Acteoside como uma opção terapêutica potencial para o carcinoma hepatocelular primário: um estudo pré-clínico

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Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen e Zhiyong Wang

Abstrato

Introdução: O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor maligno comum com características de mau prognóstico, alta morbidade e mortalidade em todo o mundo. Em particular, apenas algumas opções de tratamento sistêmico estão disponíveis para pacientes com CHC avançado e incluem sorafenibe e o regime recentemente descrito de atezolizumabe mais bevacizumabe como possíveis tratamentos de primeira linha. Propomos aqui o acteosídeo, um glicosídeo feniletanoide amplamente distribuído em muitas plantas medicinais, como um potencial candidato contra o CHC avançado.

Métodos: A proliferação celular, a formação de colônias e a migração foram analisadas nas três linhagens celulares humanas de HCC BEL7404, HLF e JHH-7. O ensaio de angiogênese foi realizado usando HUVESs. O modelo de camundongos nus de xenoenxerto BEL7404 ou JHH-7 foi estabelecido para analisar os possíveis efeitos antitumorais do acteosídeo. qRT-PCR e western blotting foram usados ​​para revelar os potenciais mecanismos antitumorais do acteosídeo.

Resultados:Acteoside de cistancheinibiu a proliferação celular, a formação de colônias e a migração em todas as três linhagens de células HCC humanas BEL7404, HLF e JHH-7. A proibição da angiogênese por acteosídeo foi revelada pela inibição da formação de tubos e migração celular de HUVECs. A combinação de acteosídeo e sorafenibe produziu uma inibição mais forte da formação de colônias celulares e migração das células HCC, bem como da angiogênese de HUVECs. A eficácia antitumoral in vivo do acteosídeo foi ainda demonstrada no modelo de camundongos nude BEL7404 ou JHH-7 xenoenxerto, com um aprimoramento quando combinado com sorafenibe na inibição do crescimento do xenoenxerto JHH-7. O tratamento adicional de células JHH-7 com acteosídeo revelou um aumento no nível da proteína supressora de tumor p53, bem como uma diminuição do nível do gene da peptidase relacionada à calicreína (KLK1, 2, 4, 9 e 10) sem alterações do resto dos genes KLK1-15.

Conclusões:Acteoside de cistancheexerce um efeito antitumoral possivelmente através da sua regulação positiva dos níveis de p53, bem como da inibição da expressão de KLK e da angiogénese. Acteoside pode ser útil como adjuvante no tratamento do CHC avançado na clínica.

Palavras-chave: Acteoside, Carcinoma hepatocelular, Sorafenibe, Xenoenxerto, p53, Calicreína

Fundo

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor maligno comum com características de mau prognóstico e alta morbidade e mortalidade em todo o mundo [1, 2]. Vários fatores foram identificados para contribuir para a ocorrência e progressão do CHC, incluindo a infecção pelo vírus da hepatite B ou C, a inativação de genes supressores de tumor, como p53, a ativação anormal de oncogenes, como K-ras, e algumas moléculas de sinalização como PI3K, ERK/MAPK e Wnt/-catenina, bem como a evasão do sistema imunológico do hospedeiro [3, 4]. Para o manejo do CHC, ressecção, transplante hepático e ablação por radiofrequência são opções para pacientes com CHC em estágio inicial, porém com altas taxas de recorrência e metástase [3, 5, 6]. Além disso, apenas algumas opções de tratamento sistêmico estão disponíveis para pacientes com CHC avançado e incluem sorafenibe e o regime recentemente descrito de atezolizumabe mais bevacizumabe como possíveis tratamentos de primeira linha [7]. Nesse contexto, é de importância e interesse desenvolver novos agentes direcionados a múltiplos alvos moleculares ou estabelecer uma nova estratégia como a aplicação de terapia combinada no tratamento do CHC avançado.

Acteoside de cistancheé um glicosídeo feniletanoide amplamente distribuído em muitas plantas medicinais, incluindo Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] e Ligustrum purpurascens [10]. Evidências crescentes mostraram que o acteosídeo pode exercer várias atividades biológicas, incluindo sua atividade antitumoral. Por exemplo, o acteosídeo mostrou fortes efeitos antiproliferativos nas células cancerígenas da próstata [11]. A entrega intraperitoneal de acteosídeo suprimiu o crescimento tumoral em um modelo de camundongo com melanoma, possivelmente através da inibição da proteína quinase C [12]. Além disso, o acteosídeo potencializou a sensibilização das células do câncer colorretal ao 5- Fluorouracil via direcionamento da sinalização PI3K/Akt [13]. Nossos dados anteriores também mostraram inibição da melanogênese por acteosídeo em células de melanoma B16 [14]. Apesar disso, pouca informação está disponível sobre a possível eficácia do acteosídeo no tratamento do CHC e os potenciais mecanismos subjacentes.

No presente estudo, mostramos queActeoside de cistancheinibe a proliferação celular, a formação de colônias e a migração em todas as três linhas de células humanas HCC BEL7404, HLF e JHH7. A angiogénese também é inibida após tratamento com acteósido, como demonstrado pela inibição da formação de tubos e migração celular de HUVECs. A eficácia antitumoral in vivo do acteosídeo é ainda demonstrada no modelo de camundongos nude BEL7404 ou JHH-7 xenoenxerto, com um aprimoramento quando combinado com sorafenibe na inibição do crescimento do xenoenxerto JHH-7. Os efeitos antitumorais do acteosídeo podem ser atribuídos à sua regulação positiva de p53, bem como à supressão de KLKs e angiogênese.

Métodos

Cultura de células

As linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano (HCC) BEL7404, HLF e JHH7 foram obtidas da American Type Culture Collection e foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM contendo 10 por cento de soro fetal bovino suplementado com 100 unidades/ml de penicilina G e 100 ug/ml de estreptomicina em uma incubadora umidificada a 37 graus com 5 por cento de dióxido de carbono. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram isoladas das veias do cordão umbilical humano (fornecidas pelo ScienCell Research Laboratories, San Diego, EUA) e mantidas em um meio de células endoteliais conforme descrito anteriormente [15].

ReagentesActeoside de cistanche (A01) foi adquirido da Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, China; Lote nº 100581; Pureza maior ou igual a 99 por cento por HPLC). O sorafenibe foi obtido da Selleck Chemicals (Houston, EUA). Dissolvemos o acteosídeo em solução salina a 0,9%. A solução estoque de sorafenibe foi preparada em dimetilsulfóxido (DMSO; 10 mM), dividida em alíquotas e armazenada a -20 graus.

Animais

Camundongos machos BALB/c (Nu/Nu) (18-20 g, 6-8 semanas no momento do recebimento) foram usados ​​no estudo (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Xangai, China). Os animais foram alojados em gaiolas de polisulfona ventiladas individualmente em uma sala com temperatura e luz controladas (12 h luz- 12 h ciclo escuro, luzes acesas às 7:00 am) com livre acesso a comida e água . Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee e realizados seguindo as diretrizes da International Association for the Study of Pain sobre o uso de animais de laboratório.

Ensaio de proliferação celular A atividade antiproliferativa foi realizada utilizando o ensaio MTT. Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade de 4–5 × 103 células por poço em 96-placas de poço. Após serem ligadas durante a noite, as células foram tratadas com uma série de concentrações de acteosídeo. Após os tratamentos com drogas no ponto de tempo indicado, as células foram incubadas com 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, EUA. Concentração final: 5 ug/ml) por 3–4 h a 37 graus. O produto formazan foi dissolvido em DMSO para quantificação a um comprimento de onda de 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 células foram contadas sob um microscópio de luz (ampliação × 100; Olympus, Tóquio, Japão).

Ensaio de cicatrização de feridas As células foram semeadas em placas de {0}}poços (1 × 105 células por poço) e cultivadas até 90 por cento de confluência. A camada de células foi arranhada com uma ponta de pipeta estéril de 200 ul para produzir uma lacuna na ferida. A migração celular para a área ferida foi visualizada em pontos de tempo indicados (0, 10 e 24 h) sob um microscópio de luz invertida com uma ampliação de 100 ×. Cada experiência foi realizada em triplicado.

Ensaio de formação de tubo As HUVECs foram cultivadas como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, as 96-placas de poços foram revestidas com Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, retornaram à incubadora para polimerizar por 30 a 40 min. As HUVECs foram então semeadas a uma densidade de 2 × 105 células/mL e tratadas com vários medicamentos por 8 h. A formação do tubo foi fotografada com um microscópio invertido nos pontos de tempo indicados e analisada usando o software ImageJ.

Análise de Western blotting

Os lisados ​​celulares totais foram preparados com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (50 mM Tris HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 por cento NP40, 1 por cento de desoxicolato de sódio, 0,1 por cento SDS, 10 ug/ml de leupeptina, 10 ug/ml de aprotinina e 2 mM de PMSF). Amostras de proteína com quantidades iguais (20 µg/pista) foram separadas em gel SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram incubadas durante a noite com anticorpo p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Para os controlos de carga, as membranas foram lavadas com um tampão de separação e novamente sondadas com o anticorpo -actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). As proteínas foram detectadas usando um sistema de detecção ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, EUA).

qRT-PCR

O RNA total foi extraído de linhagens celulares usando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA) e submetido a uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) para sintetizar o cDNA usando um kit comercialmente disponível. O qRT-PCR em tempo real usando 2xSYBR green qPCR Supermix foi realizado na máquina Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, EUA). As sequências de iniciadores foram mostradas abaixo: sentido 5'-CAACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' e anti-sentido 5'-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' para KLK1; sentido 5'-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3'' e anti-sentido 5'-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3'' para KLK2; sentido 5'-CCACACCC GCTCTACGATATGA-3'' e anti-sentido 5'-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3' para KLK3; sentido 5'-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3' e anti-sentido 5'- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3' para KLK4; sentido 5'-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3'' e anti-sentido 5'-GGTAAGCATCCCTCGCACCTT-3'' para KLK5; sentido 5'-CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3'' e anti-sentido 5'-TCCGCCATGCACCAACTTAT-3' para KLK6; sentido 5'-TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3'' e anti-sentido 5'-GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3'' para KLK7; sentido 5'-CTGGGCAGGACACTCCAG-3'' e anti-sentido 5'-ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3'' para KLK8; sentido 5'-GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3'' e anti-sentido 5'-CGGTGACGTCATAGAGACGG-3'' para KLK9; sentido 5'-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3'' e anti-sentido 5'-CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3'' para KLK10; sentido 5'-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3'' e anti-sentido 5'-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3'' para KLK11; sentido 5'-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3' e anti-sentido 5'-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3' para KLK12; sentido 5'-CCTGAACCACGACCATGACA-3'' e anti-sentido 5'-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3'' para KLK13; sentido 5'-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3'' e anti-sentido 5'-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3' para KLK14; sentido 5'-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3'' e anti-sentido 5'-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3' para KLK15; sentido 5'-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3' e anti-sentido 5'- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3' para GAPDH. Os valores de limiar de ciclo (Ct) de cada gene KLK foram normalizados para GAPDH e analisados ​​com o software MxPro.

Atividade antitumoral in vivo de A01 isoladamente ou em combinação com sorafenibe As suspensões de células BEL7404 foram preparadas (3 × 106 células) e injetadas por via subcutânea no flanco direito de ratos nus atímicos. Dez dias após a inoculação, camundongos portadores de tumor (peso corporal (g):22-26; média ± SEM:23,8 ± 0,14) foram selecionados e selecionados para randomização em 7 grupos de tratamento após o volume do tumor ({ {12}} mm3). Um total de 38 camundongos foram atribuídos a diferentes grupos de tratamento (n=5 por grupo, exceto para o grupo modelo (n=8)). Os animais foram então tratados por gavagem oral com acteosídeo (A01; 12,5, 25 e 50 mg/kg), sorafenibe sozinho (50 mg/kg) ou em combinação com A01 (50 mg/kg) uma vez ao dia por 14 dias. Além disso, uma dose de 20 mg/kg de A01 também foi administrada por via intravenosa. As doses foram selecionadas com base em estudos anteriores e em nossos dados preliminares [15]. O crescimento do tumor foi monitorado a cada 3 ou 4 dias usando um paquímetro eletrônico, com o volume calculado como 0,5 x comprimento x largura (mm3). Além disso, um experimento paralelo usando inoculação de JHH-7 foi incluído. Sete dias após a inoculação, camundongos portadores de tumor (peso corporal (g): 20-26; média ± SEM: 24,0 ± 0,20) foram selecionados para randomização em grupos de tratamento de acordo com o volume do tumor (80-130 mm3 ). Um total de 23 camundongos foram atribuídos a 4 grupos de tratamento (n=5 por grupo, exceto para o grupo modelo (n=8)). Os animais então receberam A01 (20 mg/kg, iv), sorafenibe sozinho (50 mg/kg, ig) ou combinado com A01 (20 mg/kg, iv) uma vez ao dia por 14 dias consecutivos. Todos os camundongos foram anestesiados com hidrato de cloral (350 mg/kg) e sacrificados por deslocamento do pescoço no final do período de observação. E a massa tumoral foi removida e fotografada com uma câmera digital.

Análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Salvo indicação em contrário, as análises estatísticas foram realizadas usando análise de variância (ANOVA) seguida de um teste posthoc de Tukey. Os valores do volume tumoral são mostrados como média ± erro padrão da média (SEM). ANOVA de duas vias seguida de testes de Tukey foi usada para analisar os dados de volume do tumor. O software GraphPad Prism foi utilizado para as análises estatísticas. Um valor de p < 0,05="" foi="" considerado="" estatisticamente="">

Resultados

Efeitos de A01 na proliferação e formação de colônias de HCCs in vitro

As três linhagens celulares de HCC (BEL7404, HLF e JHH7) foram usadas para o ensaio de proliferação celular. Conforme mostrado na Fig. 1, o ensaio MTT revelou que A01 inibiu a proliferação de todas as três células HCC. Para perguntar ainda se a atividade antiproliferativa de A01 era devido à sua capacidade de inibir a clonogenicidade celular, o ensaio de formação de colônias foi realizado. A01 a 100 μM mostrou forte inibição da formação de colônias em células BEL7404 (Fig. 2a eb). Quando combinado com sorafenibe (2 μM), a potência de inibição foi mais forte do que a de A01 ou sorafenibe sozinho. Resultados semelhantes também foram observados nas outras duas células HCC, HLF e JHH-7 (Fig. 2c e d).

Efeitos de A01 sozinho ou em combinação com sorafenibe na migração celular de HCCs in vitro

Em seguida, avaliamos a migração celular usando o ensaio de feridas por raspagem. Conforme mostrado na Fig. 3, a combinação de A01 (100 ou 500 μM) e sorafenibe (10 μM) impediu significativamente a cicatrização de feridas em todas as três células HCC, quando comparada com o grupo controle. Para células BEL7404, tanto A01 (100 ou 500 μM) quanto sorafenibe (10 μM) produziram apenas uma tendência de prevenção da cicatrização de feridas sem significância estatística (Fig. 3a e d). Para células HLF, A01 a 500 μM e sorafenibe a 10 μM inibiram a cicatrização de feridas. Em particular, A01 (500 μM) combinado com sorafenibe (10 μM) produziu uma inibição mais forte da cicatrização de feridas do que o sorafenibe sozinho (Fig. 3b e e). Para células JHH, a cicatrização de feridas foi impedida por A01 (500 μM) e sorafenibe (10 μM). A combinação de A01 (100 μM) e sorafenibe (10 μM) produziu uma inibição mais forte da cicatrização de feridas do que A01 (100 μM) ou sorafenibe (10 μM) sozinho. Além disso, A01 a 500 μM combinado com sorafenibe (10 μM) mostrou uma inibição mais forte da cicatrização de feridas do que A01 (500 μM) ou sorafenibe (10 μM) sozinho (Fig. 3c e f).

Efeitos de A01 sozinho ou em combinação com sorafenibe na angiogênese in vitro

A angiogênese está intimamente associada ao crescimento tumoral, progressão e metástase [16], e, portanto, é considerada um dos alvos intervenientes para o tratamento do câncer. Primeiro, realizamos um ensaio de formação de tubos para analisar a potencial angiogênese in vitro. Conforme mostrado na Fig. 4, o tratamento por 3 h com sorafenibe sozinho (10 μM) ou a combinação de A01 (100 e 500 μM) e sorafenibe (10 μM) começou a mostrar efeitos inibitórios na formação de estruturas semelhantes a vasos, ou seja o alongamento e alinhamento das HUVECs (Fig. 4a e c). Após o tratamento por 8 h, A01 (100 e 500 μM), sorafenibe (10 μM), bem como a combinação de A01 e sorafenibe, todos inibiram significativamente a formação de estruturas semelhantes a vasos, com inibição mais forte pela combinação de A01 e sorafenibe do que A01 ou sorafenibe sozinho (Fig. 4a e c). Além disso, a migração celular de HUVECs é um passo fundamental para a formação de novos vasos durante a angiogênese e, portanto, é investigada. Conforme mostrado na Fig. 4b e d, A01 (500 μM), sorafenibe (10 μM), bem como a combinação de A01 (100 e 500 μM) e sorafenibe (10 μM) inibiram significativamente a migração celular de HUVECs. A01 (500 μM) combinado com sorafenibe (10 μM) produziu inibição mais forte do que A01 (500 μM) ou sorafenibe (10 μM) sozinho.

Efeitos de A01 sozinho ou em combinação com sorafenibe no crescimento tumoral in vivo de xenoenxertos BEL7404 e JHH-7 HCC

Para avaliar ainda mais a eficácia de A01 sozinho ou combinado com sorafenibe no crescimento tumoral in vivo de HCC, estabelecemos um modelo de camundongo nu de xenoenxerto subcutâneo usando BEL7404 ou JHH-7 células. Conforme mostrado na Fig. 5, o volume do tumor diminuiu bastante após o tratamento com A01 (25 e 50 mg/kg, por gavagem oral; 20 mg/kg, via veia da cauda; todos p < 0,01="" vs="" grupo="" modelo)="" ou="" sorafenibe="" (50="" mg/kg,="" via="" gavagem="" oral;="" p="">< 0,01="" vs="" grupo="" modelo)="" sozinho="" (fig.="" 5a="" e="" b).="" a="" combinação="" de="" a01="" (50="" mg/kg)="" e="" sorafenibe="" (50="" mg/kg)="" mostrou="" uma="" inibição="" mais="" forte="" do="" crescimento="" tumoral="" quando="" comparada="" com="" sorafenibe="" sozinho="" (p=""><0,01), mas="" produziu="" um="" efeito="" semelhante="" ao="" a01="" sozinho="" (fig.="" 5a="" e="" c="" ).="" em="" seguida,="" usamos="" o="" modelo="" de="" camundongos="" nus="" de="" xenoenxerto="" jhh{21}}="" para="" testar="" ainda="" mais="" as="" possíveis="" eficácias="" antitumorais="" de="" a01.="" conforme="" mostrado="" na="" fig.="" 6,="" o="" tratamento="" com="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" ou="" sorafenibe="" (50="" mg/kg,="" ig)="" produziu="" uma="" inibição="" significativa="" do="" crescimento="" tumoral="" de="" jhh-7="" xenoenxerto="" (p="">< 0,01="" vs="" grupo="" modelo="" ),="" com="" maior="" inibição,="" quando="" combinados="" (fig.="" 6a="" e="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" ou="" grupo="" sorafenibe="">

Possível modulação da peptidase relacionada à calicreína e p53 porActeoside de cistanche

A peptidase relacionada à calicreína (KLK) tem sido sugerida como um biomarcador de câncer no diagnóstico e prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular devido à sua expressão desregulada [17-19]. Neste cenário, detectamos a expressão gênica de KLK1–15 na linhagem celular HCC JHH-7. Conforme mostrado na Fig. 7, o tratamento com acteosídeo produziu uma inibição significativa dos níveis de mRNA de KLK1, 2, 4, 9 e 10 (Fig. 7a-e), sem alterações significativas do restante de KLK1-15 (dados não mostrados ). Além disso, também detectamos o nível de proteína supressora de tumor p53 e revelamos um aumento pelo tratamento com acteosídeo (Fig. 7f).

Discussão

O manejo do CHC avançado tem sido intratável devido à incapacidade de diagnóstico em estágios iniciais e à quimiorresistência do tumor [5, 6]. Sorafenib, o inibidor multiquinase relatado para inibir a proliferação celular e angiogênese, juntamente com outro inibidor oral multiquinase lenvatinib tornou-se o tratamento padrão do CHC avançado [3, 5, 20, 21]. No entanto, as taxas de sobrevida global são modestas à luz das baixas taxas de resposta e inadequação nos ambientes clínicos [3, 22]. Um estudo recente mostrou que o atezolizumabe associado ao bevacizumabe produziu melhores resultados clínicos do que o sorafenibe em pacientes com CHC irressecável, tornando essa combinação uma possível nova opção de tratamento de primeira linha para CHC avançado [7]. Nesse contexto, identificamos que o glicosídeo feniletanoide,Acteoside de cistancheinibiu a proliferação celular, a formação de colônias e a migração nas três linhagens de células humanas HCC BEL7404, HLF e JHH-7, bem como a angiogênese proibida de HUVECs. A combinação de acteosídeo e sorafenibe produziu uma inibição mais forte da formação de colônias celulares e migração das células HCC, bem como da angiogênese de HUVECs. O acteosídeo apresentou eficácia antitumoral no modelo de camundongos nude BEL7404 ou JHH-7 xenoenxerto, com um aprimoramento quando combinado com sorafenibe na inibição do crescimento do xenoenxerto JHH-7. Análises posteriores revelaram um aumento em p53, bem como uma diminuição de alguns genes KLK. Assim, o possível uso de acteosídeos como coadjuvantes no tratamento do CHC avançado na clínica deve ser considerado.

Evidências crescentes têm mostrado os efeitos antitumorais deActeoside de cistancheem várias células tumorais, como células de melanoma B16, células de glioblastoma, células de câncer colorretal, células de carcinoma de células escamosas orais, células de câncer de próstata e células de adenocarcinoma de mama humano [11-13, 23-25] ou em animais portadores de tumores [12]. Apesar disso, poucos estudos se concentraram nos efeitos do acteosídeo no CHC in vitro ou in vivo, exceto um estudo usando dietilnitrosamina como carcinógeno para induzir hepatocarcinogênese em ratos e revelando a quimioprevenção pelo acteosídeo [26]. No presente estudo, mostramos a inibição pelo acteosídeo da proliferação celular, formação de colônias e migração em linhagens celulares de HCC, bem como o crescimento tumoral em camundongos com xenoenxertos de linhagem celular de HCC, demonstrando diretamente os efeitos antitumorais do acteosídeo no HCC. Além disso, a combinação de acteosídeo e sorafenibe produziu efeitos antitumorais ainda mais fortes. Combinado com a evidência de que o acteosídeo é protetor contra lesões hepáticas [27-29] sem efeitos tóxicos em animais e sem mutagenicidade [30], parece ser viável para a futura aplicação da terapia combinada de acteosídeo e sorafenibe em pacientes com doença avançada CHC na clínica.

A família das calicreínas humanas compreende 15 serina proteases semelhantes a tripsina ou quimotripsina (KLK1-15) homólogas, de cadeia única, e tem sido implicada na regulação do crescimento tumoral, progressão neoplásica, angiogênese e metástase [18, 31]. Em particular, os KLKs têm sido sugeridos como um biomarcador de câncer no diagnóstico e prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular devido à sua expressão desregulada [17-19]. Por exemplo, KLK1 é proposto como o biomarcador de câncer gástrico devido à elevação dos níveis de KLK1 na neoplasia gástrica e a prevenção do crescimento tumoral no câncer gástrico pela inibição da atividade de KLK1 com proteína de ligação à calicreína (KBP) [32]. Nesse cenário, observamos uma inibição significativa dos níveis de mRNA de KLK pelo acteosídeo (KLK1, 2, 4, 9 e 10). A aplicação de KBP, que se liga especificamente à calicreína tecidual e inibe a atividade da calicreína, foi relatada para suprimir o crescimento de HCC em camundongos possivelmente através de sua atividade antiangiogênica [33], sugerindo o possível envolvimento de KLKs na progressão do HCC. Além disso, a proteína supressora de tumor p53 é capaz de induzir senescência, apoptose e parada do ciclo celular. A expressão aumentada de p53 confere maior quimiossensibilidade em células cancerígenas [34]. A este respeito, nossos resultados ocidentais mostraram um aumento nos níveis de p53 após o tratamento com acteosídeo. Tomados em conjunto, é razoável inferir que o acteosídeo exerce os efeitos antitumorais no HCC possivelmente através de sua regulação positiva de p53, bem como inibição de KLK e angiogênese.

Deve-se notar que o alvo molecular direto ao qualActeoside de cistanchepoderia ligar diretamente ainda não está claro. Nossos dados preliminares usando docking molecular revelaram ligação direta de acteosídeo com calicreína (dados não mostrados). Mais experimentos seriam necessários para esclarecer essa presunção. Além disso, quanto às doses de acteosídeo usadas para ensaio celular no estudo 1{14}}–50 vezes maior que a de sorafenibe (10 μM), primeiramente escolhemos aquelas doses de acteosídeo de acordo com o relação dose-resposta no ensaio MTT. Em segundo lugar, as doses que usamos (100, 500 μM) foram comparáveis ​​a estudos anteriores [35], nos quais o acteosídeo (100 μM) inibiu a proliferação celular de células de câncer colorretal. Por último, apesar da dose mais alta no ensaio celular, o acteosídeo produziu uma inibição pronunciada do crescimento tumoral no modelo de camundongos nude de xenoenxerto de HCC em nosso estudo (25 e 50 mg/kg), sendo os efeitos semelhantes aos do sorafenibe (50 mg/kg). Para o sorafenibe, foi usado em nosso estudo na dose de 10 μM em nível celular. Esta dose é comparável a estudos anteriores nos quais o sorafenibe inibe a viabilidade celular com um IC50 de 4,0–6,5 μM nas linhagens celulares de HCC de células PLC/PRF/5 e HepG2. Em contraste, a dose de sorafenibe usada para suprimir o crescimento de xenoenxertos de HCC em camundongos fêmeas SCID foi de 30 mg/kg (po por gavagem) [36]. Na clínica, a dosagem recomendada de sorafenibe para o paciente é de 400 mg por vez (2 x 0,2 g), duas vezes ao dia (800 mg por dia no total). Esta dosagem de sorafenibe usada na clínica é diferente daquela usada no ensaio de células (valor de IC50 em nível μM), possivelmente devido à sua baixa capacidade de absorção em condições in vivo. Para o acteosídeo, com base em sua dosagem em camundongos (50 mg/kg, ig), sua dose equivalente para humanos (60 kg PC) é de cerca de 250 mg. Esta dosagem é comparável à do sorafenibe usado na clínica e deve ser aceitável para os pacientes.

Conclusões Em conclusão,Acteoside de cistancheé capaz de exercer um efeito antitumoral em linhagens celulares HCC e em camundongos nude com xenoenxertos de linha celular HCC, efeitos possivelmente através do aumento dos níveis de p53, bem como proibindo KLK e angiogênese. Acteoside pode ser útil como adjuvante no tratamento do CHC avançado na clínica.

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