A exposição aguda da pele à luz ultravioleta desencadeia inflamação renal mediada por neutrófilos

Nós e outros demonstramos que a luz UV induz uma rápida infiltração de neutrófilos na pele (6, 7). Embora os neutrófilos sejam os principais contribuintes para a inflamação nos locais de lesão local, recentemente foi reconhecido que os neutrófilos também podem abrigar órgãos distantes do local primário da inflamação (8-10), onde contribuem para a lesão do tecido pulmonar por meio da produção de oxigênio reativo. espécies (ROS) (11) ou ativar o sistema imune adaptativo nos linfonodos e na medula óssea (9, 12). No LES, acredita-se que os neutrófilos desempenham um papel importante em doenças locais e sistêmicas. Os neutrófilos estão presentes nas lesões cutâneas de pacientes com LES (13, 14) e norimtecido de pacientes com NL (15, 16). A alta expressão de uma assinatura gênica de neutrófilos é um forte preditor de doença ativa, incluindo LN e surtos cutâneos (17, 18). Os granulócitos pró-inflamatórios de baixa densidade (LDGs) estão aumentados particularmente em pacientes com doença de pele (19). Embora esses achados impliquem os neutrófilos na lesão tecidual local no LES, se os neutrófilos fornecem a ligação patogênica entre a inflamação da pele elesão renalnão é compreendido.

Para elucidar como a exposição da pele à luz UV afeta orime o papel que os neutrófilos desempenham nestes processos, avaliamos as mudançasrenalexpressão gênica em conjunto com a migração de neutrófilos. Descobrimos que a exposição aguda da pele à luz UV estimula processos inflamatórios norim,incluindo a expressão de moléculas de adesão endotelial, mediadores inflamatórios, marcadores de lesão e proteinúria transitória. Notavelmente, descobrimos que os neutrófilos migraram para orimapós exposição à luz UV de maneira IL-17A-dependente, localizando-se nas áreas tubulointersticiais (TI) onde exibiram fenótipos pró-inflamatórios. Bloqueio do tráfego de neutrófilos por tratamento com imunoglobulina anti-G-CSF (IgG) revogadorenalinflamação e preveniu a regulação para cima de marcadores de lesão tubular. Juntos, esses achados demonstram que a exposição da pele à luz UV desencadeiarenalprocessos inflamatórios e de lesão mediados por neutrófilos.

Resultados

A exposição da pele à luz UV causa lesão renal subclínica.A exposição à luz solar tem sido associada ao agravamento dos sintomas sistêmicos e ocorrência de surtos da doença em pacientes com LES, incluindo nefrite (2-4). Portanto, primeiro perguntamos se a inflamação estéril aguda na pele desencadeada por uma única exposição à luz ultravioleta B (UVB) (500 mJ/cm2) em camundongos pretos 6 (B6) leva a alterações narim, incluindo inflamação, lesão e proteinúria (Fig. 1A). O pulmão foi escolhido como órgão de controle, pois nenhuma associação entre fotossensibilidade e doença pulmonar clínica foi relatada no LES. Um total de 500 mJ/cm2 de luz UVB em camundongos B6 foi definido como duas doses eritematosas mínimas (20), a dose de referência usada para protesto humano (21). Análises de expressão gênica de perfundidosrim tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-dobrarrenalindução em s100A9, um mediador neutrofílico associado adanos nos rins(22), bem como aumento da expressão de s100A6, uma proteína de ligação ao cálcio associada à lesão tubular (23) (Fig. 1 D e E). Enquanto a indução de s100A9 foi detectada no pulmão, a expressão do gene s100A6 permaneceu inalterada no pulmão (Apêndice SI, Fig. S1). A resposta inflamatória norimtambém foi associado a um aumento precoce na expressão de il-1 (dias 1 e 2 após UV), enquanto houve alteração mínima ou nenhuma alteração em tnf ou il-6 (Fig. 1F). A expressão de Il-1 não foi detectada no pulmão até 6 dias após a exposição da pele à luz UVB (Apêndice SI, Fig. S1). Indução rápida na expressão de cxcl12, uma quimiocina secretada pelos glomérulos e túbulos e implicada nalesão renal(24), também foi encontrado norimmas não o pulmão (Fig. 1G e Apêndice SI, Fig. S1). Portanto, a lesão cutânea desencadeada pela luz UVB instiga a rápidarenalprocessos pró-inflamatórios, enquanto menos alterações são observadas no pulmão.

Além da resposta pró-inflamatória observada norim,tanto a proteinúria quanto a relação albumina/creatinina urinária aumentaram nos primeiros dias após a exposição da pele à luz UVB (Fig. 1 H e I). Este efeito rápido sobrefunção renalfoi acompanhado por up-regulation na expressão de lipocalina-2 elesão renalmolécula 1 (kim-1) (Fig. 1 J e K), marcadores dedanos nos rinsque também são observados em LN (25, 26). Apesar da natureza transitória da proteinúria, a expressão desseslesão renalmarcadores persistiram até o dia 6 (Fig. 1 J e K), possivelmente refletindo o reparo tecidual.

A inflamação induzida pela luz UV na pele resulta na migração de neutrófilos para o rim.Para investigar se os neutrófilos participam da resposta inflamatória sistêmica à luz UVB, examinamos a cinética do acúmulo de neutrófilos na pele irradiada com luz UV, bem como no baço,rim,e pulmão de camundongos C57BL/6 J (B6), uma cepa que melhor imita as alterações cutâneas da luz UVB na pele humana (Fig. 2A) (27). Após a exposição aguda da pele à luz UVB, o número de neutrófilos na pele aumentou sete vezes em 24 h e permaneceu elevado por 6 d em comparação com os níveis basais pré-UV (D-1) ​​(Fig. 2B). Isso foi acompanhado por uma redução no número de neutrófilos na medula óssea e um aumento de cinco vezes nos neutrófilos circulantes no sangue nos dias 1 a 6 (Fig. 2 C e D). Curiosamente, no mesmo período de tempo, os neutrófilos aumentaram no baço, pulmão erim(Fig. 2 Apêndice E-G e SI, Fig. S2A). A cinética precisa variou entre os órgãos, atingindo um pico no dia 1 no pulmão e nos dias 2 a 6 norime baço (Fig. 2 E–G). Norins, neutrófilos localizados principalmente na área tubulointersticial, incluindo a vasculatura, conforme indicado pela coloração de elastase de neutrófilos (NE) na proximidade ou colocalizada com a molécula de adesão de plaquetas/células endoteliais-1 (PECAM-1/CD31 ) (Fig. 2H). Imagens representativas na Fig. 2H mostram neutrófilos dentro ou ao redor da vasculatura intersticial (setas brancas completas) e no interstício (setas brancas pontilhadas), com neutrófilos ocasionais, também encontrados nos glomérulos (setas amarelas). Localização semelhante foi detectada com coloração de imunofluorescência (IF) anti-Ly6G (Apêndice SI, Fig. S2B).

Para determinar se outras células imunes inatas apresentaram respostas locais e sistêmicas semelhantes aos neutrófilos, examinamos a distribuição de monócitos (CD11b mais Ly6C mais Ly6G−) nos mesmos pontos de tempo após a exposição à luz UVB. Embora os monócitos também tenham sido recrutados para a pele, apenas um pequeno número de monócitos infiltrantes foi detectado narimno dia 6 após a exposição UVB (∼2-vez versus ∼10.5-aumento derimneutrófilos) (Fig. 2F e SI Apêndice Fig, S3). Nenhum aumento no número de monócitos foi detectado no pulmão ou baço (Apêndice SI, Fig. S3), sugerindo que a resposta sistêmica à lesão UV foi relativamente seletiva para neutrófilos.

A infiltração de neutrófilos na pele foi acompanhada por alterações histológicas, incluindo inflamação precoce da derme e morte das células epidérmicas (dias 1 e 2), seguidas pelo desenvolvimento de acantose e hiperqueratose com formação de crostas serocelulares em alguns casos (dia 6) (SI Apêndice, Fig. S4). Notavelmente, nenhuma lesão cutânea aberta apareceu após a exposição à luz UVB, sugerindo que a infiltração de células imunes observada ocorreu em condições estéreis, embora uma contribuição de um microbioma cutâneo alterado não possa ser excluída (20).

Juntos, esses achados demonstram que a exposição da pele a uma única dose de luz UVB mobiliza neutrófilos tanto para o local da inflamação quanto para os órgãos internos, incluindo orim,acompanhada de neutrofilia sanguínea. Embora os padrões migratórios gerais fossem semelhantes em camundongos machos e fêmeas, a infiltração de neutrófilos na pele foi mais rápida nas fêmeas em comparação com os machos (Fig. 2B). Em contraste, a lesão epidérmica por remoção de fita não levou à migração de neutrófilos para orimapesar de níveis semelhantes de infiltração de neutrófilos e resposta inflamatória e lesão tecidual como visto com exposição à luz UV (Apêndice SI, Fig. S5), indicando que a disseminação sistêmica de neutrófilos não é comum a todas as formas de lesão de pele estéril.

CISTANCHE VAI MELHORAR A DOENÇA RENAL/RENAL

IL-17A promove o recrutamento de neutrófilos após a exposição da pele à luz UV.Uma pesquisa de mediadores quimiotáticos e inflamatórios na pele revelou uma regulação positiva significativa da expressão gênica de quimiocinas de neutrófilos e citocinas inflamatórias cxcl1, cxcl5/6, g-csf e il-1 1 a 2 d após a exposição UV (Fig. . 3 A-D). O aumento rápido e persistente na expressão de s100A9 correspondeu à cinética de infiltração de neutrófilos na pele (Fig. 2B e Apêndice SI, Fig. S6), enquanto as citocinas il-6, tnf e il-33 foram transitoriamente aumentadas e retornaram à expressão basal no dia 6 (Apêndice SI, Fig. S6). Em contraste, il-36a foi elevado apenas no dia 6 (Apêndice SI, Fig. S6), talvez refletindo uma função reparadora. A presença transitória (1 a 2 d) de monócitos na pele (Apêndice SI, Fig. S3) foi paralela à regulação positiva de quimiocinas específicas de monócitos ccl4 e ccl2 (Apêndice SI, Fig. S6). Semelhante ao acúmulo de neutrófilos na pele de camundongos fêmeas (Fig. 2B), o acúmulo de monócitos na pele também ocorreu mais cedo nas fêmeas do que nos machos (Apêndice SI, Fig. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-vez a indução cutânea na expressão de g-csf durante os dias 1 e 2 após UV (Fig. 3C). Para determinar se a indução dessas citocinas era relevante para a mobilização de neutrófilos, primeiro quantificamos as concentrações de proteínas de citocinas no sangue, que revelaram um aumento robusto e sustentado (10- a 100-vezes) na concentração de plasma IL-17A 6 a 24 h após a exposição à luz UV (Fig. 3F), juntamente com um aumento transitório (pico em 6 h) em IL-6 e IL-12, citocinas que pode ser a jusante de IL-17A (28) (Fig. 3 G e H). Não foi observado aumento nas concentrações plasmáticas de IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 ou IL1. Para determinar se IL-17A é necessária para o recrutamento de neutrófilos induzido por UVB, bloqueamos o efeito de IL-17A com um anticorpo neutralizante antes da exposição a UV (Fig. 3I). Anti-IL-17A IgG amorteceu significativamente a neutrofilia sanguínea (Fig. 3J) e atenuou o influxo de neutrófilos no tecido da pele exposta (Fig. 3K e Apêndice SI, Fig. S7A) e norim(Fig. 3L e Apêndice SI, Fig. S7B). Esses achados demonstram que o recrutamento de neutrófilos em resposta à luz UV é mediado, pelo menos em parte, por IL-17A.

Os neutrófilos mediam a inflamação do rim após a exposição da pele aos raios UVLeve.Para determinar se os neutrófilos foram responsáveis ​​pelas alterações inflamatórias norim following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-vez após a exposição UV, sugerindo um papel quimiotático para G-CSF no recrutamento de neutrófilos em resposta à luz UV, inibimos a mobilização de neutrófilos da medula óssea bloqueando G-CSF conforme descrito na Fig. 4A. A neutralização do G-CSF preveniu a neutrofilia sanguínea, bem como o recrutamento de neutrófilos para orimapós a exposição da pele à luz UVB (Fig. 4 B e C). Notavelmente, como relatado anteriormente em diferentes modelos (29, 30), o bloqueio de G-CSF não alterou o número de monócitos norim(Fig. 4D). Diminuição da migração de neutrófilos para orimfoi acompanhado por uma redução significativa narenalexpressão das moléculas de adesão vcam-1 e e-selectina (Fig. 4 E e F), bem como os mediadores inflamatórios s100A9 e il-1 1 d após exposição UVB (Fig. 4 G e H). Além disso, os marcadores de lesão tecidual lipocalina-2 e kim-1 norimforam significativamente diminuídos em camundongos expostos à luz UV tratados com anticorpo bloqueador de G-CSF em relação aos animais expostos a UV tratados com isotipo (Fig. 4 I e J). Como relatamos anteriormente (6), a exposição aguda da pele à luz UVB desencadeou uma resposta de interferon tipo I norim(Fig. 4K). O bloqueio de G-CSF reduziu significativamente, mas não anulou completamente, a pontuação de IFN (Fig. 4K). Enquanto a presença de neutrófilos norimfoi necessário para as respostas inflamatórias e lesões agudas observadas 1 d após a exposição à luz UV da pele (Fig. 4), não foram observadas diferenças na proteinúria neste momento, pois o pico de proteinúria ocorreu por volta do dia 4 após a exposição à UV (Fig. 1 H e EU). Juntos, esses dados indicam que os neutrófilos são responsáveis ​​pela resposta inflamatória e, direta ou indiretamente, contribuem para a indução do interferon tipo I norimapós a exposição à luz UV da pele. Semelhante aos resultados obtidos com IgG anti-G-CSF, a administração do anticorpo neutralizante anti-IL-17 suprimiu parcialmente a migração de neutrófilos para orime resultou na diminuição da expressão gênica deriminflamatórios (vcam-1 e s100A9) e marcadores de lesão (lipocalina-2 e kim-1), embora apenas a redução na expressão de kim-1 tenha sido estatisticamente significativa (Apêndice SI, Fig . S7 C–F)

Uma subpopulação de neutrófilos renais é transmigrada reversa, um fenótipo também detectado no sangue de pacientes com LES.Embora se suponha há muito tempo que os neutrófilos que entram nos locais de infecção ou inflamação estéril sofrem apoptose e são rapidamente removidos pelos macrófagos, vários estudos revelaram que alguns neutrófilos trafegam de maneira bidirecional, ou seja, após entrarem em um tecido, eles transmigram volta para a corrente sanguínea e se infiltra em outro local, um processo conhecido como transmigração reversa (rTEM) (8, 10, 11, 31-34). Para investigar se os neutrófilos que se alojam norimapós a exposição da pele à luz UVB transitada pela pele exposta, estudamos a migração de neutrófilos em um modelo de camundongo B6 fotoativado (ubiquitina C humana [UBC]-proteína fluorescente verde [PA] fotoativada [PA]-verde [GFP] humana).

O esquema experimental é ilustrado na Fig. 5A; 1 d após a exposição da pele a uma dose única de luz UVB, a pele foi exposta à luz violeta (405 nm), de modo que as células imunes infiltrantes foram fotoconvertidas em células GFP-positivas. Os neutrófilos fotoconvertidos (GFP mais Ly6G plus) foram então quantificados emrinsO próximo dia. A análise de citometria de fluxo revelou que cerca de 20 por cento dos neutrófilos infiltrados nos rins eram GFP positivos após a subtração do sinal de fundo (cerca de 10 por cento) (Fig. 5B). Em contraste com os modelos de inflamação estéril no fígado ou músculo cremaster (8, 10), não detectamos neutrófilos fotoconvertidos no pulmão, possivelmente porque poucos neutrófilos foram encontrados no pulmão no dia 2 (Fig. 2F). Para testar se GFP mais neutrófilos norimextravasados ​​de tecido de pele exposto a UV ou foram PA intravascularmente, comparamos as mudanças nos números de GFP mais neutrófilos obtidos a partir dorinsde camundongos em que a mesma pele que foi exposta à luz UV era PA com luz violeta um dia depois (Grupo I) versus camundongos em que a pele adjacente a essa exposição à luz UV era PA com luz violeta um dia depois (Grupo II, diagrama no Apêndice SI, Fig. S8A). Embora não houvesse diferenças nas porcentagens de neutrófilos circulantes entre os grupos (Apêndice SI, Fig. S8B), um aumento maior na GFP mais neutrófilos foi observado norinsde camundongos onde a pele exposta a UV também era PA (Grupo I) em comparação com a falta de aumento na GFP mais neutrófilos nos camundongos onde a pele não exposta a UV era PA (Grupo II) (Apêndice SI, Fig. S7B). No Grupo II, os números de neutrófilos foram semelhantes ao fundo de positividade de GFP visto na Fig. 5B (Apêndice SI, Fig. S8B).

Enquanto baixos níveis de GFP plusrimOs neutrófilos do Grupo II sugeriram que a luz violeta não afetou as células circulantes da pele não exposta aos raios UV, permanecendo possível que a exposição à luz UV alterou as interações dos neutrófilos com os vasos sanguíneos da pele, permitindo maior fotoconversão e subsequenterimAcesso. Para determinar as proporções relativas de neutrófilos TEM, quantificamos a expressão de marcadores de superfície usados ​​para caracterizar neutrófilos que sofreram rTEM: CXCR4hi (8) e ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). De fato, GFP maisrimos neutrófilos expressaram níveis mais altos de CXCR4 em comparação com GFP mais neutrófilos na pele ou GFP- neutrófilos norim(Fig. 5C). Do

interesse,renalexpressão do ligante CXCR4, cxcl12, 1 a 2 d após a exposição da pele à luz UVB foi concomitante com a presença de neutrófilos CXCR4hi norim(Fig. 1G), possivelmente fornecendo o estímulo quimiotático para o recrutamento desses neutrófilos para o rim. De interesse, detectamos neutrófilos CXCR4hi e ICAM1- hiCXCR1lo na medula óssea tardiamente após a exposição UV (dia 6, Apêndice SI, Fig. S9 B e C), sugerindo que alguns desses neutrófilos também voltam para o medula óssea semelhante ao que foi relatado para rTEM após lesão hepática ou infecção por vírus da pele (12, 36). Consistente com essas observações, detectamos maior expressão de CXCR4 nos neutrófilos do sangue no dia 2 após a exposição à UV, possivelmente capturando células a caminho dorime medula óssea (Apêndice SI, Fig. S9D). Da mesma forma, uma porcentagem significativamente maior de células ICAM1hiCXCR1lo foi detectada entre a GFP mais neutrófilos norimem comparação com GFP mais neutrófilos na pele e GFP- neutrófilos norim(Fig. 5D). O fenótipo ICAM1hiCXCR1lo foi detectado em ~20 a 35 por cento de GFP mais neutrófilos norim(Fig. 5D), sugerindo que um subconjunto de neutrófilos que migram para orimvia pele exposta aos raios UV o fazem por transmigração reversa, enquanto o restante darimos neutrófilos são provavelmente ativados enquanto circulam pela pele inflamada exposta aos raios UV. A subpopulação de neutrófilos ICAM1- hiCXCR1lo também foi detectada norinsde camundongos B6 normais expostos à luz UV que não receberam PA (Apêndice SI, Fig. S9A).

Embora os fenótipos de neutrófilos CXCR4hi e ICAM1hiCXCR1lo tenham sido associados a funções inflamatórias e lesão tecidual em diferentes modelos murinos (11, 31, 37), poucos estudos foram realizados nessas populações de células em doenças humanas. Dado o papel emergente dos neutrófilos no LES (13, 17, 18) e sua aparente heterogeneidade (19), investigamos se as células polimorfonucleares de densidade normal (PMNs) ou LDGs de pacientes com LES

demonstraram os fenótipos de migração reversa: CXCR4hi (37, 38) e ICAM1hiCXCR1lo. O perfil de citometria de fluxo de PMNs e LDGs revelou maior expressão de CXCR4 na superfície dessas células em pacientes com LES em comparação com controles saudáveis ​​(Fig. 6 A e C). Além disso, encontramos uma porcentagem pequena, mas significativamente maior de PMNs ICAM1hiCXCR1lo no sangue do LES (média, 3,5 por cento) em relação aos controles saudáveis ​​(média, 1,4 por cento) (Fig. 6B). Curiosamente, a população de neutrófilos LDG (CD15 mais CD14loCD10 mais em células mononucleares do sangue periférico [PBMCs]) continha uma porcentagem maior de células ICAM1hiCXCR1lo do que os PMNs tanto no sangue saudável (média, 7,1 por cento) quanto no LES (média, 29,4 por cento) (Fig. 6B e D). A população semelhante a rTEM foi significativamente mais altamente representada em LDGs de pacientes com LES em relação a controles saudáveis ​​(Fig. 6D). Esses dados identificam a presença de fenótipos de neutrófilos semelhantes a rTEM em PMNs e particularmente LDGs em pacientes com LES.

Discussão

Os efeitos sistêmicos da exposição da pele à luz UV são pouco compreendidos. A identificação dessas vias em condições normais de linha de base pode informar mecanismos de envolvimento sistêmico do tecido após a exposição ao sol que ocorre em doenças como o LES (2–4). Aqui, relatamos várias descobertas sobre como a exposição à luz solar afeta o rim. Primeiro, demonstramos que a exposição aguda da pele à luz UVB desencadeia respostas inflamatórias e de lesão norim,incluindo proteinúria subclínica. Curiosamente, essesrenalas alterações foram acompanhadas por infiltração de neutrófilos no rim após inflamação da pele mediada por luz UVB. A resposta de neutrófilos foi dependente de IL-17A e G-CSF. Os neutrófilos no rim apresentaram fenótipos pró-inflamatórios, como evidenciado pela localização extracelular de NE, uma maior proporção de rTEM (CXCR4hi) também conhecido como células "envelhecidas" e ICAM1hiCXCR1lo. Os neutrófilos foram diretamente implicados em doenças subclínicas.lesão renal,já que a depleção de neutrófilos resultou em reduções significativas na expressão de moléculas de adesão, citocinas inflamatórias, assinatura de IFN-I e marcadores de lesão renal após a exposição da pele aos raios UV.

Outros tipos de lesão na pele, como remoção de fita adesiva e aplicação tópica de um agonista de TLR7, foram relatados para aumentarlesão renalem certos modelos de lúpus, embora se acreditasse que o aumento da doença fosse mediado por macrófagos e células dendríticas, em vez de neutrófilos (39, 40). Tendo demonstrado que a remoção da fita não levou ao recrutamento de neutrófilos para orim, propomos que a exposição à luz UV é diferente de outros tipos de inflamação da pele estéril. Isso pode ser explicado pela geração de fotoprodutos ou mediadores inflamatórios únicos após a lesão por UV que preparam o rim para inflamação, por diferenças na remoção de neutrófilos após a UV em comparação com a remoção da fita ou por outros fatores. Observamos que a luz UV desencadeou uma rápida e forte indução de il-17um RNA mensageiro (mRNA) na pele, juntamente com altos níveis de proteína IL-17A circulante (∼100-aumento de vezes) , que foi necessário para o recrutamento de neutrófilos após a exposição à luz UV. A indução simultânea de 100- a 1,000-vez na expressão de g-csf da pele sugere que o eixo IL-17A/G-CSF é o mecanismo provável responsável pela neutrofilia e homing do tecido neutrófilo em resposta à luz UV. O papel de IL-17A na regulação da granulopoiese e recrutamento de neutrófilos via indução de G-CSF é bem reconhecido em condições homeostáticas e alguns estudos identificaram IL-17A como importante para o recrutamento de neutrófilos para os locais de inflamação estéril (41, 42). No lúpus, a expressão elevada de IL-17A é encontrada em lesões cutâneas (43), e os níveis circulantes de IL-17A aumentados têm sido associados a piores manifestações da doença (44), embora a relação específica com neutrófilos, uma população patogênica nesta doença (13, 17, 18), permanece inexplorada. Além de seus efeitos diretos na mobilização de neutrófilos da medula óssea mediada por G-CSF, IL- 17A também pode contribuir para o homing de neutrófilos para orimestimulando a expressão de moléculas de adesão (por exemplo, VCAM-1 e E-selectina) norenalendotélio (45, 46).

Usando o mesmo modelo de exposição aguda aos raios UV, relatamos recentemente que uma única dose de luz UV desencadeou uma resposta local e sistêmica do IFN-I, necessária para o recrutamento eficiente de neutrófilos para a pele (6). Como o IFN-I demonstrou induzir a produção de IL-17A (47), é plausível que essas vias independentemente ou em conjunto levem ao recrutamento e migração de neutrófilos mediados por luz UV que relatamos aqui. Embora nossos achados sugiram um papel inflamatório para IL- 17A, efeitos supressores da luz UVB na sinalização de IL-17A foram relatados anteriormente na psoríase, onde a exposição da pele psoriática à luz UVB eliminou células T patogênicas e células dendrídicas inflamatórias mieloides (48, 49). Como a pele psoriática, diferentemente da saudável, é rica em células T produtoras e responsivas de IL{10}}, a diferença na composição celular provavelmente determinará a resposta à luz UVB, incluindo a extensão da supressão de IL mediada pela luz UVB -17Uma expressão de receptor (50). A dosagem de UV também pode determinar se o efeito inflamatório ou terapêutico ocorre: baixas doses estão associadas a consequências anti-inflamatórias e imunossupressoras (51), possivelmente pela inibição das respostas das células T CD8 (52).

Os neutrófilos desempenham vários papéis durante a inflamação do tecido. Quando ativados por padrões moleculares associados a patógenos e padrões moleculares associados a danos (DAMPS) ou por envolvimento de receptores, os neutrófilos contribuem diretamente para a lesão tecidual, liberando proteases, ROS e extrusão de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (53, 54). Os neutrófilos também podem promover o reparo tecidual por fagocitose de detritos celulares e permitindo a revascularização do tecido (8). No LES, uma assinatura de gene de neutrófilos é um forte preditor de doença ativa, incluindo NL e lúpus cutâneo (17, 18). Os neutrófilos são encontrados em lesões cutâneas (13, 14), bem comorimespécimes de biópsia (15, 16) de pacientes com LES, e suas propriedades inflamatórias foram atribuídas, em parte, à formação do TNE (16). Esse processo inclui maior produção de ROS (55), liberação de DNA mitocondrial (55) e liberação e indução de proteínas inflamatórias, como s100A9 (56), IL-1b (57) e interferons tipo I (55 , 58). Nossas descobertas de que a inibição da migração de neutrófilos para o rim anulou a s100A9 e reduziu significativamente a expressão de IL-1be arimA pontuação do IFN sugere que funções inflamatórias semelhantes podem estar em jogo. Relevante para a doença renal no LES, os neutrófilos localizam-se principalmente no endotélio TI, local de maior expressão delesão renalmarcadores kim-1 e lipocalina-2 em tecidos renais LN (59,60). A proteinúria pode surgir devido à permeabilidade excessiva da barreira glomerular às proteínas devido à reabsorção prejudicada da proteína pelos túbulos ou uma combinação desses mecanismos (61). A lesão de TI em pacientes com LES é um achado patológico frequente em rins LN, incluindo aqueles com lesão glomerular leve (61, 62). Foi demonstrado que a lesão de TI prediz a gravidade da NL (63, 64), mas os mecanismos que a desencadeiam são desconhecidos. Como kim-1 e lipocalina-2 elevados são marcadores reconhecidos de lesão de TI no LES (26, 65) e bloqueando a migração de neutrófilos para oriminibiram sua expressão, propomos que a proteinúria transitória observada após a exposição à UV é uma consequência da inflamação subclínica de TI mediada por neutrófilos (65). A expressão aumentada de vcam-1 renal, outro marcador de lesão de TI no LES (66), apoia ainda mais esse modelo.

Além de propagar a inflamação nos sítios locais de lesão estéril ou infecciosa, os neutrófilos podem se alojar em órgãos distantes (8-10), onde, dependendo do contexto, contribuem para a lesão tecidual via produção de ROS (11) ou ativam o sistema imunológico adaptativo nos gânglios linfáticos e na medula óssea (9, 12). A natureza inflamatória desses neutrófilos tem sido atribuída à sua capacidade de sair do local primário da lesão e migrar para locais secundários, ou seja, sofrer rTEM (9-11, 31-34). Nossos achados de que a PA de células contendo GFP na pele após exposição UV levou à detecção de GFP mais neutrófilos norimcom o fenótipo de rTEM sugerem que uma subpopulação derenalneutrófilos migraram de forma reversa da pele exposta a UV (GFP mais neutrófilos compõem ~ 20 por cento darimneutrófilos e destes, 20 a 35 por cento são rTEM; portanto, rTEM representam 4 a 7 por cento do totalrimneutrófilos). Esta proporção de rTEM é comparável à proporção relatada após lesão hepática estéril (~9 por cento) (36) e lesão de isquemia-reperfusão (~8 por cento) (11). Em outras circunstâncias, o rTEM demonstrou ser pró-inflamatório (10, 11) e ter apoptose prejudicada (35), levando à possibilidade de que eles desempenhem um papel na indução de UV.lesão renal.A expressão elevada de CXCR4 nestes neutrófilos é particularmente relevante, como uma coincidênciarenalexpressão de cxcl12, um ligante CXCR4 expresso por podócitos e túbulos (24), foi observada, provavelmente fornecendo um sinal quimiotático para esta população de neutrófilos. Expressão aumentada de CXCR4 em células imunes juntamente com altos níveis derenalCXCL12 foram identificados em pacientes com LES com NL (67), e essa via foi implicada no lúpus, bem como na isquemia-reperfusãolesão renalem camundongos (24, 68). Além de ser um marcador de rTEM, o aumento da expressão de CXCR4 também é um indicador de neutrófilos "envelhecidos", que podem mediar respostas inflamatórias prejudiciais aos tecidos (38). O papel preciso do CXCR4 no recrutamento de neutrófilos para orimpode ser investigado pelo antagonismo de CXCR4 como feito anteriormente em outros modelos de lesão estéril (38).

A migração de neutrófilos específica do tecido e os mecanismos responsáveis ​​pela expressão diferencial de moléculas de adesão em diferentes órgãos não são bem compreendidos (69). Níveis mais altos de expressão da quimiocina cxcl12 norimmas não o pulmão poderia explicar a presença preferencial de neutrófilos CXCR4hi no rim. Além disso, a indução da expressão de vcam-1 e e-selectina no rim, em comparação com nenhuma alteração na expressão no pulmão, provavelmente contribui para o recrutamento e retenção de neutrófilos preferencial no rim. O aumento de 5- a 6-vezes na expressão de s100A9 no pulmão em comparação com um aumento de 30- a 60-vezes no rim, bem como um aumento de 6-vezes na expressão de il-1b no pulmão em comparação com o aumento de 16-vezes no rim indicam ainda diferenças teciduais na resposta inflamatória. A redução na infiltração de neutrófilos do rim após a neutralização de G-CSF pode ser atribuída a uma redução nos números circulantes e ativação de neutrófilos, bem como a uma redução na expressão local de vcam-1 e e-selectina. No entanto, não podemos ter certeza se a regulação positiva inicial dessas moléculas de adesão após a exposição à UV da pele é atribuída a citocinas/DAMPS derivadas da pele ou se os neutrófilos, através da liberação de serina proteases, contribuem diretamente para sua expressão, como foi demonstrado em outros estudos. contextos (70). Independentemente dos mecanismos, e observando que não realizamos uma análise abrangente de todos os tecidos, nossos estudos fornecem evidências de alguma seletividade de órgãos nos efeitos sistêmicos mediados pela luz UV. Estudos futuros abordarão as consequências funcionais específicas do tecido da disseminação sistêmica de neutrófilos, por exemplo, vazamento de albumina vascular e formação de edema no pulmão (11, 36).

Em pacientes com LES, é difícil relacionar inequivocamente a exposição à luz UV da pele a exacerbações da doença sistêmica, pois há variação significativa (1 a 3 semanas) nas respostas visíveis de fotossensibilidade em diferentes indivíduos (21). Além disso, subclínicalesão renalpode ser facilmente perdida até que exposições consecutivas à luz UV componham os efeitos. Enquanto descobrimos que mediado por neutrófilosinflamação renalem resposta à luz UV não causa doença clínica em camundongos saudáveis, tal mecanismo pode contribuir para os surtos de LN em pacientes com lúpus fotossensíveis de várias maneiras. O envolvimento do receptor Fc por complexos imunes pode aumentar o recrutamento de neutrófilos, resultando em ROS e liberação de protease (71); a capacidade aumentada de neutrófilos lúpicos e LDGs para produzir NETs, ​​que, em pacientes com LES, não são eliminados de forma eficiente (72), poderia levar à liberação de proteases prejudiciais ao tecido (73), propagação da resposta IFN-I (58) , ou danos diretos aorimendotélio criando danos vasculares e extravasamento (16). Além disso, as diferenças subjacentes na pele do lúpus, como sinalização aprimorada de IFN-I (5, 74) e defeitos na população de células de Langerhans protetoras (75), podem informar a extensão e a natureza das respostas sistêmicas mediadas por neutrófilos. O rastreamento da migração de neutrófilos juntamente com a interrogação de autoanticorpos, acúmulo de células apoptóticas e baixos níveis de complemento pode ser abordado usando novos modelos de lúpus, como mutantes triplos geneticamente definidos (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− e Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) ou outras cepas de lúpus após exposição à luz UV.

Os mecanismos exatos que ligam os neutrófilos à inflamação no LES podem, além disso, ser influenciados pelo fenótipo neutrófilo/LDG, uma vez que a heterogeneidade dentro dessas populações se tornou mais aparente (77). Nossos achados de populações circulantes elevadas de CXCR4 e ICAM1hiCXCR1lo (rTEM), particularmente em LDGs do LES, aumentam ainda mais essa heterogeneidade e sugerem que alguns dos granulócitos mais pró-inflamatórios no sangue podem ter "experiência tecidual" anterior, ou seja, residência no tecidos de órgãos afetados, como a pele, antes da disseminação sistêmica. Os fenótipos rTEM foram relatados anteriormente no líquido sinovial e neutrófilos circulantes de pacientes com artrite reumatóide (35, 78) e em lesão pulmonar associada à pancreatite aguda (79). Seu papel no LES merece uma investigação mais aprofundada.

CISTANCHE VAI MELHORAR A DOR RENAL/RENAL

Materiais e métodos

Ratos.Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington, Seattle. Os experimentos iniciais foram conduzidos usando camundongos C57BL/6J machos e fêmeas (Jackson Laboratory, 3 a 4 meses de idade, Figs. 1 e 2). Camundongos fêmeas foram usados ​​para todos os experimentos subsequentes. Os estudos de PA foram realizados em B6. Camundongos fêmeas Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J (Jackson Laboratory, 3 a 4 meses de idade). Esses camundongos foram gerados por injeção de um vetor transgênico carregando PAGFP (variante T203H) sob o controle transcricional do promotor da ubiquitina C humana em embriões C57BL/6. Os animais foram alojados em condições livres de patógenos e mantidos em ciclos claro-escuro de 12 h com acesso ad libitum a comida e água. Os experimentos em todos os animais foram realizados no mesmo horário do dia para evitar a influência do ritmo circadiano na migração de neutrófilos (38).

Exposição à luz UVB e decapagem de fita.O aspecto dorsal dos camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foi raspado pelo menos 24 h antes da irradiação com luz UVB, e apenas os camundongos com pele não pigmentada foram utilizados nos experimentos. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e expostos a uma dose de luz UVB (500 mJ/cm2) utilizando lâmpadas FS40T12/UVB (National Biological Corporation), com pico de emissão entre 300 e 315 nm. A energia da luz UVB na superfície dorsal foi medida com um radiômetro Photo light IL1400A equipado com um detector SEL240/UVB (International Light Technologies). Os camundongos foram sacrificados 1, 2 ou 6 d após a exposição à luz UVB, e camundongos não irradiados foram usados ​​como controles (D-1) (Fig. 2A). A remoção da fita epidérmica foi realizada conforme descrito anteriormente (7), e a pele erimforam avaliados 24 h após a lesão

Inibição de IL-17A e G-CSF.Os camundongos foram tratados intravenosamente com 100 µg de IL -17A IgG de rato purificada (BioLegend) ou controle de isotipo 3 h antes da exposição à luz UV (1 × 500 mJ/cm2) (Fig. 3I). Presença de neutrófilos no sangue, pele e perfusão salinarimo tecido foi avaliado por citometria de fluxo 24 h após a exposição UV como descrito abaixo. A migração de neutrófilos em resposta à luz UV foi inibida pelo tratamento intraperitoneal de camundongos com 50 ug de anticorpo monoclonal anti-G-CSF de camundongo ou controle de isotipo de IgG de camundongo (R&D Systems) 24 h e 3 h antes da exposição da pele à luz UVB (1 × 500 mJ /cm2) (Fig. 4A). Após a perfusão cardíaca, os números de neutrófilos e monócitos norimforam avaliados por citometria de fluxo e expressão gênica por qPCR, conforme descrito abaixo. Camundongos não expostos à luz UVB foram usados ​​como um grupo controle adicional.

Isolamento de Células de Diferentes Órgãos.Após a eutanásia com inalação de CO2, um pedaço de pele dorsal foi removido e mantido em solução de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) em gelo até o processamento. O sangue foi coletado por punção cardíaca em seringas revestidas com ácido etilenodiaminotetracético. A perfusão cardíaca foi subsequentemente realizada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (~60 mL) através do ventrículo esquerdo após corte do átrio direito. A perfusão bem sucedida foi determinada pela observação completarime palidez pulmonar. Pulmões, rins, baço e ambos os fêmures foram removidos cuidadosamente e colocados em solução de RPMI no gelo até o processamento da amostra. As células foram isoladas de áreas equivalentes de tecido da pele (~30 mm2) por trituração e digestão do tecido com 0,28 unidades/mL Liberase TM (Roche) e 0,1 mg/mL de Desoxirribonuclease I ( Worthington) em PBS com Ca mais 2 e Mg mais 2 por 60 min a 37 graus com agitação. As células foram isoladas de umrimpor animal;rimos tecidos foram picados e digeridos em 2 mg/mL de colagenase tipo I (Worthington) por 30 min a 37 graus de acordo com um protocolo publicado. As células pulmonares foram colhidas por digestão do tecido em PBS (Ca mais 2 e Mg mais 2) com 1 mg/mL de colagenase tipo 1 e 60 U de desoxirribonuclease I. Os baços inteiros foram esmagados em um filtro de células de 40 μm e lavados com solução de RPMI. Sangue total e células do baço, medula óssea, rins e pulmões foram tratados com tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) 1X (BD Biosciences). Após o isolamento/digestão, as células de todos os tecidos foram filtradas (40 μm), lavadas com PBS e ressuspensas em solução RPMI antes da contagem.

Coloração e Análise de Citometria de Fluxo.As células foram tratadas com Fc Block TruStain FcX (Biolegend) e coradas com corante Zombie Aqua Viability (Biolegend) de acordo com as recomendações do fornecedor. As células foram lavadas e a coloração da superfície foi realizada usando anticorpos fluorescentes específicos de camundongo adquiridos da Biolegend. Diferentes populações de células mieloides foram analisadas no portão de células imunes vivas (Zombie Aqua-CD45 plus). A porcentagem e o número de neutrófilos (Ly6CintLy6Ghi) e monócitos (Ly6C mais Ly6G−) foram quantificados. O portão de citometria de fluxo representativo é apresentado no Apêndice SI, Fig. S10. A expressão percentual e as intensidades médias de fluorescência dos marcadores de superfície no modelo PA (CXCR4, ICAM1 e CXCR1) foram determinadas usando controles de coloração de fluorescência menos um (FMO) no portão de neutrófilos (Ly6Ghi). Todas as amostras foram processadas usando citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter) e os dados foram analisados ​​com o software FlowJo versão 10 (Tree Star).

Estudos de fotoativação (PA).Ratos UBC-PA-GFP foram raspados e uma porção das costas foi irradiada com uma dose de luz UVB (500 mJ/cm2) como acima. Apenas a área da pele que será fotoconvertida foi exposta à luz UVB, enquanto a pele restante foi coberta com papel alumínio. Após 24 h da lesão estéril induzida por UVB, toda a região da pele irradiada com UVB foi submetida à luz violeta (405 nm) usando uma lâmpada de diodo emissor de luz de 50 W com fibra de abertura numérica (NA) de 0,37 (Mightex) na potência de 100 mW (15 min de exposição por área). Este método foi otimizado com base em um protocolo publicado de fotoconversão específica da pele (80).Rinse os pulmões foram coletados e processados ​​para análise por citometria de fluxo 24 h após o PA, conforme descrito acima. A abordagem e o cronograma estão descritos no diagrama da Fig. 5A. A porcentagem de GFP mais neutrófilos norimfoi comparado com o encontrado em camundongos sob três condições de controle: 1) sem UV e sem PA, 2) UV, mas sem PA e 3) sem UV, mas PA. Níveis de expressão de CXCR4 e fenótipo ICAM1hiCXCR1lo dentro de GFP plus e GFP- neutrófilos na pele erimforam avaliados por citometria de fluxo usando anticorpos marcados fluorescentemente específicos de camundongo adquiridos da Biolegend. Para determinar se a GFP mais neutrófilos norimoriginada da pele e não do sangue, a pele de um grupo de camundongos foi exposta à luz UV e PA conforme descrito acima (Grupo I), enquanto em outro grupo, a pele foi exposta à luz UV, mas a PA foi realizada na área da pele adjacente não exposto à luz UV (Grupo II) (diagrama no Apêndice SI, Fig. S7A).Rinsforam coletados e processados ​​para análise de citometria de fluxo como descrito acima.

Expressão Gênica e Análise Proteômica.Pele,rim,e as amostras de pulmão foram armazenadas em solução de RNAlater (QIAGEN). O RNA foi extraído pelo RNeasy Kit da QIAGEN e o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando o High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Os transcritos de quimiocinas inflamatórias, citocinas e moléculas de adesão foram quantificados por qPCR em tempo real usando os primers listados no Apêndice SI, Tabela S1 e normalizados para a média dos níveis de transcrição 18S. A dose de luz UVB utilizada não afetou a expressão de 18S em nenhum dos órgãos. A expressão relativa de alvos de mRNA foi determinada usando a fórmula padrão 2^(−Ct) × coeficiente. As pontuações de IFN foram derivadas da expressão de 10 genes representativos estimulados por interferon (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 e ifi27l2a) conforme descrito anteriormente (6). A média e SD da expressão relativa de cada ISG foram determinados norinsde camundongos não expostos à luz UV (meannoUV e SDnoUV). Estes foram então usados ​​para padronizar os níveis de expressão de cada ISG nos rins de camundongos tratados (isotipo IgG mais UVB ou a-GCSF mais UVB). Os níveis de expressão padronizados foram então somados para cada camundongo para derivar uma pontuação de expressão de IFN; i=expressão de cada ISG; Tratamento gênico=nível relativo de expressão gênica após o tratamento; e Gene inoUV=nível de expressão gênica relativa em camundongos não expostos à luz UVB. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Os níveis de proteína no plasma e extratos de proteína do tecido da pele foram medidos usando painéis de analitos definidos LEGENDplex Mouse Inflammation Panel e Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

Coloração IF de tecidos renais congelados.Perfusão salinarinsforam fixados em paraformaldeído a 4 por cento por 1 h em temperatura ambiente e, após imersão em 30 por cento de sacarose, congelados em meio de corte ótimo (Sakura Finetek). As seções de tecido 5-μm foram reidratadas em PBS antes da coloração IF. Os tecidos foram permeabilizados com 0,1 por cento de Triton X-100 em PBS e posteriormente bloqueados em PBS mais 0,1 por cento de Triton X-100/5 por cento de BSA (albumina de soro bovino)/5 por cento de soro de coelho . As células NE e endoteliais foram detectadas por coloração com anti-camundongo NE Cy5 (1:100, Bioss) e anti-camundongo PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), respectivamente, a 4 graus durante a noite. Presença de neutrófilos norimfoi confirmado por coloração com Ly6G Al647 anti-ratinho (1:100, Biolegend). Os tecidos foram montados usando ProLong Gold com meio de montagem 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen) e fotografados com microscópio fluorescente Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Avaliação Histológica da Pele.Seções de tecido de pele embebidas em parafina e fixadas em formalina (4 a 5μm) foram coradas com hematoxilina e eosina no Centro de Histologia e Imagem da Universidade de Washington antes da UV, dia 1, dia 2 e dia 6 após irradiação UVB (n {{ 7}} fêmeas). A pele foi pontuada de forma cega para os seguintes parâmetros: inflamação da derme/subcutâneo, morte das células epidérmicas, acantose, hiperqueratose, formação de crostas serocelulares e erosão/ulceração. Esses parâmetros foram pontuados em uma escala de 0 a 4, dependendo da gravidade e extensão, com exceção da erosão/ulceração, que foi pontuada como presente (1) ou ausente (0). Imagens representativas foram tiradas usando NIS-Elements BR 3.2 64bit e revestidas no Adobe Photoshop com ajustes de iluminação aplicados a toda a imagem. A ampliação original é indicada.

Medições de urina.Os níveis de proteína na urina foram avaliados pelo ensaio de proteína de Bradford (Thermo Fisher Scientific). As amostras de urina foram testadas na diluição de 1:40 em PBS, e a concentração de proteína na urina foi determinada com base em diluições em série de concentrações conhecidas de BSA. A razão albumina/creatinina na urina foi avaliada usando o ensaio de albumina Albuwell e o Creatiine Companion Kit (Exocell) de acordo com as instruções do fabricante.

Coleta de Amostras Humanas e Análise de Citometria de Fluxo.Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão de Instituições da Universidade de Washington (STUDY00001145). O sangue total foi coletado em tubos heparinizados de voluntários saudáveis ​​e pacientes com LES após consentimento informado. Neutrófilos (PMNs) e PBMCs foram isolados por separação de gradiente descontínuo Ficoll-Paque (GE Healthcare). PMNs foram purificados a partir do sedimento de eritrócitos por 5 por cento de sedimentação de dextrano. Após a lise de RBC, as células foram coradas com anticorpos marcados com fluorescência adquiridos da Biolegend, e a expressão de CXCR4 e a porcentagem de células ICAM1hiCXCR1lo foram avaliadas em PMNs (CD66b plus) e LDGs (CD15 plus, CD14lo e CD10 plus em PBMCs (19)). A estratégia de gating para coloração de LDGs e ICAM1hiCXCR1lo com base em FMO é mostrada no Apêndice SI, Fig. S11. As amostras foram processadas usando citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter), e os dados foram analisados ​​com o software FlowJo versão 10 (Tree Star).

Análise estatística.Os dados foram analisados ​​usando o software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) e apresentados como média ± SEM. A diferença estatística entre os dois grupos de dados foi determinada em relação aos controles não irradiados (D-1) usando o teste de Student. ANOVA de uma via com comparações múltiplas e post hoc de Tukey foi usado para determinar a significância estatística entre os três grupos.