Um promissor sistema de transporte unilamelar ultrapequeno para melhor administração de mangostin à pele como um soro anti-manchas, parte 1

Abstrato: Se puder ser efetivamente entregue ao seu local de ação, o -mangostão tem potencial para desenvolver novos cosmecêuticos devido à sua atividade de bloqueio da melanogênese. Este estudo teve como objetivo desenvolver um sistema transportador unilamelar ultrapequeno para -mangostão e avaliar sua eficácia como soro anti-manchas de idade em humanos in vivo. As bases transportadoras unilamelares ultrapequenas foram otimizadas usando um 25-design fatorial, com cinco fatores (óleo de coco virgem, lecitina de soja, Tween 80 e duração e velocidade de agitação) e dois níveis (baixo e alto); a resposta do tamanho da gota foi analisada usando o Design Expert 12®. O exame anti-manchas foi realizado capturando imagens digitais da pele humana após a aplicação tópica de um transportador unilamelar ultrapequeno carregado com -mangostão à noite por duas semanas consecutivas. Os resultados foram analisados ​​usando o Motic Live Imaging 3.0 e uma pontuação padrão de vermelho, verde e azul. A fórmula de soro otimizada foi confirmada com uma composição de 2,3% de óleo de coco virgem, 1% de lecitina e 28,3% de Tween 80 (polissorbato 80) a uma velocidade de agitação de 1500 revoluções por minuto durante 15 min. A incorporação de 3% de -mangostin à fórmula de base otimizada produziu um glóbulo transportador unilamelar ultrapequeno de 16,5 nm, com um potencial zeta de -25,8 mV e um índice de polidispersão de 0,445. A caracterização física de um transportador unilamelar ultrapequeno carregado com -mangostão compreendeu 90,94 por cento de transmitância, um valor de pH de 6,5, uma viscosidade de 38 cP, gravidade específica de 1,042 g/mL e 72,46 por cento de eficiência de aprisionamento. Um microscópio eletrônico de transmissão confirmou gotas nanométricas esféricas no sistema. A aplicação tópica de um transportador unilamelar ultrapequeno carregado com -mangostão à noite por 2 semanas consecutivas demonstrou atividade antimanchas da idade demonstrada por meio de uma redução significativa na intensidade e na área das manchas em voluntários humanos (p < 0,05).

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides Cistanche têm uma capacidade robusta de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave: -mangostão; nanocarreador; transportador unilamelar ultrapequeno; soro cosmecêutico; nanoemulsão

1. Introdução

As manchas da idade (manchas hepáticas) são a forma mais comum de hiperpigmentação da pele [1]. Eles são mais comuns na pele que foi exposta ao sol por muitos anos, como o dorso das mãos, a parte superior dos pés, o rosto, os ombros e a parte superior das costas e geralmente são um sinal indesejável de envelhecimento. Consequentemente, existe uma ampla gama de produtos para clareamento da pele disponíveis, com eficácia e efeitos colaterais variados. Um foco contínuo é desenvolver produtos cosmecêuticos otimizados que fornecem um efeito de clareamento da pele altamente concentrado em menos tempo do que os produtos convencionais [2]. Outro foco é o desenvolvimento de cosmecêuticos de base natural, pois eles costumam ser percebidos de forma mais positiva pelo público e, portanto, oferecem vantagens de marketing. O desafio no desenvolvimento de uma fórmula baseada em fitocomposto é entregar efetivamente o ingrediente ativo aos seus locais-alvo através da camada de barreira do estrato córneo [3]. Os nanocosmecêuticos oferecem potencial para permeação cutânea aprimorada com procedimentos de aplicação relativamente simples e potencial para entrega direcionada. Exemplos de nanocosmecêuticos baseados em fitocompostos [4-7] incluem aqueles para vitamina E e D-pantenol Nanotopes™ [8,9].

-mangostin (1,3,6,trihidroxi-7-metoxi-2,8-bis(3-metilbut-2-en-1-il){{ 10}}H-xantana- 9-uma tem o potencial de inibir o processo de formação de melanina (manchas escuras) [10]. O composto mostrou forte atividade anti-melanogênica contra células de melanoma B16F1 através da supressão da atividade da tirosinase enzima, uma enzima importante na síntese de melanina, e exerce um efeito de despigmentação em melanócitos epidérmicos humanos normais (NHEMs) [11]. Portanto, -mangostin pode ser usado como um componente de cosméticos ou medicamentos para o tratamento de manchas, cloasma , ou melanose.

Como um composto polifenólico, o -mangostão é suscetível à oxidação que pode limitar a eficácia quando aplicado na pele. Uma abordagem de formulação eficaz, portanto, precisa aumentar a permeação da pele e a estabilidade do composto ativo. Várias abordagens mostraram estabilidade aprimorada e entrega de -mangostão [12] à pele, incluindo lipossomas [13], niossomas [14] e proteassomas [15].

Nosso estudo é focado na matriz transportadora unilamelar ultrapequena (USUC): um sistema nanocarrier também denominado NanotopeTM. Este sistema é caracterizado por um tamanho de gota muito menor (menor ou igual a 40 nm) em comparação com outros lipossomas unilamelares ou multilamelares (100-300 nm) [8]. Gotículas menores são produzidas por uma proporção fixa de uma fase oleosa, um surfactante, um co-surfactante e uma fase aquosa; as razões são obtidas a partir de um procedimento de otimização. Na USUC, uma fase dispersa é circundada por uma única camada de fosfatidilcolina (surfactante) estabilizada por um co-surfactante no meio de dispersão [16]. Tamanho de gota menor é benéfico para penetração profunda no estrato córneo [8].

Descrevemos aqui o desenvolvimento de um sistema de nanocarrier USUC para -mangostão, caracterização física e testes in vivo em voluntários humanos. A otimização da fórmula foi realizada usando um 25-projeto fatorial [6,17] e foi essencial para fornecer uma USUC de boa qualidade com estabilidade e tamanho de gota ideal.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

-mangostin (pureza maior ou igual a 90 por cento) foi adquirido do Institut Teknologi Bandung (Mark Herb, Bandung, Indonésia). Outros componentes incluíam lecitina de soja (grau alimentício; Shankar Soya Products, Indore, Índia), óleo de coco virgem (VCO; Wahana, Padang, Indonésia) e Tween 80 (Bratachem, Jacarta, Indonésia). Todos os outros produtos químicos eram de grau pró-análise.

2.2. Design experimental

A otimização foi realizada usando um planejamento fatorial {{0}}que consiste em três variáveis ​​de composição (concentrações de Tween 80 (X1), lecitina de soja (X2) e VCO (X3)) e duas variáveis ​​de processo: duração da agitação ( X4) e velocidade (X5) (com dois níveis - alto e baixo) [18]. Trinta e duas fórmulas base USUC foram preparadas, empregando os fatores e níveis descritos na Tabela 1. A variável dependente foi o tamanho da gota do USUC. O tamanho foi necessário na faixa de 0-40 nm [19]. Os efeitos de cada variável e suas interações foram determinados usando uma equação fatorial na seguinte forma:

2.3. Otimização da Fórmula Base USUC

As fórmulas básicas USUC foram preparadas com titulação espontânea em fase aquosa. Lecitina de soja e Tween 80 foram agitados com um agitador magnético (IKA® C-MAG HS 7, Staufen, Alemanha) a uma temperatura de 75 ◦C, com VCO adicionado durante a agitação. A água foi titulada lentamente na mistura até que uma solução transparente fosse produzida [8]. As 32 bases foram caracterizadas em termos de tamanho de partícula (gotícula) usando um analisador de tamanho de partícula (Shimadzu SALD 2300, Tóquio, Japão).

Os dados foram analisados ​​usando o software de computador Design Expert® versão 12 (StatEase®, Minneapolis, MN, EUA) para ajustar a equação fatorial com interações adicionadas e correlacionar a resposta com as variáveis ​​examinadas [17]. O efeito e as interações entre as variáveis ​​independentes foram descritos com superfície 3D e gráficos de contorno [19].

Preparação de -Mangostin USUC

-mangostin (3 por cento w/v) foi dissolvido em VCO antes da preparação USUC, conforme descrito acima. A composição de VCO, lecitina de soja e Tween 80 e as condições do processo de mistura foram as mesmas da base USUC otimizada [8,20,23].

2.4. Caracterização de um USUC carregado com mangostin

2.4.1. Propriedades físico-químicas

A caracterização de uma USUC envolve exame organoléptico, valor de pH, transmitância percentual, estabilidade física por meio de ciclos de congelamento e descongelamento, viscosidade, gravidade específica, tamanho da gota, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta [21,24,25]. O pH das fórmulas USUC foi medido com um medidor de pH (Hanna Instrument, Woonsocket, RI, EUA) previamente calibrado. Esta medição foi realizada uma vez por semana durante 8-semana de armazenamento à temperatura ambiente [26]. A transmitância foi medida com um espectrofotômetro UV-visível (SHIMADZU UV-1601, Tóquio, Japão) em um comprimento de onda de 650 nm. A transmitância próxima a 100 por cento indica a transparência de amostras líquidas [27,28].

A estabilidade física das bases do USUC foi avaliada por meio de um teste de congelamento e descongelamento: os USUCs foram armazenados a uma temperatura de -5 ◦C por 24 horas e depois a 25 ◦C por mais 24 horas. Este teste foi repetido por três ciclos. As propriedades físico-químicas do USUC, como pH, viscosidade, gravidade específica e transmitância, foram avaliadas após três ciclos [29].

A viscosidade das bases USUC foi medida com um viscosímetro cup-and-bob (Brookfield DV2T, Middleboro, MA, EUA) usando o fuso número 3 a uma velocidade de 100 rpm em triplicata. A gravidade específica das bases USUC foi determinada usando um picnômetro a 25 ◦C [20,30].

O tamanho da gota, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta das USUCs -mangostin foram determinados usando um analisador de tamanho de partícula (HORIBA Scientific SZ-100, Kyoto, Japão) a 25 ◦C [31].

2.4.2. Determinação da Eficiência de Encapsulamento (EE)

A quantidade de -mangostin aprisionada na fórmula USUC foi liberada via extração de um USUC carregado com -mangostão com acetato de etila (1:2), seguido de sonicação por 10 min (Elmasonic S 80 (H), Singen, Alemanha) . A concentração de -mangostin na solução de acetato de etila foi medida usando um método analítico espectrofotométrico validado a um λ max de 314 nm [24].

A eficiência de aprisionamento (EE) foi calculada usando a seguinte equação:

2.4.3. Análise Microscópica via Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM)

A morfologia do USUC carregado com mangostão foi observada usando um TEM (JEOL JEM 1010, Tóquio, Japão) a 80,0 KV e ampliação de 30,000×. Uma amostra de 10 µL foi jogada em uma grade, tingida com acetato de uranila e seca. A observação foi realizada em temperatura ambiente [8,24,32].

2.4.4. Avaliação visual de um USUC carregado com mangostin em voluntários humanos

O teste de contato foi realizado na pele interna do antebraço de 10 voluntários e deixado por 24 horas para verificar possíveis reações de irritação, como erupções cutâneas vermelhas e com coceira. Foi realizado um ensaio do efeito anti-manchas do -mangostin USUC em 2 voluntárias do sexo feminino, com idades de 57 e 40 anos, respectivamente. O experimento foi realizado pela autorização ética emitida pela Faculdade de Medicina da Universidade de Andalas (documento nº 181/UN.16.2/KEP-FK/2020 em 23 de dezembro de 2020). O USUC carregado com -mangostão foi aplicado em camadas finas e em todo o rosto à noite por 2 semanas consecutivas. Ambos os voluntários preencheram o consentimento informado para participar deste estudo e concordaram em não usar nenhum creme clareador facial durante o teste. Antes de serem fotografadas, as voluntárias limparam o rosto com demaquilante comercial sem óleo. Os rostos dos voluntários foram fotografados com uma câmera digital single-lens reflex (Nikon D 810, Melville, NY, EUA) antes e após o tratamento. Cada imagem facial foi tirada a uma distância de 30–40 cm, usando uma câmera equipada com 36 megapixels e dimensões de 7360 × 4912. A intensidade das manchas escuras foi validada medindo os valores de vermelho, verde e azul (modelo de cores RGB ) com Adobe® Photoshop para Windows e OS X (Microsoft Corp, Redmond, WA, EUA). O tamanho das manchas escuras foi determinado usando um microscópio (Olympus, Ningbo, China) equipado com Motic Live Imaging 3.0. [33-35].

2.5. Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Um teste t simples foi usado para confirmar a fórmula otimizada em relação à resposta prevista; um teste t pareado foi realizado para identificar melhorias significativas nos parâmetros das condições da pele. Uma ANOVA de duas vias (=00,05) foi empregada para estabelecer uma diferença significativa entre as médias, seguida por um teste de intervalo múltiplo de Duncan no nível de significância de 5 por cento [18].

3. Resultados

3.1. Otimização da Fórmula Base

Trinta e duas fórmulas de base USUC foram preparadas com vários fatores, conforme descrito na Tabela 2. A medição da variável de resposta mostrou uma ampla faixa de tamanho de gotícula de 11,3 nm–184,5 µm. Apenas seis fórmulas (F1, F3, F9, F12, F25 e F28) atenderam aos critérios de um sistema USUC, com tamanho de gota menor ou igual a 40 nm [8]. Os dados da Tabela 2 foram analisados ​​posteriormente com o software Design Expert® para obter um modelo de regressão seguido pela determinação da fórmula otimizada.

3.2. Resposta (Y): Efeito de Variáveis ​​Independentes no Tamanho da Partícula

A avaliação do tamanho da gota como resposta (Y) foi realizada. Cinco fatores, ou variáveis ​​independentes, foram modelados na etapa de planejamento experimental, seguido da geração de uma superfície de resposta para o tamanho da gota. A Figura 1 mostra plotagens de superfície de resposta em 3D dos efeitos de variáveis ​​independentes no tamanho de partícula. A equação fatorial obtida é dada na Equação (3):

A resposta do tamanho da gota aumentou quando a composição de Tween 80 e lecitina de soja estava em níveis mais altos (Figura 1a). Diminuir o nível de VCO e aumentar o nível de Tween 80 resultou em uma resposta de tamanho de gota de 20 a 70 nm (Figura 1b). O efeito da relação entre o Tween 80 e o tempo de agitação na resposta do tamanho da gota mostrou que um tempo de agitação mais longo resultou em uma resposta do tamanho da gota de 20 a 100 nm (Figura 1c). Uma resposta de tamanho de gota de 20,000 nm foi alcançada com uma velocidade de agitação de 1200–1350 rpm e um conteúdo de Tween 80 de 20%. Um aumento no nível de Tween 80 com um nível mais baixo de velocidade de agitação aumentou a resposta do tamanho da gota em até 80,000 nm, indicado pela área azul a verde (Figura 1d). O aumento do conteúdo de lecitina de soja e VCO resultou em valores maiores de tamanho de gota, conforme marcado com a área azul a verde (50,000–100,000 nm) (Figura 1e). Aumentar o conteúdo de lecitina e usar um tempo de agitação mais longo resultou em um tamanho de gota maior, conforme indicado pela área azul a verde (50,000–100,000 nm) (Figura 1f). O aumento do teor de lecitina de soja com alta velocidade de agitação aumentou o tamanho da gota, conforme marcado pela região verde a amarela (50,000–150,000 nm) (Figura 1g). A avaliação do conteúdo de VCO e do tempo de agitação na resposta do tamanho da gota mostrou que um tempo de agitação de 15 min e um nível de VCO de<1.5% resulted in a droplet size of 40 nm (Figure 1h). The droplet-size profiles were varied,  with different levels of combination for both VCO versus stirring speed and stirring speed versus stirring time (Figure 1i,j).

3.3. Determinação da Fórmula Ideal pelo Software Design Expert®

A análise foi realizada usando o Design Expert® para gerar gráficos de contorno sobrepostos. Na Figura 2, a área amarela representa a área de previsão da fórmula base ótima, com a resposta do tamanho da gota. Uma fórmula de base ideal estimada foi encontrada em uma concentração de 28,2 Tween 80 por cento e 1 por cento de lecitina de soja, com um valor de conveniência de 1.00. Um valor de desejabilidade próximo a 1 indica a capacidade do modelo de produzir a fórmula otimizada. As condições otimizadas para a fabricação da base USUC foram uma velocidade de agitação de 1500 rpm por 15 min. Esta composição e estas condições obtiveram a resposta prevista de 34,04 nm. A preparação da fórmula otimizada para confirmação (Tabela 3) resultou em um tamanho de gota de 36 nm, que não é significativamente diferente da resposta prevista (p maior ou igual a 0,05).

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