4.6. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs)

O conteúdo de TBARs foi utilizado como índice de lipoperoxidação. No tecido cerebral, tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) foi adicionado a uma concentração de 25 mg/mL (p/v) e a suspensão foi homogeneizada por sonicação por 10 s. A 30 µL do homogeneizado, foram adicionados 250 µL de ácido fosfórico a 1 por cento e 75 µL de ácido tiobarbitúrico (TBA) a 0,6 por cento. A mistura de reagentes foi incubada a 100 ◦C em banho-maria por 45 min, após o que foi resfriada em banho de gelo e então centrifugada a 3000 × g por 10 min a 4 ◦C. Um volume de 150 µL de sobrenadante foi retirado de cada amostra. A fluorescência foi medida usando um leitor de microplacas FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Alemanha) com o filtro de excitação ajustado em 485 nm (largura de banda de 5 nm) e o filtro de emissão ajustado em 530 nm (largura de banda de 5 nm). Uma curva de calibração foi preparada usando malondialdeído (MDA) como padrão. Os resultados foram expressos em pmol MDA/mg de proteína.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides Cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolonga o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhora a atividade de SOD no soro e retarda a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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4.7. Atividade Enzimática das Principais Enzimas Antioxidantes

Para a determinação da atividade enzimática no tecido cerebral, um tampão de lise contendo tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) e antiproteases (1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 g/mL de pepstatina e 1 g/mL de leupeptina) foi adicionado a um concentração de 50 mg/mL (p/v). Em seguida, a suspensão foi sonicada por 30 s em banho de gelo e o homogeneizado foi centrifugado a 10,000× g por 15 min a 4 ◦C. Os sobrenadantes foram coletados para a determinação da atividade enzimática das enzimas antioxidantes.

A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi medida seguindo a inibição da autoxidação do pirogalol a 420 nm [69]. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima necessária para inibir a taxa de auto-oxidação do pirogalol em 50%. A atividade enzimática da SOD foi expressa em unidades internacionais (UI)/mg de proteína. A atividade da catalase (CAT) foi medida em sobrenadantes tratados com Triton-X-100 (1 por cento, v/v) seguindo o desaparecimento do peróxido de hidrogênio (H2O2) a 240 nm [70], e a atividade enzimática foi relatada como substrato ( µmol H2O2) transformada/min · mg de proteína. A glutationa peroxidase total (GPx) foi determinada após a oxidação do NADPH a 340 nm na presença de excesso de GR, GSH e hidroperóxido de cumeno [71]. A atividade de GPx foi expressa como substrato (nmol NADPH) transformado/min mg de proteína. A atividade da glutationa redutase (GR) foi analisada após a oxidação do NADPH a 340 nm na presença de GSSG [72] e expressa como substrato (nmol NADPH) transformado/min · mg de proteína. GR e ambas as atividades de GPx foram corrigidas para reação espontânea na ausência de amostras biológicas (na ausência de enzima).

4.8. Teste de atividade BACE1

O protocolo de teste BACE1 envolve o uso de um substrato específico da secretase (peptídeo) que é conjugado a duas moléculas repórteres, a saber, EDANS e DABCYL, o que resulta na liberação de um sinal fluorescente [73,74]. A atividade de BACE1 foi medida nos lisados ​​do córtex e do hipocampo. A reação foi realizada a 37 ◦C por 1 h usando substrato 10 µM em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). As medições de intensidade de fluorescência foram feitas usando um leitor de microplacas FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, BadenWürttemberg, Alemanha) com o filtro de excitação ajustado em 360 nm (largura de banda 5 nm) e o filtro de emissão ajustado em 530 nm (largura de banda 5 nm). O nível de atividade enzimática da secretase é proporcional à reação fluorométrica e os dados são expressos como um aumento x vezes na fluorescência em relação aos controles de fundo (reações na ausência de substrato ou tecido). A atividade BACE1 foi normalizada com concentração de proteína. A atividade BACE1 dos camundongos, tratados com quercetina ou rutina, foi expressa como a porcentagem de atividade daquela dos camundongos controle TgAPP.

4.9. RT-PCR Expressão Gênica das Principais Enzimas Antioxidantes, APP, BACE1, ADAM10, Caspase-3 e Caspase-6 e Citocinas Inflflamatórias

4.9.1. Extração e purificação de RNA total

Analisamos as diferentes áreas do cérebro, ou seja, o córtex e o hipocampo, armazenados a −80 ◦C. A uma quantidade conhecida de tecido cerebral, o tampão de lise Triomol® foi adicionado na proporção de 1:10 (p/v). As amostras foram homogeneizadas por 30 s usando um motor Cordless (Pellet pilão, Sigma-Aldrich) e incubadas por 5 min a 25 ◦C para permitir a completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Em seguida, adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio para cada mL de tampão de lise Triomol® utilizado. Os tubos foram agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados a 25 ◦C por 3 minutos. Em seguida, foram centrifugados a 11,000× g por 15 min a 4 ◦C. Após a centrifugação, três fases foram obtidas, com o RNA na fase superior.

Para isolar o RNA, a fase superior foi transferida para outro tubo e precipitada pela adição de 0,5 mL de isopropanol. Após mistura completa de isopropanol e solução aquosa por inversão, a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 10 min para promover a precipitação e centrifugada a 12,000 × g por 10 min a 4 ◦C. Os sobrenadantes foram removidos e os pellets foram lavados com etanol 75 por cento e centrifugados a 7500 × g por 5 min a 4 ◦C. Os pellets foram secos à temperatura ambiente e dissolvidos em 50 µL de água tratada com DEPC. Para remover vestígios de DNA, 2,5 µL de DNase (livre de RNase) foram adicionados e incubados a 37 ◦C por 30 min. Finalmente, as amostras foram incubadas a 64 ◦C por 5 min para inativar a DNase.

Posteriormente, as concentrações de RNA foram medidas em espectrofotômetro UV-VIS (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Alemanha) em 260 nm e a pureza foi avaliada considerando a razão de absorbância em 260 e 280 nm (A260/A280).

A determinação da integridade e pureza do RNA foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1 por cento corado com GelRed e visualizado sob luz ultravioleta, onde, se o RNA estivesse íntegro, duas bandas superiores correspondendo ao RNA ribossômico (28S e 18S) e duas bandas inferiores correspondente ao RNA de transferência (tRNA) e RNA ribossômico 5S.

4.9.2. Síntese de DNA Complementar (cDNA)

O cDNA é muito mais estável do que o RNA e, portanto, permite um manuseio de amostras mais conveniente e seguro. O cDNA foi sintetizado a partir do mRNA por retrotranscrição utilizando o First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (Fermentas Life Sciences).

Para realizar a retrotranscrição para síntese de cDNA para 2 µg de RNA, foram adicionados 11 µL de água tratada com DEPC e 1 µL de primers 10X Random. Em seguida, a mistura foi incubada a 65 ◦C por 10 min para desnaturar o RNA. Após esse tempo, os tubos foram imediatamente levados a 4 ◦C por 5 min para evitar a renaturação do RNA. A mistura de reagentes para a síntese de cDNA é apresentada na Tabela S1 (dados complementares).

Oito µL da mistura de reação foram adicionados a cada amostra. Todo o volume foi levado ao fundo dos tubos e incubado a 42 ◦C por 60 min. Por fim, a reação foi interrompida pela inativação da transcriptase reversa por aquecimento a 70 ◦C por 10 min.

4.9.3. PCR em tempo real

A principal característica da PCR em tempo real é que a análise dos produtos ocorre durante o processo de amplificação pela determinação da fluorescência. Desta forma, os processos de amplificação e detecção ocorrem simultaneamente no mesmo tubo ou frasco sem a necessidade de qualquer ação posterior. Para PCR em tempo real, são usados ​​termocicladores, que podem amplificar e detectar a fluorescência simultaneamente. Utilizamos o termociclador em tempo real LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).

A Tabela S2 (dados suplementares) lista os reagentes necessários para PCR em tempo real, usando primers específicos de sequência e corante de ligação ao DNA (SYBR Green I, Roche Molecular Systems, Inc., Rotkreuz, Suíça) como um sistema de detecção.

Para o desenho dos primers para os diferentes marcadores quantificados, foi utilizado o programa de bioinformática Primer3Plus, para o qual foram retiradas as sequências de cDNA dos genes de interesse da base de dados de acesso aberto Medline. Os primers foram fornecidos pela Merck (Sigma-Aldrich). A temperatura de hibridização e a sequência dos diferentes primers utilizados são apresentadas na Tabela S3 (dados complementares).

As condições de reação para a amplificação dos genes de interesse são apresentadas na Tabela S4 (Dados Suplementares).

Por fim, as amostras foram submetidas a um programa de fusão: 95 ◦C por 15 s, 65 ◦C por 30 s e até 98 ◦C a uma taxa de 0,1 ◦C/s com registro contínuo de fluorescência.

Para a quantificação dos níveis de cDNA, foi utilizado o método de comparação do limiar do ciclo (Ct) [75], usando o GADPH como governanta. A amplificação do housekeeper foi feita em paralelo com o gene analisado. Os valores de Ct foram calculados usando o software 4.0 fornecido pela LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). O software permite distinguir entre fluorescência devido à amplificação da amostra e fundo. Curvas de fusão também foram registradas. A determinação da temperatura de fusão do fragmento amplificado permitiu a caracterização do produto amplificado. O tamanho das bandas foi verificado num gel de agarose a 1,5 por cento.

A variação da expressão do gene em estudo com o tratamento com quercetina ou rutina foi expressa em função do controle TgAPP (camundongos sem tratamento) e normalizando esta expressão com os níveis de GADPH. O Change Fold (2−∆∆Ct) representa o número de vezes que o gene de interesse é modificado sob o tratamento particular referente aos camundongos controle.

4.10. Análise estatística

Todos os testes foram realizados pelo menos em duplicata e em três experimentos diferentes. Os resultados obtidos são expressos como média ± erro padrão. A análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada uma vez que os dados foram testados e demonstraram que se ajustam a uma distribuição normal. Os testes post-hoc de comparações múltiplas de Newman-Keuls foram executados, examinando as diferenças médias entre os grupos. Valores de p < 0.05 foram considerados significativos. O software SigmaPlot 11.0 foi utilizado para as análises estatísticas.

5. Conclusões

Os hábitos alimentares e a suplementação podem afetar o estado redox celular. Com base nisso, objetivamos melhorar a homeostase redox celular em um modelo de camundongo com DA com uma dieta flavonoide contendo quercetina ou rutina para aliviar a patologia amilóide, considerando a interação entre o estado redox celular e as características amilóides dependentes de proteassoma na DA assintomática. Nossos conjuntos de dados são relevantes, pois os efeitos flavonoides exibidos no modelo de camundongo TgAPP são consistentes com os relatados anteriormente em nossos modelos in vitro e ex vivo.

Em conclusão, nossos achados mostram que iniciar um tratamento dietético no estágio assintomático ou no início de sintomas semelhantes ao DA pode restabelecer o status redox celular e o processamento fisiológico do APP por meio da regularização simultânea da expressão do APP e da atividade do BACE1.

Embora seja difícil extrapolar nossas descobertas para a condição humana, elas podem ter amplas implicações para a resposta humana a futuras terapêuticas. Dos dois flavonoides, a rutina, com efeitos globais mais proeminentes in vivo, parece ser a mais adequada para ser incluída na dieta diária como terapia adjuvante na DA, com base no aumento da homeostase redox intracelular do cérebro.

Materiais Suplementares:As seguintes informações de suporte podem ser baixadas no site. A referência [76] é citada nos materiais suplementares.

Contribuições do autor:PB-B. e SM-A. concebeu a ideia e o desenho experimental, ajudou nos experimentos, interpretou os resultados obtidos e escreveu o manuscrito. KLJ-A. conduziu os experimentos, realizou as análises de dados e interpretou os resultados obtidos. JB ajudou na análise dos dados e na revisão do manuscrito. Todos os dados foram gerados internamente e nenhuma fábrica de papel foi usada. Todos os autores concordam em ser responsáveis ​​por todos os aspectos do trabalho, garantindo integridade e precisão. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Pesquisa Médica «Mutua Madrileña» (quarta edição de Bolsas para Projetos de Pesquisa Médica), pelo Ministério da Educação e Ciência da Espanha (Ref. AGL2008-04892-C03-02) e pelo Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (Ref. CTQ2010-16170).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:Os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Complutense de Madri e estavam em total conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/sobre a proteção de animais usados ​​para fins científicos e a legislação espanhola sobre Bem-Estar Animal ( Real Decreto 53/2013, 1 de fevereiro de 2013).

Declaração de Consentimento Informado:Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:Os dados que apóiam as descobertas deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.

Agradecimentos:Agradecemos à Fundação Folch por uma bolsa de pré-doutorado para KLJA.

Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Abreviaturas

DA, doença de Alzheimer; ADAM-10, uma proteína 10 contendo domínio de desintegrina e metaloproteinase; APP, proteína precursora de amilóide; APPswe, mutação sueca da proteína precursora amilóide; A, amilóide-; BACE1, enzima 1 de clivagem de APP -site; CAT, Catalase; GPx, Glutationa peroxidase; GR, Glutationa redutase; GSH, Glutationa reduzida; GSSG, glutationa oxidada; SOD, superóxido dismutase.

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