Um novo peptídeo derivado de netrina-1-aumenta a proteção contra a morte neuronal e atenua a hemorragia intracerebral em camundongos - Parte 2

Além disso, descobrimos que o peptídeo E1 ativou especificamente as vias de sinalização FAK e SFK. Portanto, o peptídeo E1 pode ter efeitos altamente específicos e ser eficaz no processo de recuperação após HIC.

Existe uma relação entre alta especificidade e memória. Alta especificidade refere-se à atividade mais forte em áreas específicas do cérebro quando as pessoas estão realizando uma tarefa. Memória refere-se à capacidade das pessoas de aprender e lembrar informações. Quando aprendemos a usar alta especificidade para realizar uma tarefa, nossa memória também aumenta.

A pesquisa mostra que quando temos habilidades especializadas e experiência em uma tarefa, o cérebro construirá gradualmente circuitos neurais especializados e padrões de memória. Estes circuitos e padrões terão um efeito específico na resposta à tarefa, melhorando assim a eficiência da tarefa. Ao mesmo tempo, ao realizarmos tarefas semelhantes no futuro, esses circuitos e padrões também serão ativados para nos ajudar a lembrar e executar melhor a tarefa.

Tarefas com alta especificidade incluem música, linguagem, esportes, etc., e aprender essas habilidades pode melhorar nossa memória. Por exemplo, quando um pianista pratica tocar, o cérebro aprenderá as habilidades específicas do piano e continuará a fortalecer esses circuitos durante o processo de prática. O estabelecimento e o fortalecimento desses circuitos também melhorarão a compreensão e a memória musical do pianista.

Portanto, existe uma relação positiva entre alta especificidade e memória. Aprender habilidades e experiências específicas pode não apenas melhorar nossa eficiência de execução, mas também fortalecer nossa memória, ajudando-nos a aprender e lembrar melhor diversas informações. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim a saúde do sistema nervoso. Além disso, Cistanche também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir a ocorrência de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

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Ao contrário do peptídeo E1, o peptídeo E2 pode ativar a sinalização ERK, que promove a morte neuronal. Isso pode ser causado por um motivo Cx (1–2) Cx (3–4) Tx (0 –1) G em E2 que pode ativar a via de sinalização ERK [28].

Isso indica que diferentes peptídeos derivados de Netrin-1-desempenham funções diferentes. Os principais receptores de Netrin-1 são DCC e membros da família UNC5 [50]. O papel do DCC e do UNC5H2 na HIC permanece controverso [51,52].

A sequência de Netrin-1que identificamos é crítica para a interação de Netrin-1 com DCC [19]. Esses resultados sugerem que o DCC pode participar da recuperação funcional-1-induzida por Netrin após ICH.

Mais estudos são necessários para investigar os mecanismos subjacentes a esses processos e as vias de sinalização relacionadas. Em experimentos futuros, avaliaremos as propriedades biológicas do peptídeo E1 para explorar sua toxicidade e meia-vida para aplicação clínica.

4. Materiais e Métodos

4.1. Animais

O laboratório era um laboratório livre de patógenos específicos (SPF). Todos os ratos foram alojados sob um ciclo claro-escuro de 12- horas com luzes acesas das 6h às 18h e tiveram acesso à comida ad libitum. Camundongos DCC +/− foram gerados como descrito anteriormente (53).

Embriões de camundongos DCC +/− foram utilizados para cultura neuronal cortical. A genotipagem foi realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR), conforme descrito anteriormente [53]. Camundongos C57BL / 6J foram adquiridos da Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd.

4.2. Construções

Construções de expressão que codificam DCC humano (HGNC: 2701), Netrin humano-1 (HGNC:8029) e UNC5A humano (HGNC:12567) foram geradas em nosso laboratório [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His foi gerado com um Kit Seamless AssemblyCloning (Clone Smarter, C5891, EUA). A sequência de cDNA de hNetrin-1 (∆407–443) foi observada na Tabela Suplementar S2.

Sequências de cDNA correspondentes ao domínio FN5 de DCC e aminoácidos 407-443 de Netrina-1 foram construídas por ligação no vetor pGEX-5x-1 para produzir proteínas de fusão GST.

4.3. Coleção de meio condicionado Netrin-1

O meio condicionado-1-netrin foi coletado e validado conforme descrito em nosso relatório anterior [13,14]. Resumidamente, a Netrina humana marcada com Myc-His-1 foi expressa em células HEK293T.

Após 24 h, as células foram lavadas 3 vezes com Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, EUA) e depois incubadas durante três dias em Opti-MEM isento de soro.

O meio foi enriquecido por filtração centrífuga (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, EUA) e armazenado a -80 ◦C. Netrin enriquecido-1 foi imunotransferido com anti-His e quantificado por comparação com BSA como controle de carga.

O efeito da Netrina{{0}} foi então avaliado pela fosforilação da FAK. Normalmente, 0,1 mg/mL de Netrina-1 induziu efetivamente a fosforilação de FAK, e essa concentração foi usada em nossos estudos. A duração da estimulação-1Netrin foi de 20 minutos em todos os experimentos, salvo indicação em contrário.

4.4. Análise de Western Blot

Western blotting foi realizado conforme descrito anteriormente (54). As amostras foram lisadas em tampão de lise (1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 100 mM de NaF, 1 mM de vanadato e inibidores de protease) para lisar células e tecido cerebral fresco.

Os anticorpos primários utilizados foram: anti-DCC de camundongo (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, EUA), anti-His de camundongo (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Pequim, China ), anti-myc de camundongo (1:1000, 22E8, Sungene Biotech,Tianjin, China), anti-Netrin de camundongo-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale,Nova York, EUA), camundongo anti-bandeira (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA), anti-fosfo-FAK de coelho (pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA), anti-FAK de coelho (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA), anti-fosfoSRC de coelho (Tyr418)(1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , família anti-SRC de coelho (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, EUA), anti-GAPDH de camundongo (1:5000, TransGene Biotech, Pequim, China), anti-beta actina de camundongo (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA), anti-fosfo-ERK de coelho (Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, EUA), anti-ERK de coelho (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, EUA), anticorpos secundários conjugados com HRP contra ratinho, cabra ou coelho foram adquiridos à Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EUA).

4.5. Ligação à superfície celular

Células HEK293 plaqueadas em lamelas foram transfectadas com plasmídeos Flag-DCC usando o método de fosfato de cálcio conforme descrito anteriormente (55). Aproximadamente 40 h após a transfecção, as células foram incubadas com 100 µg/mL de myc-Netrin-1 ou myc-Netrin-1 (∆407–443) por30 min antes de ser lavado por 5 min com HBHA (HEPES 20 mM, pH 7,0 e 0,5 mg/mLBSA em HBSS), enxaguado com 1x PBS e fixado sequencialmente com paraformaldeído a 4% em PBS por 10 min. Os anticorpos primários utilizados foram anticorpos anti-myc de coelho (1:200, Abcam, ab9106, Cambridge, MA, EUA) e anticorpos anti-flag de camundongo (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

Os anticorpos secundários utilizados foram anticorpos anti-coelho de burro conjugados com Alexa Fluor 488- (1:1000; Invitrogen, A21206) e anti-rato de cabra conjugados com Alexa Fluor 546-(1:1000; Invitrogen, A10036). . Os núcleos foram corados com 40,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA). Todas as imagens foram adquiridas com microscópio confocal Zeiss LSM 880.

4.6. Suspensão de GST

A proteína de fusão GST-DCC foi purificada com esferas de glutationa-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) pelo protocolo do fabricante.

Aproximadamente 500 µg de lisado celular de células HEK293T transfectadas com os plasmídeos indicados foram incubados com 2–5 µg de proteína de fusão GST-DCC-FN5 em tampão RIPA a 4 ◦C durante a noite. Esferas Glutathi-one-SepharoseTM 4B foram usadas para capturar a proteína de fusão GST-DCC-FN5 e suas proteínas de interação. As proteínas ligadas foram liberadas no tampão de carregamento de proteínas por desnaturação térmica.

4.7. Cultura de neurônios corticais primários

Neurônios corticais primários foram cultivados como descrito anteriormente (56). Em resumo, os embriões (E17) foram removidos de camundongos prenhes anestesiados. Os córtices cerebrais foram separados e cortados em pequenos pedaços.

Após incubação em {{0}},125% Trypsin Plus com 0,05% DNase em HBSS a 37 ◦C por 20 min, as células foram trituradas com pipetas Pasteur de vidro polido a fogo e filtradas com um filtro de 40 µm.

As células dissociadas foram suspensas em DMEM com 10% de FBS e plaqueadas em placas revestidas com poli-D-lisina ou lamelas de vidro a 37 ◦C em uma atmosfera de 5% de CO2. Após 4 h, o meio foi substituído por meio neurobasal suplementado com B27 e GlutaMAX.

4.8. Protocolos de cultura e tratamento de células NLT

Células neuronais que expressam GnRH de camundongo (NLT) foram mantidas em nosso laboratório. As células NLT foram cultivadas em DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA) contendo 10% de FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) e 1% de penicilina/estreptomicina (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, EUA) a 37 ◦C sob uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2.

Para determinar a neurotoxicidade da hemina, várias concentrações (0, 10, 30, 60, 90 e 120 µM) de hemina (Sigma-Aldrich) foram adicionadas às células NLT e tratadas durante 6 h. Destas concentrações, 60 µM (LD50) foram selecionados e utilizados nos experimentos subsequentes.

Os grupos controle foram tratados apenas com veículo (DMSO). A viabilidade celular e Live/Deadstaining foram realizadas 6 horas após o tratamento. Foram utilizados três poços para cada grupo. As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes.

4.9. Modelo in vitro de morte celular induzida por hemina

A morte celular foi induzida em neurônios corticais primários e células NLT por tratamento com 50µM e 60 µM de hemina, respectivamente, como descrito anteriormente [57,58]. Hemin foi dissolvido em NaOH 0,1 M para gerar uma solução estoque. Para os estudos de neuroproteção, as células foram tratadas com hemina 6h na presença dos agentes designados ou selenito de sódio dissolvido em água bidestilada.

4.10. Ensaio CCK-8

A viabilidade celular foi medida pelo ensaio CCK -8 (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japão), conforme descrito anteriormente (59). Em resumo, Neuronal foi semeado em placas de 96-poços a uma densidade de 6.000 células/poço em 100 µL de meio de cultura e alimentado na incubadora durante a noite.

As células foram tratadas com Hemin por 6 h. As células neuronais foram lavadas em PBS pré-aquecido (37 ◦C) e reagente CCK-8 (10 µL por 100 µL de meio) em cada poço.

Em seguida, incubamos as placas por 2 horas em atmosfera com 5% de CO2, e a absorbância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi representada como uma percentagem do controlo (células não tratadas).

4.11. Coloração viva/morta

A capacidade do ensaio CCK-8 de medir a viabilidade foi verificada pela coloração com calceína AM/PI em PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante.

A solução de coloração consistia em reagente calceína AM 2 µM e reagente PI 8 µM misturados em PBS. As amostras foram incubadas por 30 min e fotografadas usando uma lente objetiva 20x de um microscópio de fluorescência (Olympus FSX100, Tóquio, Japão). Um mínimo de três culturas celulares independentes foram utilizadas para o modelo in vitro de morte celular induzida por hemina.

4.12. Síntese e Administração de Peptídeos

O Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), TE1 rotulado FITC (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep EGF3 rotulado FITC (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2), Sinalizador rotulado Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), Sinalizador rotulado Pep E1 (NH2- -CONH2) e bandeira rotulada Peptídeos Pep E2 (NH 2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) com 99% de pureza foram adquiridos pela empresa Shanghai GL Biochem (Xangai, China) e pela empresa Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, China).

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