]. A proteína se liga ao receptor hospedeiro e permite que o vírus entre suavemente na célula hospedeira [4]. Os glicanos ligados a N projetam-se da superfície do trímero e decoram extensivamente a proteína S, afetando o dobramento da proteína S, a imunidade humoral e o processamento da protease da célula hospedeira [5]. A proteína S do SARS-CoV-2 tem menor densidade de glicanos ligados a N do que outras proteínas S induzidas por coronavírus patogênicos humanos [6]. Portanto, a proteína S pode ser altamente imunogênica e é um alvo importante de anticorpos neutralizantes. A proteína S possui três domínios estruturais, entre os quais o domínio S1 é o antígeno de superfície da proteína S mais importante [4]. Devido à dificuldade de produzir grandes proteínas recombinantes (o domínio extracelular da proteína S tem cerca de 1300 aminoácidos) e ao risco de aumento dependente de anticorpos (ADE) da infecção, S1 (cerca de 700 aminoácidos) e seu domínio de ligação ao receptor (RBD, cerca de 200 aminoácidos) são amplamente considerados como os alvos potenciais mais atraentes para uma vacina contra o coronavírus [7,8]. O adenovírus humano sorotipo 5 (HAdV-C5) é amplamente utilizado em virologia básica como terapia genética e vetor de entrega de vacina [9]. O HAdV-C5 possui diversidade natural e pode parasitar a maioria dos hospedeiros, o que constitui a base para o desenvolvimento de experimentos em animais. Vetores de adenovírus recombinantes com replicabilidade e defeitos de replicação construídos a partir de HAdV-C5 têm sido amplamente utilizados na distribuição de vacinas e terapia genética [9,10]. Atualmente, os adenovírus foram aprovados como vacinas contra infecções respiratórias agudas e tem havido muitos ensaios de tais vacinas, como para malária e HIV-1 [9]. Neste artigo, descrevemos uma vacina de vetor de adenovírus com deficiência de replicação humana SARS-CoV-2 e sua preparação e aplicação. Neste estudo a vacina de adenovírus foi construída da seguinte forma: o vetor era o adenovírus HAdV-C5 com replicação humana defeituosa com deleção E1 e E3 o plasmídeo esqueleto era o adenovírus recombinante com pBHGlox∆E13Cre a linha celular de empacotamento eram células HEK293 e o gene alvo foi o gene da proteína S1 truncado do SARS-CoV-2. A expressão da proteína S1 na vacina foi identificada por Western blot e ensaios de imunofluorescência. Para determinar a qualidade das respostas imunitárias induzidas pelas vacinas candidatas baseadas em espículas, a resposta de anticorpos pós-vacinação foi examinada detalhadamente. O benefício imunológico da vacina foi avaliado com um teste de anticorpos de ligação (ensaio imunoenzimático [ELISA]) e um teste de anticorpos de neutralização. Nossas descobertas fornecem a base para o desenvolvimento e avaliação de vacinas e tratamentos contra COVID-19 baseados na proteína S1.

2. Materiais e Método

2.1. Células e Animais

As linhas celulares de rim de macaco HEK293 e Vero E6 foram utilizadas neste estudo. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina a 37 ◦C com 5% de CO2 e umidade saturada. Vinte camundongos fêmeas C57BL / 6 (6-8 semanas) foram adquiridos no Centro Experimental de Animais de Zhejiang, província de Zhejiang. Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos com 10 ratos em cada grupo. Um grupo foi imunizado (injeção intraperitoneal de 100 µL) com um vetor Ad5 expressando a proteína spike SARS-CoV-2 (Ad5-S) e o outro com PBS (injeção intraperitoneal de 100 µL) como controle. A quantidade total de vírus foi de 5 x 109 VP. Todos os camundongos foram imunizados com injeção intramuscular D0/D14 [11,12]. No D14, foi coletado sangue periférico de 100 µL, o soro foi separado e a segunda injeção foi aplicada duas horas após a coleta do sangue. No D28, o sangue foi coletado por punção retro-orbital e o soro foi separado. Os anticorpos de ligação foram detectados 3 dias após cada coleta de sangue, os anticorpos neutralizantes foram detectados 7 dias após cada coleta de sangue e as citocinas foram detectadas 7 dias após a segunda coleta de sangue. Todos os ratos foram sacrificados; todos os testes foram conduzidos em estrita conformidade com as "Diretrizes para o cuidado e uso de animais experimentais da República Popular da China" e aprovados pelo Conselho de Ética da Universidade Zhejiang Shuren.

2.2. Vacinas

Todas as cepas de SARS-CoV-2 usadas neste estudo foram coletadas de pacientes com COVID-19 com consentimento. O Laboratório Chave do Estado para Diagnóstico e Tratamento de Doenças Infecciosas desenvolveu uma vacina de adenovírus (célula Vero, cepa WuHan, número GISAID: EPI_ISL_415711) contra SARS-CoV-2 e, em seguida, o A vacina foi fabricada em um ambiente compatível com o nível de biossegurança (BSL). A especificação da vacina é 0,5 mL/dose e contém Tris, NaCl, açúcar de cana, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, etanol absoluto e a proteína SARS-CoV-2 S1.

2.3. Construção de Adenovírus Recombinante

A sequência da proteína SARS-CoV-2 S1 (nº QRU91950.1) foi obtida no PubMed. De acordo com a degeneração do gene, a sequência de nucleotídeos de códons otimizada adequada para expressão em células de mamíferos foi projetada com base na premissa de que a sequência de aminoácidos da proteína do produto codificada pela proteína S1 do SARS-CoV-2 permaneceu inalterada. O comprimento total foi de 2.043 pb. A sequência precursora 50 foi sintetizada com ativador de plasminogênio tecidual (tPA) e a sequência que codifica o aminoácido 2–688 do SARS-CoV -2 S1 e a sequência precursora do tPA foram ligadas. Uma sequência Kozak e um sítio de restrição SpeI foram adicionados na frente do códon de início e o sítio de restrição XbaI foi adicionado após o códon de terminação. As sequências de nucleótidos dos genes acima foram sintetizadas e clonadas em pUC18 pela Sangon Biotech para obter o plasmídeo clonado do gene sintético. A sequência do gene S1 sintetizada e o vetor pDC316 foram digeridos com endonucleases de restrição SpeI e XbaI. O fragmento alvo e o vetor foram recuperados do gel e conectados para formar um plasmídeo transportador. O plasmídeo de transporte SARS-CoV -2 foi empacotado com o plasmídeo de esqueleto do sistema de adenovírus AdMax pBHGloxd∆E1 e 3Cre por co-transfecção de células HEK293. A solução primária de vírus foi obtida após repetidos congelamento-descongelamento e centrifugação, e o vírus foi amplificado e cultivado após purificação da placa.

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2.4. Determinação do título de adenovírus

Células HEK293 em boa saúde foram selecionadas e ressuspensas para preparar uma suspensão de células de 5,0 × 105 células/mL, que foi semeada em uma placa de 24-poços (1 mL/poço ) e cultivadas a 37 ◦C em ambiente com 5% de CO2. A amostra foi diluída em série dez vezes e uma amostra diluída (0,1 mL) de 10−5 a 10−8 células foi inoculada em uma placa de 24-poços . Em seguida, as placas foram expostas à infecção a 37 ◦C com 5% de CO2 por 48 horas. Posteriormente, o meio de cultura foi removido, foi adicionado metanol pré-resfriado (0,5 mL) e as amostras foram fixadas a -20 ◦C por 20 min. Após a fixação, as amostras foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloqueadas com albumina sérica bovina a 1% (BSA, 0,2 mL) a 37 ◦C por 1 h. Em seguida, os anticorpos primários (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) e secundários (Goat pAb to MS IgG2a (HRP), Abcam ab97245, 1:1000) foram adicionados e incubados por 1 h, durante a qual PBS foi usado para lavar. Após a incubação, uma solução de trabalho recém-preparada (0,2 mL) foi adicionada e incubada por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a solução de trabalho foi descartada, as amostras foram lavadas com PBS e PBS (1 mL) foi adicionado novamente. O número médio de células positivas no campo microscópico (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) foi calculado, onde um gradiente com 5–50 células positivas no campo de visão foi selecionado e pelo menos cinco áreas foram selecionadas aleatoriamente para contagem . O número de campos visuais em cada poço da placa de 24-poços foi calculado. Em seguida, o título de vírus foi calculado de acordo com a seguinte Fórmula (1):

2.5. PCR em tempo real

Para detectar a expressão de mRNA de células HEK293 após infecção viral, extraímos RNA intermediário de acordo com as instruções de operação do TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, EUA). O RNA total foi extraído usando TRIzol e processado com DNase I livre de RNase RQ1 (Promega, Madison, WI, EUA) para eliminar DNA residual. O DNA complementar (cDNA) foi obtido por transcrição reversa do RNA extraído usando um kit de reagentes PrimerScript™ RT com gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japão). Fragmentos de DNA foram gerados com os primers específicos P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) e P2 (50 -GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​do gene alvo (S1). O gene foi amplificado com os primers P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) e P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ) como controle interno (GAPHD).

2.6. Western Blot

O lisado celular e o sobrenadante foram separados com eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e depois transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Os blots foram visualizados com equipamento de imagem Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Resumidamente, as membranas foram transferidas para TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) com 5% de leite em pó desnatado e agitado em shaker descolorante em temperatura ambiente por 1 h. As membranas dos grupos experimental e controle foram removidas da solução de selamento e incubadas com o anticorpo primário: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat.#40591- T62, Sino Biological, Pequim, China)] à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram agitados e incubados durante a noite em um agitador descolorante a 4 ◦C. A transferência foi enxaguada com solução TBST e incubada durante 2 h com o anticorpo secundário [imunoglobulina G anti-coelho de cabra (IgG) H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, Reino Unido)]. Após o enxágue, os blots foram incubados por 1 min com um kit de solução LumiBest ECL Substrate (cat. #4AW011-100, 4A Biotech) e depois observados em um gerador de imagens.

2.7. Ensaio de Imunofluorescência

Células HEK293 (3 × 106/poço) foram semeadas em placas de 12-poços. Após 48 h, as células foram infectadas com adenovírus contendo o gene S1 (Ad-S1). Após 48 horas, o meio foi aspirado e as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de BSA e fixadas por 15 minutos com metanol pré-resfriado por 15 minutos a -20 ◦C. Após três lavagens com BSA a 2% em PBS, as células foram permeabilizadas com Triton X a 0,5%-100 durante 10 min. Em seguida, as células foram bloqueadas por 1 h com 2 mL de BSA a 2%, a solução bloqueadora foi descartada e as células foram lavadas três vezes com PBS. Posteriormente, 2 mL de anticorpo primário [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por 1 h ou 4 ◦C durante a noite. Em seguida, a amostra foi enxaguada três vezes com BSA a 2% durante 5 minutos por enxaguamento. Em seguida, 2 mL de anticorpo secundário [IgG de cabra anti-coelho H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. #550037, ZenBio)] foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, as amostras foram enxaguadas três vezes com BSA a 2% durante 5 min por enxaguamento. 40, solução de6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, EUA) foi adicionada a cada poço e reagiu por 10 minutos no escuro. A análise foi observada com um sistema de imagem EVOS™ M7000 (cat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

A proteína SARS-CoV-2 S (1 µg/mL) foi revestida durante a noite em placas de 96-poços (100 µL/poço) com 0. 0tampão de bicarbonato de 5 M. Após lavar com PBST (00,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, adicione água até 1000 mL) cinco vezes, foi adicionada solução bloqueadora e incubada a 37 ◦C por 1 h. A amostra de soro foi diluída e adicionada a cada poço (100 µL/poço). Após 1 h de incubação a 37 ◦C, as amostras foram lavadas com PBST cinco vezes. O anticorpo primário [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] foi adicionado e incubado por 1 h, depois as amostras foram lavadas cinco vezes com PBST, seguida de 1 h de incubação a 37 ◦C com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano [IgG de cabra anti-coelho H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, abcam)] e cinco lava com PBST. Depois de adicionar 3, 30, 5 e anidrido de 50-tetrametil bifenil por 5 min, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 2 M. A densidade óptica foi medida a 450 nm e 630 nm por um instrumento de marcação enzimática (Molecular Devices, SpectraMax 190) e depois ajustada a uma curva padrão.

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2.9. Determinação de citocinas 

A placa (cat. #T-k15048D-1, MSD) foi lavada três vezes com 150 µL/poço de tampão de lavagem e uma amostra preparada de 50 µL foi adicionada a cada poço. Em seguida, a placa foi selada com um selo adesivo e incubada à temperatura ambiente com agitação por 2 h. Em seguida, a placa foi lavada três vezes com 150 µL/poço de tampão de lavagem e 25 µL de solução de anticorpo de detecção foram adicionados a cada poço. A placa foi selada novamente e incubada em temperatura ambiente com agitação por 2 horas. Em seguida, a placa foi lavada três vezes com pelo menos 150 µL/poço de tampão de lavagem; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) foram adicionados a cada poço e a placa foi analisada em um instrumento MSD.

2.10. Anticorpo Neutralizante

2.10.1. Ensaio de Neutralização de Pseudovírus

A atividade de neutralização do soro de camundongos foi testada usando um sistema pseudoviral do vírus da estomatite vesicular (VSV). O soro foi inativado em banho-maria por {{0}},5 h a 56 ◦C e depois diluído em série até a faixa necessária. Células HEK293 foram plaqueadas em uma placa de 96-poços. O soro diluído foi misturado com 200 CCID50 (dose viral que pode infectar 50% da cultura celular)/100 µL da suspensão viral na proporção de 1:1 e colocado em incubadora de CO2 (37 ± 1 ◦C) por 2 horas. Em seguida, 100 µL de solução de manutenção de vírus contendo 0,5% de anticorpo duplo penicilina-estreptomicina foram adicionados a cada poço, e a mistura neutralizada foi inoculada em uma placa de 96-poços contendo células a 100 µL por poço, com dois poços repetidos para cada diluição. Ao mesmo tempo, um controle celular normal foi estabelecido e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37 ± 1 ◦C) por 96 horas. Em seguida, 200 CCID50/100 µL de solução de vírus foram diluídos para 10-1~10-3. O meio de cultura celular na placa de 96-poços foi descartado, 150 µL da solução de manutenção de vírus foram adicionados a cada poço e a diluição da solução de vírus foi inoculada a uma concentração de 10-1~{{33} } em poços da placa de 96-poços (50 μL por poço). Cada diluição foi repetida em 8 poços; um controle celular normal foi estabelecido ao mesmo tempo, seguido de cultura por 96 h. As alterações no CPE celular foram observadas sob um microscópio invertido. O controle celular normal não deve apresentar alterações citopáticas e o controle positivo deve apresentar alterações de CPE. Os pontos finais de neutralização (diluições de soro convertidas em logaritmos) foram calculados observando o CPE. O critério soronegativo/positivo foi 1:12 como critério positivo/negativo,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Ensaio de Neutralização ao Vivo

A atividade de neutralização do soro de camundongo foi avaliada por um teste de neutralização ao vivo. O soro diluído foi misturado com SARS-CoV-2 e incubado a 37 ◦C por 1 h. A mistura foi adicionada a uma placa de 96-poços para infectar as células Vero E6. Após 72-h de incubação a 37 ◦C, o efeito citopático do vírus (CPE) foi observado sob ampliação de 40× e o título de neutralização (o recíproco da diluição sérica de 50% necessária para neutralizar a infecção pelo vírus) foi calculado. Os procedimentos acima foram todos realizados em ambiente de nível 3 de biossegurança.

2.11. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas por meio de teste t para duas amostras utilizando SPSS 26. Valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos. A tendência central foi medida com o título médio geométrico (GMT).

3. Resultados

3.1. Construção de Adenovírus Recombinante

O plasmídeo transportador de adenovírus recombinante pAdeno-CMV-S1 com inserção correta foi obtido; seu diagrama de estrutura é mostrado na Figura 1. O adenovírus recombinante continha o genoma HAdV-C5 sem a região E1/E3. Um diagrama esquemático do vetor de adenovírus recombinante obtido pela transfecção do plasmídeo transportador e do plasmídeo do citoesqueleto em células HEK293 é mostrado na Figura 1.

3.2. Caracterização de Adenovírus Recombinante

O plasmídeo recombinante contendo o gene alvo foi identificado por PCR (ver Figura 2A para resultados de eletroforese em gel). Este foi um experimento repetido. As sequências iniciadoras foram MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag e S1-R acaataagtagggactgggtc, e o sequenciamento confirmou que a sequência era consistente com o projeto. A expressão de SARS-CoV-2 S1 nas células foi detectada com Western blotting (Figura 2B) e imunofluorescência indireta (Figura 2C). A coloração da banda (~75 kDa) foi detectada por Western blotting e foi consistente com a posição esperada da banda. Ao nível transcricional, a expressão in vitro de S1 foi detectada por PT-PCR. Os resultados mostraram que a expressão de mRNA S1 em células HEK-293 foi significativamente maior do que no grupo controle.

Figura 1. Construção de vacina recombinante de adenovírus e estratégia experimental. (A) pAdeno-CMV-S1 é um plasmídeo de transporte de adenovírus recombinante contendo o gene alvo S1. pBHGlox∆E1,3Cre é o plasmídeo do esqueleto do adenovírus. pBHGlox∆E1,3Cre e pAdeno-CMV-S1 foram extraídos com um kit de extração de plasmídeo QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Pequim, China). Um dia antes da transfecção, as células HEK293 foram passadas num frasco de cultura celular de 25 cm2. O meio de cultura foi DMEM contendo 5% de FBS sem antibióticos. No segundo dia, 60-80% das células foram selecionadas e a solução de transfecção foi adicionada às células. Após 7 dias de transfecção, as células foram raspadas, centrifugadas, o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuscitadas com PBS. As células foram congeladas e descongeladas repetidamente a −80 ◦C e 37 ◦C. Após centrifugação, o sobrenadante continha a solução primária de vírus. A cepa de adenovírus recombinante foi purificada, amplificada e obtida após processamento adicional e designada Ad-S1. A vacina foi injetada por via intramuscular nos ratos para estudos de acompanhamento. (B) A escala de tempo representada de imunização e retirada de sangue.

3.3. Título de adenovírus

Neste experimento, foi calculada uma média de seis células positivas em cinco campos microscópicos, e o vírus no poço foi diluído 108 vezes. Com base na fórmula descrita na seção Materiais e Método, o título de adenovírus foi de 4,74 × 1011 unidades formadoras de placas (pfu)/mL (Figura 2D).

3.4. Imunidade celular pós-vacinação

Durante o período de teste, houve alterações estatisticamente significativas nas citocinas séricas (p menor ou igual a 0 0,05), o que mostrou principalmente que a concentração de quimioatraente de queratinócitos/oncogene regulado pelo crescimento humano (KC/GRO) foi diminuiu, e as concentrações de IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } e TNF- aumentaram, enquanto a concentração de IL-6 não foi significativamente alterada (Figura 3).

Figura 2. Identificação da proteína HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 recombinante e determinação do título de adenovírus. (A) Detecção por PCR do plasmídeo recombinante com o gene alvo S1. (B) Detecção de Western Blot de SARS-CoV-2. Células HEK293 de crescimento exponencial foram infectadas com SARS-CoV-2 por 48 h, depois a proteína celular foi extraída e separada por SDS-PAGE. A expressão do SARS-CoV-2 foi confirmada por Western blotting com IgG de cabra anti-coelho. (C) Microscopia de imunofluorescência de células HEK -293 infectadas com Ad-S1 (verde). As células foram contrastadas com 40, 6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI) para corar os núcleos. Barra de escala 1000 µm. (D) O ensaio de placa foi utilizado para medição. Micrografias representando diluições 10-5, 10-6, 10-7 e 10-8 (da esquerda para a direita).

Figura 3. Ad-S1 induziu níveis plasmáticos alterados de citocinas tipo 1/2, interferons tipo 1 e outras citocinas. Os resultados foram detectados através da coleta de sangue dos camundongos 7 dias após a primeira imunização. Os dados são apresentados como gráficos de dispersão de caixa e bigode. Cada círculo representa um único indivíduo. Os valores de p foram calculados usando um teste t de duas amostras.

3.5. Detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2 S1 pós-imunização

O ELISA revelou que anticorpos específicos-2-de SARS-CoV estavam presentes nos camundongos injetados com o primeiro e o segundo Ad-S1, mas não naqueles injetados com o capsídeo de adenovírus de controle ou solução de PBS (Ad/PBS) (Figura 4A). Títulos de IgG de 1:210 e 1:212 foram detectados nos camundongos vacinados com Ad-S1-duas semanas após a primeira e a segunda imunizações, respectivamente. O título de diluição aos 28 dias pós-vacinação (D28, GMT 2297,4) foi 61- vezes maior do que no D14 (GMT 378,9).

Figura 4. Ad-S1 induziu altos títulos de anticorpos (A) e atividade de neutralização (B, C) em camundongos. (A) ELISA de IgG sérica específica para SARS-CoV-2-de camundongos imunizados1-com Ad-S. (B) Análise das atividades de pseudovírus do soro dos camundongos imunizados com Ad-S1-. (C) Análise das atividades neutralizantes do soro dos camundongos{10}imunizados com Ad-S

3.6. Ensaio de Anticorpos Neutralizantes

O desafio SARS-CoV-2 de células Vero E6 permitiu a detecção de atividade neutralizante no soro de camundongo imunizado (Figura 4B, C). Os títulos de neutralização D14 e D28 das células Vero E6 Ad-S{7}}imunizadas contra o desafio do vírus vivo SARS-CoV{{10}} in vitro foram 1:24,3 e 1:26,3, respectivamente. O ensaio de pseudovírus produziu resultados semelhantes aos do ensaio de vírus vivo, com títulos de neutralização de até 1:28,1 e 1:29,6 em D14 e D28, respectivamente. O título neutralizante do pseudovírus D28 (GMT 769,0) foi 27- vezes maior que o do D14 (GMT 283,7).

4. Discussão

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 a<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Neste estudo, construímos uma vacina recombinante de adenovírus SARS-CoV-2 contendo a subunidade SARS-CoV-2 S1 e a designamos como Ad-S1. Assim como o CanSinoBIO, que foi aprovado para comercialização [28], usamos HAdV-C5 nesta vacina. O adenovírus é amplamente utilizado em terapia genética recombinante e como vetor de vacina. No entanto, a taxa soropositiva de HAdV-C5 é tão alta quanto 75–80% na população normal [29]. Isto implica que a imunidade pré-armazenamento contra os vectores HAdV-C5 reduz significativamente a imunidade induzida pela vacina. Desenvolvido na Universidade de Oxford, no Reino Unido, o ChAdOx1 nCoV-19 utiliza um vetor de adenovírus de chimpanzé que, por outro lado, apresenta menor taxa de soropositividade em humanos e, quando positivo, geralmente apresenta menor título de anticorpos séricos [30] . Portanto, os vetores de adenovírus que podem escapar da imunidade pré-existente podem ser explorados para aumentar a eficácia protetora da vacina de adenovírus. No presente estudo, o estado sérico dos camundongos antes e depois da imunização foi determinado por ELISA e testes de neutralização e produziu evidência de imunidade humoral para vacinas candidatas. O soro produzido após a injeção intramuscular da vacina em camundongos protegeu efetivamente as células Vero E6 da infecção por SARS-CoV-2 in vitro (Figura 4). Também detectamos uma resposta imune mais forte e melhor proteção nos camundongos após uma segunda imunização (Figura 4). Nossos resultados experimentais são semelhantes aos resultados experimentais convencionais.

À medida que a pesquisa sobre SARS-CoV-2 continua, vários estudos demonstraram que a tempestade de citocinas secundária à infecção por SARS-CoV-2 pode afetar a produção de células T, tornando difícil para os pacientes manterem a imunidade a longo prazo contra SARS-CoV-2 [31]. Portanto, é necessário determinar se o Ad-S1 pode induzir imunidade mediada por células T em camundongos. Nossos resultados demonstraram que as concentrações de IFN e IL-12 aumentaram, e as concentrações de IL-4 diminuíram no grupo Ad-S1, indicando que a sobrevivência e o crescimento de células Th1 induzidos pela vacina nos camundongos. A secreção de IL-12, IL-10 e TNF- pelas células Th1 aumentou ligeiramente no grupo experimental. Esses resultados indicaram que o Ad-S1 induziu efetivamente uma resposta de células T tendenciosa para Th1- nos camundongos [32]. O aumento de IL-5 indicou que as células Th2 também participam da resposta imune e produzem certos efeitos. A concentração de KC/GRO no grupo experimental foi significativamente reduzida em comparação com a do grupo de controle de PBS, o que pode ter sido devido à redução da quimiotaxia de neutrófilos que suprimiu a resposta inflamatória e permitiu que os efeitos colaterais da vacina fossem ligeiramente controlados. Isto seria mais benéfico para pessoas imunocomprometidas, como idosos ou pacientes em quimioterapia. Li M., et al. [29] desenvolveram uma vacina contra adenovírus usando Ad68 como vetor. Os resultados mostraram que a atividade neutralizante in vivo do SARS-CoV-2 pôde ser detectada dentro de duas semanas após a imunização intramuscular de camundongos BALB/c e depois continuou a aumentar, e o título de anticorpos de neutralização (PRNT ID50) atingiu 957,3 às oito semanas. Enquanto isso, no estudo de Liu J., et al. [33], foram desenvolvidas vacinas utilizando AdC6 e AdC68 como vetores; ambas as respostas de anticorpos de ligação e neutralizantes após a imunização foram geradas 14 dias após a dose, com um título de IgG de 7108 (título médio geométrico, GMT; AdC6) e 5489 (GMT, AdC68). O título de neutralização 50 (NT50) do ensaio de neutralização de pseudovírus foi 125 (GMT, AdC6) e 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa – melhora o sistema imunológico

No presente estudo, camundongos vacinados com Ad-S1 tiveram títulos de IgG de 1:1010 e 1:122 detectados por ELISA duas semanas após a primeira e segunda imunização, respectivamente. O título de diluição de ad-s1 foi 378,9 (GMT) aos 14 dias após a inoculação e 2297,4 (GMT) aos 28 dias após a inoculação. No teste de anticorpos de neutralização, as células Vero E6 imunizadas com Ad-S1 apresentaram neutralização de 1:24,3 e 1:26,3 em D14 e D28 contra o desafio do vírus SARS-CoV-2 vivo in vitro, respectivamente. Os títulos de neutralização do pseudovírus no D14 e D28 foram 283,7 (GMT) e 769,0 (GMT), respectivamente. Assim, a vacina deste estudo foi mais eficaz em termos de resposta imune no modelo de camundongo.

Devido à limitação das condições experimentais, não realizamos análise de ponto imunoabsorvente ligado a enzima (ELISpot) das células imunes do baço dos camundongos experimentais. Além disso, experimentos de proteção contra ataques de SARS-CoV-2 em camundongos não puderam ser realizados devido às limitações do laboratório de proteção física. No entanto, determinamos que a vacina tinha alta eficácia em modelos de camundongos e poderia ser usada como uma cepa vacinal de reserva ideal. Além disso, a imunogenicidade, segurança e eficácia de possíveis vacinas candidatas contra SARS-CoV-2 devem ser examinadas em modelos animais adicionais (por exemplo, coelhos, primatas, guaxinins, cães), pois os modelos de camundongos podem não duplicar totalmente a imunogenicidade humana. características.

sistema imunológico que aumenta a planta cistanche

5. Conclusões

Os dados obtidos dos nossos estudos pré-clínicos da vacina contra adenovírus demonstraram que a vacina tem segurança e eficácia suficientes. Portanto, pode ser uma vacina profilática promissora e viável contra a infecção por SARS-CoV-2.

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