Um novo peptídeo derivado de netrina-1-aumenta a proteção contra a morte neuronal e atenua a hemorragia intracerebral em camundongos Parte 1

Resumo:

Foi relatado que Netrin-1 está envolvido na neuroproteção após lesão no sistema nervoso central. No entanto, o domínio funcional mínimo do Netrin-1 que pode preservar a neuroproteção, mas evitar os principais efeitos colaterais do Netrin, permanece indefinido.

O sistema nervoso central é um dos sistemas nervosos mais importantes do corpo humano, que controla os pensamentos, sentimentos e ações das pessoas. Quando o sistema nervoso central é danificado, a memória das pessoas também é afetada. Mas não se preocupe, podemos adotar algumas maneiras positivas de ajudar a restaurar a memória.

Primeiro, você precisa entender o impacto dos danos à memória. Os danos ao sistema nervoso central podem afetar as habilidades cognitivas, os processos de pensamento e a atenção das pessoas, os quais afetam diretamente a memória das pessoas. Além disso, os danos ao sistema nervoso central também podem causar instabilidade emocional, tornando as pessoas mais propensas ao pânico, à ansiedade e à depressão, afetando assim a recuperação da memória.

Porém, embora os danos ao sistema nervoso central possam trazer alguns efeitos negativos, podemos tomar algumas medidas positivas para promover a recuperação da memória. Primeiro, podemos tentar algum treinamento cognitivo, como ler, escrever e resolver quebra-cabeças. Essas atividades podem estimular o cérebro a produzir novos neurônios e ajudá-lo a construir novas memórias e formas de pensar.

Em segundo lugar, também podemos promover a recuperação da memória através de algum exercício físico. Estudos demonstraram que o exercício adequado pode estimular o cérebro a produzir novos neurônios e conexões neuronais e promover o processamento de novas informações pelo cérebro. É por isso que algumas pessoas de repente têm uma boa ideia ou resolvem um problema difícil enquanto correm ou caminham.

Finalmente, precisamos prestar atenção ao papel da ingestão nutricional correta na memória. O funcionamento normal do cérebro requer alguns nutrientes necessários, como proteínas, vitaminas e oligoelementos. Se a nossa alimentação não tiver esses nutrientes, isso afetará a nossa memória e capacidade de raciocínio. Portanto, devemos escolher alguns alimentos ricos nesses nutrientes em nossa alimentação, como peixes, carnes magras, vegetais e frutas.

Em suma, os danos ao sistema nervoso central terão um certo impacto na memória das pessoas, mas podemos promover a recuperação da memória através de um treino cognitivo adequado, exercício físico e controlo da dieta. Espero que todos possam enfrentar os desafios da vida de forma positiva, manter uma atitude otimista e se esforçar para restaurar um sistema nervoso central saudável e uma boa memória. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche é uma medicina tradicional chinesa com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc., que podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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Aqui, investigamos o efeito neuroprotetor de um peptídeo E1 derivado do domínio EGF3 de Netrin (resíduos 407-422). Descobrimos que ele interage com o carcinoma colorretal deletado (DCC) para ativar a fosforilação da quinase de adesão focal exibindo neuroproteção.

A administração do peptídeo E1 foi capaz de melhorar a recuperação funcional através da redução da apoptose em um modelo experimental murino de hemorragia intracerebral (ICH).

Em resumo, revelamos uma sequência funcional de Netrina-1 que está envolvida no processo de recuperação após ICH e identificamos um peptídeo candidato para o tratamento de ICH.

Palavras-chave: hemorragia intracerebral; hemina; neuroproteção; Netrina-1; peptídeo.

1. Introdução

A hemorragia intracerebral (HIC) é um subtipo devastador de acidente vascular cerebral com alta taxa de mortalidade e morbidade [1–3] que envolve ruptura anormal de vasos sanguíneos cerebrais dentro do cérebro [4,5].

A remoção cirúrgica de hematomas é preferida para obter hemostasia e aliviar a pressão intracraniana [6]. No entanto, resíduos hemáticos remanescentes e produtos de degradação do sangue ainda podem promover lesão cerebral secundária após HIC, induzindo danos neuronais e retardando a recuperação funcional [7–9].

Assim, o desenvolvimento de estratégias eficazes visando o dano neuronal induzido por lesão cerebral secundária seria benéfico para o tratamento do AVC. A netrina -1 é uma das proteínas mais bem estudadas que regulam a orientação axonal e a sinaptogênese [10–12] por meio da interação com seus receptores. excluído no câncer colorretal (DCC) e UNC5H (homólogo -5 não coordenado) para ativar a sobrevivência, diferenciação e proliferação celular [13–15].

Os receptores induzem um sinal de morte para mediar a apoptose quando a Netrina-1 está ausente [16]. Sabe-se que a ligação de Netrin -1 com DCC resulta na dimerização de DCC e inicia a fosforilação da tirosina 861 da adesão quinase focal (FAK) para induzir o crescimento de neuritos e orientação axonal [17,18].

A ligação de Netrin-1 com DCC envolve o domínio EGF3 de Netrin-1 e o domínio FN5 de DCC na ativação da via de sinalização Netrin-1 [19,20]. Recentemente, foi demonstrado que Netrin -1 exerce efeitos neuroprotetores em regiões isquêmicas [21].

O nível de expressão sérica de Netrina -1, que inibe a apoptose celular e promove a regeneração neuronal, está positivamente correlacionado com a recuperação do paciente após acidente vascular cerebral isquêmico [22,23].

Curiosamente, o transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea que secretam Netrina -1 no nervo ciático de rato danificado inicia a regeneração axonal [24] e reduz a morte dos neurônios motores [25]. A injeção estereotáxica da proteína Netrin-1 nos ventrículos reduz a morte das células nervosas após hemorragia subaracnóidea através da ativação da sinalização DCC/APPL1/AKT [26].

Um polipeptídeo derivado do domínio EGF3 da Netrina -1 (aminoácidos 423-433) ativa marcadamente a fosforilação de ERK e promove a produção de NO, que tem efeitos cardioprotetores [27,28]. No entanto, Netrin -1 foi identificado como um potencial biomarcador para tumorigênese [29–31] porque a regulação do status de Netrin -1 é encontrada em vários cânceres derivados de tecidos [32].

Quando Netrin-1 está ligado ao seu receptorDCC ou Unc5H, os receptores transduzem um sinal positivo levando à sobrevivência, inflamação, angiogênese e anti-apoptose, que por sua vez regula a tumorigênese [31].

Portanto, é muito importante identificar o domínio funcional mínimo do Netrin-1 que pode preservar a neuroproteção e evitar os principais efeitos colaterais do Netrin-1. Aqui, descobrimos que o peptídeo E1 (resíduos 407–422), que é derivado do domínio EGF3 de Netrin-1, interage com o DCC para proteger os neurônios da toxicidade induzida pela hemina.

Em modelo experimental de camundongos ICH, a aplicação do peptídeo E1 melhorou a recuperação funcional, conforme determinado por ensaios comportamentais. Além disso, o peptídeo E1 pode impedir a degeneração dos neurônios após ICH.

Com base nesses resultados, identificamos uma sequência funcional de Netrina-1 que está envolvida na recuperação após HIC e determinamos que esse peptídeo pode ser usado para o tratamento de HIC.

2. Resultados

2.1. O domínio EGF3 é fundamental para a interação Netrin-DCC

Netrin-1 consiste em um domínio VI, três repetições EGF e um domínio C-terminal [33]. A estrutura cristalina do complexo Netrin-1/DCC humano revela que o domínio Netrin-1 EGF3 é crucial para a interação Netrin-1/DCC, mas não os domínios EGF1 e EGF2 [34].

A mutagênese dos principais resíduos de aminoácidos (His407, Gln442 ou Gln443) no domínio EGF3 interrompeu completamente a ligação de Netrina -1 / DCC (19). Os domínios EGF1/2 são necessários para alternar a sinalização atrativa em sinalização repulsiva quando Unc5 coexiste com DCC [20].

Assim, primeiro geramos construções completas e EGF3- deletadas (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (Figura 1A) e expressamos transitoriamente essas construções em células HEK293T cultivadas para GSTpulldown .

A ligação foi observada para as construções que expressavam Netrin-1 mas não Netrin-1(∆407–443) (Figura 1C). Estes resultados sugerem que o domínio do EGF3 contendo os aminoácidos 407-443 é responsável pela interação da Netrina-1 com o DCC. Para investigar o papel do domínio EGF3 na Netrin-DCC, primeiro purificamos a Netrina marcada com myc{{12 }} ou Netrin truncado-1 (∆407–443) (Figura 1B).

Em seguida, as células HEK293T foram transfectadas com um plasmídeo contendo cDNA de DCC e incubadas com proteína Netrina-1, e então a ligação de Netrina-1 foi avaliada por imunocoloração.

Descobrimos que a Netrina completa -1, mas não a Netrina truncada -1, foi capaz de se ligar ao DCC na membrana plasmática (Figura 1D). Para determinar se o domínio EGF3 pode interagir com DCC, geramos uma construção GST-EGF3 para retirar células lisadas que superexpressam DCC. Observamos ligação específica de DCC com GST-EGF3 (Figura 1E).

Além disso, sintetizamos o peptídeo EGF3 marcado com FITC e confirmamos que, assim como a Netrina -1 completa, ele foi capaz de se ligar ao DCC na membrana plasmática (Figura 1F). Tomados em conjunto, nossos dados indicam que o domínio EGF3 é responsável pela interação do Netrin-1 com o DCC.

2.2. O domínio EGF3 induz a fosforilação das vias a jusante da netrina-1

A interação de Netrin-1 e DCC ativa múltiplas vias de sinalização, incluindo FAK, SFK e ERK [16,35]. A quinase de adesão focal (FAK) é uma das principais atividades de tirosinafosforilação ligada à sinalização Netrin-1/DCC.

Netrina -1 ativa a fosforilação de FAK e a fosforilação de proteínas tirosina quinases (SFKs) da família Src (17). Ambas as vias de sinalização FAK e SFK desempenham um papel fundamental no estágio de desenvolvimento do sistema nervoso e no reparo de lesões [36,37]. Além disso, Netrin-1 pode ativar a quinase regulada por sinal extracelular-1/2 (ERK1/2), que medeia a ação da via da proteinquinase ativada por mitógeno (MAPK) [38–40].

Para investigar se o domínio EGF3 é crítico para a ativação de vias de sinalização a jusante através da ligação de Netrina -1 ao DCC, primeiro examinamos o efeito do domínio EGF3 na fosforilação da tirosina 861 da FAK (Figura 2A) . Descobrimos que a deleção do EGF3 inibiu a fosforilação da FAK em neurônios corticais cultivados (Figura 2B, C), confirmando assim um papel essencial para o EGF3 na via de sinalização da Netrina -1.

Em seguida, neurônios corticais cultivados foram estimulados com a proteína de fusão GST-EGF3 por 20 min, e o western blotting confirmou ainda que o tratamento com a proteína de fusão GST-EGF3 induziu a fosforilação de FAK, ERK e SFK (Figura 2D-G).

Estes resultados sugerem que o domínio EGF3 da Netrin-1 funciona como um potente estimulador para ativar vias de sinalização a jusante.

Figura 1. O domínio EGF3 de Netrin-1 é a região crítica para a interação Netrin-1/DCC. (A) Ilustrações de construções-1de Netrin. As construções Netrin-1 são Netrin-1 completas, Netrin-1-(∆407–443) e GST-EGF3. (B) Netrina purificada-1-(∆407–443)-Myc/His foram quantificadas através de uma comparação com a curva padrão BSA. (C) Immunoblotting da fração pull-down pela proteína de fusão do domínio GST-DCC FN5 e GST sozinho. (D) Imagens de imunofluorescência de células 293T expressando Flag-DCC incubadas com meio controle, Netrin-1-myc/his e Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his por 30 min, respectivamente, e o quantitativo análise. Barra de escala, 10 μm. (E) Immunoblotting da fração pull-down pela proteína de fusão GST-EGF3 e GST junto. (F) Imagens de imunofluorescência de células 293T expressando Flag-DCC incubadas com meio controle e Pep EGF3 marcado com FITC por 30 min, respectivamente, e a análise quantitativa. Barra de escala, 10 μm.

Figura 2. O domínio EGF3 ativa vias downstream de Netrin-1. (A) Procedimento experimental. (B) Neurônios corticais (E17 e DIV3) foram estimulados com Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) ou meio controle por 20 min. Os lisados ​​celulares foram incubados com um anticorpo anti-p-FAK-861 para confirmar a atividade da Netrin-1. (C) A análise quantitativa dos resultados do western blot é mostrada em (B). n=3. (D) Neurônios corticais (DIV3) foram tratados com 1,5 μM de GST (+), 1,5 μM de proteína de fusão GST-EGF3 (+) ou 1,5 μM de Netrina-1 (+) de meio por 20 min. Os lisados ​​​​celulares foram incubados com anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 e anti-p-ERK-202/204.(E – G) Análise quantitativa do oeste resultados de mancha mostrados em (D). n=3. Os dados são apresentados como médias ± SEM. ANOVA unidirecional foi utilizada para todas as análises estatísticas mostradas nesta figura (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, não significativo). Detalhes da análise dos dados são vistos na Tabela Suplementar S1.

2.3peptídeos E1 e E2 interagem com DCC para ativar a via de sinalização downstream de Netrin-1

Como descrito anteriormente, um pequeno peptídeo derivado do domínio EGF3 da Netrina -1 (aminoácidos 423-433) induziu a fosforilação de ERK (27). Sintetizamos os peptídeos E1 (resíduos 407-422) e E2 (resíduos 423-433) que foram derivados do domínio EGF3 de Netrin -1 (Figura 3A).

Descobrimos que a incubação do peptídeo E1 aumentou os níveis de FAK e SFK fosforilados (Figura 3B, D, E) nas células de cultura de maneira dependente da dose, mas não alterou os níveis de ERK fosforilado (Figura 3B, F).

Ao contrário do peptídeo E1, o peptídeo E2 não apenas induziu a fosforilação da tirosina de FAK (Figura 3C, G) e a fosforilação da tirosina de SFK (Figura 3C, H), mas também induziu a fosforilação da tirosina de ERK (Figura 3C, I) em neurônios corticais cultivados.

O peptídeo de controle (Pep Ctrl) não teve efeito detectável na fosforilação da tirosina de FAK, SFK e ERK (Figura S1). Além disso, observamos que a fosforilação de componentes da via de sinalização FAK induzida pelo peptídeo E1 era dependente do tempo (Figura S2). Estes resultados indicam que E1 e E2 são os peptídeos funcionais mínimos de Netrin-1.

Figura 3. As sequências mínimas do domínio EGF3 ativam vias a jusante de Netrin-1. (A) Ilustrações dos peptídeos. (B) Neurônios corticais (DIV3) foram estimulados com concentrações gradientes de peptídeo E1. Os lisados ​​celulares foram incubados com anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 e anti-p-ERK-202/204. (C) Neurônios corticais cultivados foram tratados com concentrações gradientes de peptídeo E2.

Os lisados ​​​​foram coletados e incubados com os anticorpos indicados para medir a fosforilação de FAK, SFK e ERK. (D – F) A quantificação da extensão da fosforilação de FAK, SFK e ERK induzida pelo peptídeo E1 em neurônios é mostrada em (B). n=3. (G – I) A quantificação da extensão da fosforilação de FAK, SFK e ERK induzida pelo peptídeo E2 é mostrada em (C). n=3. (J) Neurônios corticais derivados de embriões mutantes homozigotos e de tipo selvagem DCC foram estimulados com peptídeos derivados de Netrin-1 ou Netrin-1- e foram lisados.

Os lisados ​​resultantes foram submetidos a imunotransferência. (K) A quantificação dos níveis de FAK PY{{0}} e DCC em neurônios mutantes DCC é mostrada em (J). n=3. Os dados são apresentados como médias ± SEMs. ANOVA unidirecional foi utilizada para todas as análises estatísticas mostradas nesta figura (* p < 0,05;ns, não significativo). Detalhes da análise dos dados são vistos na Tabela Suplementar S1.

Para determinar se a ativação da via de sinalização FAK é dependente de DCC, medimos a extensão da fosforilação da tirosina de FAK induzida por esses peptídeos nos neurônios DCC +/+ e DCC -/-. Descobrimos que ambos os peptídeos E1 e E2 não conseguiram induzir a fosforilação da FAK nos neurônios DCC (Figura 3J, K).

Descobrimos também que os peptídeos E1 e E2 marcados com Flag sintetizados no terminal N (Flag-E1 e Flag-E2) se ligam diretamente ao domínio DCCFN5 (Figura S3).

2.4. Peptídeo E1 protege neurônios da morte celular induzida por hemina in vitro

Para exibir a proteção contra lesão neuronal do peptídeo E1, empregamos uma reação de toxicidade induzível por Hemin para imitar lesão cerebral secundária após hemorragia intracerebral [41,42].

Células neuronais cultivadas que expressam GnRH (NLT) [43–45] foram incubadas com hemina em diferentes concentrações e durações. A incubação de células NLT com hemina na dose letal medial (60 µM) resultou em uma diminuição dependente do tempo na taxa de sobrevivência celular, o que sugere que a hemina foi absorvida pelos neurônios e metabolizada (Figura S4).

Para examinar se a expressão de Netrina -1 e DCC respondeu à morte celular neuronal induzida por hemina, células NLT cultivadas foram incubadas com hemina por diferentes durações. Os resultados do western blot demonstraram que os níveis de expressão de Netrina -1 e DCC aumentaram significativamente às 6 h após a incubação da hemina e depois diminuíram gradualmente (Figura 4A, B).

Para investigar se os peptídeos E1 e E2 foram capazes de atenuar a morte neuronal induzida por hemina, realizamos um ensaio de CCK-8 com Netrin-1, PepCtrl, peptídeo E1 e peptídeo E2.

Descobrimos que esses peptídeos não tiveram efeito detectável na viabilidade celular (Figura 4C e Figura S5). Em comparação com a incubação com Pep Ctrl e peptídeoE2, o peptídeo E1 e Netrin -1 melhoraram a morte neuronal induzida pela hemina (Figura 4D). Também coramos com calceína-AM e PI para distinguir células vivas e mortas.

Os resultados mostraram que tanto a Netrina -1 quanto o peptídeo E1 protegeram contra a morte induzida pela hemina in vitro (Figura 4E-G). Além disso, 1,5 µM de peptídeo E1 aliviou a morte induzida por hemina em neurônios cultivados primários (Figura 4H, I). No total, estes resultados mostraram que o peptídeo E1 protege os neurônios da morte celular induzida pela hemina.

2.5. Netrin-1-peptídeo E1 derivado promove recuperação funcional após ICH

Para investigar se o peptídeo E1 derivado de Netrin -1 desempenha um papel importante na recuperação funcional após acidente vascular cerebral hemorrágico, estabelecemos um modelo experimental de ICH em ratos injetando colagenase misturada com tinta no corpo estriado (Figura S6A).

Após três dias, imagens da fatia cerebral foram mostradas para rastrear a posição de injeção e o volume de colagenase com tinta (Figura S6B, C). Camundongos com hemorragia estriatal exibiram fraqueza no lado ipsilateral devido a lesão cerebral (Figura S7A-C).

Hematoma no corpo estriado após ICH era visível em comparação com injeção de solução salina (Figura S7D). Os níveis relativos de proteína de Netrina-1 e DCC no córtex perihematomal aumentaram em camundongos ICH em comparação com camundongos controle no dia 2 e a Netrina-1 ainda foi significativamente maior no dia 3, indicando que Netrina-1 é importante para a recuperação de lesão cerebral (Figura S7E, F).

Em seguida, o peptídeo E1 TAT marcado com FITC (FITC-Pep TE1), que adicionou uma sequência TAT do terminal N do peptídeo E1, foi injetado nos camundongos ICH e o FITC-Pep TE1 mostrou atravessar a barreira hematoencefálica ( Figura S8).

Os camundongos ICH e controle foram injetados intraperitonealmente com o peptídeo (12 mg/kg) diariamente ou um volume igual de solução salina (Figura 5A). Descobrimos que a administração com o peptídeo TE1 melhorou a taxa de sobrevivência e resgatou defeitos no peso corporal após ICH (Figura 5B, C).

Também descobrimos que o volume de colagenase traçado com uma proporção igual de tinta em cada grupo era semelhante, confirmando que este modelo ICH padrão de colagenase resultou em hematomas intraestriatais reprodutíveis (Figura 5D). O peptídeo TE1 melhorou os escores comportamentais dos camundongos ICH no teste de remoção de fita (Figura 5E ) e teste de cilindro (Figura 5F).

Como esperado, o peptídeo TE1 reduziu o volume do infarto após ICH (Figura 5G, H). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o peptídeo E1 foi capaz de reduzir o volume do hematoma e melhorar a recuperação funcional em um modelo de ICH em camundongos.

Figura 4. O peptídeo E1 melhora a morte celular induzida pela hemina in vitro. (A) Western blot de Netrin-1 eDCC em células NLT cultivadas expostas a Hemin (60 μM). (B) A análise quantitativa dos resultados do Western Blot é mostrada em (A). n=3. (C) Os ensaios de CCK-8 mostraram que os peptídeos em série não alteraram a viabilidade celular. n=4. (D) 1,5 μM Pep E1 preservou a viabilidade das células NLT quando adicionado bem após a exposição à hemina (60 μM). n=4. (E) Ensaio vivo (verde)/morto (vermelho) de células NLT expostas à hemina (60 μM,6 h). Barra de escala, 50 μm. (F, G) Análise quantitativa do ensaio vivo/morto em (E). n=9. (H) Ensaios-8de CCK mostraram que Pep E1 poderia reduzir a morte celular induzida por hemina em neurônios de cultura primária. n=8.(I) Imagem de ensaio vivo/morto de neurônios de cultura primária (50 μM, 6 h). Barra de escala, 50 μm. Os dados são apresentados como médias ± SEM. ANOVA unidirecional ou ANOVA bidirecional foi usada para todas as análises estatísticas mostradas nesta figura (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, não significativo). Detalhes da análise de dados são vistos na Tabela Suplementar S1.

Figura 5. O peptídeo E1{1}}derivado de netrina promove o processo de recuperação após ICH. (A) Esquema do paradigma experimental da injeção intraperitoneal (IP) do peptídeo TE1 na modelagem ICH de camundongos. (B) A taxa de sobrevivência pós-HIC de cada grupo foi registrada e o método Kaplan-Meier foi empregado. n=10. (C) O peso corporal muda 5 dias após a ICH. n=6.(D) Mistura de colagem/solução salina com uma proporção igual de tinta (total 0,6 μL) injetada no corpo estriado de camundongos C57, imagens representativas mostrando a área de tinta foi semelhante em camundongos tratados com/ sem peptídeo TE1 5 dias após ICH. (E, F) Injeção IP do peptídeo TE1 (12 mg/kg), mas não do controle TAT (12 mg/kg), comportamento melhorado conforme monitorado por uma tarefa de remoção de fita (E) ou uma tarefa de canto (F).

Salina,n=10 animais individuais; ICH, n=6 animais individuais; ICH + TAT, n=6 animais individuais; ICH + TE1, n=8 animais individuais. (G) Seções representativas de hematoxilina e eosina em camundongos tratados com/sem peptídeo TE1 5 dias após ICH. Barra de escala, 1 mm. (H) Quantificação do volume de hemorragia nas seções cerebrais mostradas em (G).

Solução salina, n {{0}} animais individuais; ICH, n=6 animais individuais; ICH + TAT, n=6 animais individuais; ICH + TE1, n=8 animais individuais. Os dados são apresentados como médias ± SEM. ANOVA unidirecional ou ANOVA bidirecional foi usada para todas as análises estatísticas mostradas nesta figura (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, não significativo). Detalhes da análise dos dados são vistos na Tabela Suplementar S1.

2.6. Peptídeo E1 derivado de netrina reduz a apoptose neuronal após ICH

Explorar os mecanismos subjacentes do peptídeo E1 no processo de recuperação funcional do ICH. Detectamos degeneração neuronal na região perihematomal com coloração por fluor-jade C (FJC).

Descobrimos que a administração do peptídeo TE1 reduziu significativamente o número de células positivas para FJC nas regiões do perihematoma, indicando que o pep TE1 inibiu a degeneração neuronal após ICH (Figura 6A, B). Realizamos coloração TUNEL e descobrimos que o peptídeo TE1 diminuiu significativamente o número de neurônios positivos para TUNEL (Figura 6C, D).

O número de astrócitos positivos para TUNEL não foi alteração detectável após o tratamento com peptídeo TE1 (Figura 6E, F). Além disso, usando dextrano de 4 kDa marcado com FITC como traçador para indicar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), descobrimos que o peptídeo TE1 não afetou a recuperação da permeabilidade da BHE (Figura S9A, B).

Os níveis séricos de unidades de fluorescência bruta (RFUs) foram semelhantes, confirmando a presença do traçador injetado em todos os animais analisados ​​(Figura S9C). Também usamos lectina marcada com fluoresceína para rotular microvasos, mas não conseguimos observar qualquer melhora após o tratamento com TE1 (Figura S9D, E). Acima de tudo, estes resultados sugerem que o peptídeo E1 promove a recuperação neuronal após HIC, inibindo a apoptose neuronal.

Figura 6. O peptídeo E1 derivado de netrina-1-pode proteger contra morte neuronal e degeneração, mas não astrócitos após ICH. (A) Seções representativas coradas com fluor-jade C em camundongos tratados com/sem TE1 aos 5 dias após ICH. Barra de escala, 50 μm e 10 μm, respectivamente. (B) Quantificação de células positivas para Fluoro-jade C na região perihematomal (n=4). (C) Coloração TUNEL mostrando efeitos de TE1 na lesão cerebral secundária (SBI) 5 dias após o início da HIC. Imagens representativas dos grupos Saline, ICH, ICH + TAT e ICH + TE1.

Cada grupo foi submetido à ICH, exceto o grupo Salina. Barra de escala, 50 μm e 10 μm, respectivamente. (D) Análises quantitativas para a porcentagem de neurônios positivos para TUNEL são mostradas em (C). n=4. (E)Colocalização de TUNEL com GFAP 5 dias após ICH. Imagens representativas dos grupos Saline, ICH, ICH + TAT e ICH + TE1. Barra de escala, 50 μm e 10 μm, respectivamente. (F) Análises quantitativas para a porcentagem de astrócitos positivos para TUNEL são mostradas em (E). n=4. Os dados são apresentados como médias ± SEM.

ANOVA unidirecional foi usada para todas as análises estatísticas mostradas nesta figura (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; não significativo). Detalhes da análise dos dados são vistos na Tabela Suplementar S1.

3. Discussão

Nosso estudo identificou uma sequência peptídica central de Netrina-1 que é crucial para a recuperação funcional após ICH. Ao interagir com o DCC, esse peptídeo derivado de Netrina-1-protege contra a morte neuronal devido a danos secundários após ICH e é, portanto, um tratamento promissor para ICH.

A aplicação terapêutica de Netrin-1, uma proteína de alto peso molecular, requer a identificação da sequência funcional mínima de Netrin-1 que promove a sinalização downstream. Em nosso estudo, foram gerados os peptídeos E1 (resíduos 407-422) e E2 (resíduos 423-433), que são derivados do domínio EGF3 de Netrin -1, respectivamente. Descobrimos que o peptídeo E1 (resíduos 407-422) protegeu contra a morte neuronal após ICH.

Descobrimos que os níveis de expressão de Netrin-1 e DCC foram aumentados nas células NLT após o tratamento com hemina. A hemina é liberada da hemoglobina após ICH e induz lesão secundária nas células gliais e neuronais [46–48].

Além disso, também observamos níveis aumentados de proteína de Netrin-1 e DCC após ICH experimental. Além disso, também observamos níveis aumentados de proteína de netrina-1 e DCC após ICH experimental.

Esses resultados são consistentes com resultados anteriores, mostrando que a netrina -1 desempenha um papel importante na recuperação após ICH [49].

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